Name: time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

这项工作得到了国家卫生研究院神经疾病和中风研究所内部研究计划的支持。项目编号 1ZIANS003137。

警告：该协议涉及IV类激光的使用，需要遵循适当的培训和安全准则。避免眼睛或皮肤暴露在直接或分散的激光下。 注：该协议包括六个步骤。工作流如图 1 A所示。
1. 使用翻转技术标记单个神经元
注：LNvs 的单标记是通过使用翻转酶介导随机标记在单个 LNv 中表示 mCD8：：GFP 来实?...

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	<li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis.">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li><li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation.">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. 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T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+optical+imaging+of+nervous+system+development.">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. 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在这里，我们描述了我们开发的一个协议，用于记录和量化树突状分支在果蝇幼虫大脑中单独标记的神经元的动态行为。值得注意的是，我们的实时成像协议包含特定的参数，使我们能够捕获幼虫LNv的整个树突状树突，并提供其树突分支动态状态的全局视图。然而，由于我们的定量方法严重依赖分支终端的注释，具有复杂树突结构和浓缩树的神经元不适合进行这种分析。
<p class="jove_conte...

树突是接收和处理感觉和突触输入的专用神经元隔间。树突状树丛的复杂和定型结构自发现以来一直在进行紧张的研究。已经建立了许多模型系统，包括Xenopus视性神经神经元、小鸡视网膜神经细胞和果蝇体内的树突化（da）神经元，以研究Drosophila系统的发育、重塑和可塑性。神经元树突1，2，3，4 。果蝇腹腔侧神经元（LNvs）是一组视觉投影神经元，最初被确定为在昼夜调节苍蝇行为5中的重要功能。研究还表明，幼虫LNvs作为幼虫光受体（PRs）6、7的直接后发贴靶点的作用。重要的是，培养不同光基培养的幼虫会强烈地影响LNvs的树突状树突状树突的大小，表明LNvs作为研究树突可塑性的新模型是适宜的。我们小组最近的工作进一步表明，LNv树突的大小和树突分支的动态行为都表现出经验依赖性的可塑性8，9。作为这项工作的一部分，我们开发了一种新的活成像和定量协议，以对从星幼虫的第2或第3代LNvs的树突动力学进行分析。
果蝇幼虫大脑的透明特性使其成为活成像的理想选择。然而，LNvs的树突状树干位于幼虫脑叶6中心密集内垂的幼虫光神经桩（LON）。为了捕捉完好的脑组织中细的树突分支和丝波多迪亚的图像，我们采用双光子显微镜，在活成像实验中增加光穿透深度，降低光毒性。利用此设置，我们在 LNvs 上成功进行了超过 30 分钟的实时成像实验，但没有观察到神经元的明显形态恶化。此外，使用翻转技术进行的基因操作使我们能够用标有GFP的膜标记单个LNvs，这对于监测单个分支11、12、13的运动也至关重要。.
为了以最佳的光学分辨率捕捉 LNv 树突状树突上所有分支的动态行为，我们对刚解剖的幼虫脑外移进行了延时 3D 成像，每帧 1 分钟，空间分辨率高，为 10 到 30 分钟。树突是高度动态的，在 10 分钟窗口内，很大一部分分支显示可观察到的变化。这导致在研究树突动力学方面面临的主要技术挑战之一，根据 4D 图像数据集量化分支行为。以前建立的方法存在各种限制，包括缺乏准确性和时间要求过高。因此，我们开发了一种半自动方法，结合图像后处理、分支终端的手动标记和图像注释软件的自动4D点跟踪。我们根据点的 3D 坐标计算分支终端在不同时间点的移动。然后导出和分析数据，以生成分支动力学的定量测量。该方法准确评估现有分支的扩展和回缩事件的持续时间和范围，以及新分支的形成，使我们能够监测大量神经元的树突动力学。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision II multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>79751-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>upright configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>for processing .csv files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td colspan="2">Scientific Volume Imaging</td>
			<td>for drift correction and deconvolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for 3D visualization and image annotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons

在早期发育阶段的神经元中广泛存在高莫性树突状纤维化。这些探索性动态分支对周围环境进行采样，并启动与潜在突触伙伴的接触。虽然树突状分支动力学和突触发生之间的联系已经确立，但发育和活动依赖过程如何调节树突状分支动力学还没有得到很好的理解。这部分是由于使用体内系统对这些精细结构进行实时成像和定量分析相关的技术困难。我们建立了一种使用果蝇幼虫幼虫腹侧神经元（LNvs）研究树突动力学的方法，这种神经元可以使用遗传方法单独标记，并可用于活成像。利用这个系统，我们开发了协议，通过延时实时成像捕获单个标记 LNv 的整个树突状树突动力学。然后，我们执行后处理，通过漂移校正和递减来提高图像质量，然后通过批注所有分支终端的空间位置来分析单分支级别的分支动力学。最后，我们开发了R脚本（补充文件）和特定参数，利用终端跟踪生成的坐标信息量化分支动力学。总体而言，该协议允许我们实现具有高时空分辨率的神经元树突状树突动力学的详细定量描述。我们开发的方法通常适用于体外和体内条件下标记稀疏的神经元。

使用上述实时成像协议，我们捕获高分辨率图像堆栈，以便进行后续分析和定量。补充视频 1显示了从具有代表性的单独标记的 LNv 中收集的最大强度投影 （MIP） 图像系列。 图 2B显示了图像序列的八帧的相应蒙太奇。在两个面板中，箭头标记回缩事件，箭头标记扩展事件。
接下...

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Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

在这里，我们描述了我们用于在果蝇幼虫脑活制备中成像高度多瓣树突状丝虫的方法，以及我们为量化延时三维成像数据集用于对树突进行定量评估的协议发展神经元的动态。

发展果蝇神经元的快速丹德林分体动力学的延时实时成像和定量

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

该协议提供了一种新方法，用于量化树突状的分支动力学，并使用实时时间推移成像和3D图像注释软件开发神经元。该技术对分支终端进行图像和跟踪，为测量树突颤变性飞多维的动态行为提供了一种快速、高效的方法。使用此方法的研究有助于深入了解发育和活动如何调节树突形态生成。我们的方法适用于体外和体内设置中贴稀疏标记的神经元。执行此过程时，请记住，必须仔细调整成像参数，以实现足够的时间和空间分辨率。为了从幼虫中采集大脑，在解剖显微镜下使用一对五号标准尖端解剖钳将幼虫标本放在位上，同时使用另一对来仔细解剖大脑，保存眼盘、脑叶和腹神经线。然后取出附着的肌肉，以尽量减少样品在成像过程中的任何运动。当所有大脑都收获后，使用真空润滑脂将一个方形腔室绘制到玻璃滑梯上，并在腔室中加入 20 微升外部盐水溶液。使用钳子将大脑转移到腔室，并在显微镜下调整大脑的位置，将后侧朝上。用玻璃盖滑盖住室，轻轻按压盖滑，以减少成像过程中样品漂移。要识别含有单独标记神经元的大脑外植，在解剖后 30 分钟内选择 40 倍水浸目标以及荧光光源。选择两个光子激光调谐到 920 纳米和非 Dscan 探测器，并设置成像参数，以每帧 512 x 512 像素和每 Z 堆栈 1 分钟收集图像 10 分钟。然后，调整光学和数字变焦，以实现足够的 X、Y、Z 分辨率，同时确保整个树突轴在一分钟内覆盖。这些设置将生成典型 X、Y、Z 分辨率为 0.11 x 0.11 x 0.25 微米的图像。对于漂移校正，请打开合适的漂移校正软件程序中感兴趣的文件，然后单击"编辑和编辑微观参数"。如果有两个光子选项，并遵循软件定义的工作流，则将显微镜类型设置为两个光子图像的"宽场"。对于去卷积，在去卷积软件中打开漂移校正图像，然后按照工作流操作。然后，将解构图像保存在文件类型中，该文件类型由能够分析 4D 数据和报告图像中已定义点的空间坐标的后续图像注释软件支持的文件类型中。对于图像注解，在图像注释软件中打开解构图像，并在 3D 的所有时间点检查和标记分支提示。图像注释软件将报告和存储标记分支提示的空间和时间坐标。将坐标信息导出为 CSV 文件，以便进行后续计算。在"斑点"模块中，单击"跳过自动创建"，手动编辑，然后选中"自动连接所选点"复选框。查看时间序列中的帧，然后选择用于注释的分支。按住 Shift 键，单击分支终端提示以添加点。然后，单击"统计"选项卡，选择"详细值"、"特定值"和"位置"。将显示记录的空间和时间坐标信息。单击"保存"以将数据导出为 CSV 文件。要计算 3D 中的分支提示位置，请打开 CSV 文件作为电子表格并选择"轨道 ID"列。单击"将最小排序为"最大"并接受展开"选择"。排序后，轨道 ID 将标识每个唯一的树突分支，并且来自同一分支的点共享相同的跟踪 ID。在电子表格中，添加"距离"列，并使用坐标计算每两个时间相邻点的距离。要测量单个体素级别的轻微运动，请重置小于 0.3 微米的所有距离值，以筛选任何未校正的漂移或不完美的图像注释。接下来，创建"置换"列，将值从"距离"列复制到"置换"列。手动为每个分支尖端分配扩展和缩回事件。如果是扩展，则保持正位移值不变。如果是缩回，则将相应的置换值更改为负值。然后，在新的 Event 列中，求和单个扩展和缩回事件的置换值。在这段视频中，可以观察到从具有代表性的单独标记的腹腹神经元收集的最大强度投影图像系列。单帧图像允许评估缩回和扩展事件。分支终端的半自动 4D 跟踪允许注释单独标记的腹体横向神经元的动态分支端子，如所证明的。计算每个时间点分支运动的方向和距离，可以比较不同发育阶段的单独标记的腹向神经元的树突分支动力学。最重要的步骤是在解剖和安装期间保持脑组织和树突形态的完整性。原始图像系列质量对于成功的跟踪和定量也至关重要。利用这项技术，我们获得了在开发果蝇中心神经元时对树突纤维素进行定量分析的能力，并探索与树突成熟和突触相关的分子机制。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

在Sf9细胞，并在海兔感觉神经元PKC移位实时成像

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

科研

神经科学

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

在发展中国家斑马鱼的前脑的神经祖细胞克隆相关的定时实时成像

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

神经调节和线粒体运输：在较长的时间里，海马神经元的实时成像

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

在完整的感觉器官前体细胞的活细胞成像果蝇蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

在培养的中枢神经系统的神经元树突棘形态分析

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

诱导培养的交感神经元的树突状增长

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

高分辨率实时成像发展中的神经上皮细胞的行为

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Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

急性片的成年小鼠前脑的神经细胞迁移的延时成像

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电机神经切断和时间推移成像胶质细胞行为在现场斑马鱼

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