Name: time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Dette arbejde er støttet af det Intramural forsknings program af National Institute of neurologiske lidelser og slagtilfælde, National Institutes of Health. Projektnummer 1ZIANS003137.

Forsigtig: Denne protokol omfatter brug af klasse IV lasere og vil kræve passende uddannelse og sikkerhed retningslinjer, der skal følges. Undgå eksponering af øjne eller hud for direkte eller spredt laserlys. Bemærk: Protokollen indeholder seks trin. Arbejdsprocessen vises i figur 1A.
1. mærkning individuelle neuroner ved hjælp af flip-out teknik
Bemærk: Den e...

<ol>
	<li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis.">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li><li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation.">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).</li><li>Cline, H., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+dendritic+arbor+development+and+plasticity+by+glutamatergic+synaptic+input:+a+review+of+the+synaptotrophic+hypothesis.">The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis.</a> The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).</li><li>Helfrich-Forster, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphology+of+the+clock-gene-expressing+lateral+neurons+of+Drosophila+melanogaster.">Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).</li><li>Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+larval+visual+system:+High-resolution+analysis+of+a+simple+visual+neuropil.">The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil.</a> Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).</li><li>Yuan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Structural+and+Functional+Plasticity+in+Drosophila+Larval+Visual+System.">Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System.</a> Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).</li><li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+targets+dynamic+filopodia+in+regulating+dendrite+maturation+and+synaptogenesis.">Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Lipophorin+Receptors+Supports+Neuronal+Adaptation+to+Chronic+Elevations+of+Activity.">Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity.</a> Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li><li>Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+generation+of+marked+clones+in+Drosophila.">Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila.</a> Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).</li><li>del Valle Rodr&#237;guez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9, 47 (2011).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+optical+imaging+of+nervous+system+development.">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+Automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloQuant+reveals+increased+filopodia+density+during+breast+cancer+progression.">FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Urban&#269;i&#269;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodyan:+An+open-source+pipeline+for+the+analysis+of+filopodia.">Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).</li></ol>

Her beskriver vi en protokol, vi har udviklet til at registrere og kvantificere den dynamiske opførsel af dendritiske grene i individuelt mærkede neuroner i Drosophila larve hjerner. Især vores Live imaging protokol indeholder specifikke parametre, der gør det muligt for os at fange hele dendritiske Arbor af en larve lnv og give et globalt billede af den dynamiske tilstand af dens dendrit grene. Men fordi vores kvantificeringsmetoder er stærkt afhængige af anmærkningen af afdelings terminaler, er neuroner...

Dendritter er specialiserede neuronal rum, der modtager og behandler sensorisk og synaptisk input. Den komplekse og stereotype struktur af dendritiske Dorne har været under intens efterforskning siden deres opdagelse. En række modelsystemer, herunder Xenopus Optic tectal neuroner, chick retinal ganglion celler og dendritiske arborization (da) neuroner i Drosophila systemet, er blevet etableret for at studere udvikling, remodeling og plasticitet af neuronal dendritter1,2,3,4. Drosophila ventrale laterale neuroner (lnvs) er en gruppe af visuelle projektion neuroner oprindeligt identificeret for deres vigtige funktioner i døgn regulering af flyve adfærd5. Undersøgelser afslørede også larve lnvs rolle som det direkte postsynaptiske mål for larve foto (PRS)6,7. Det er vigtigt, at dyrkning af larver i forskellige lysregimer i høj grad påvirker størrelsen af LNvs ' dendritiske Arbors, hvilket viser, at LNvs er egnet som en ny model til undersøgelse af dendritiske plasticitet7. Det seneste arbejde fra vores gruppe viser endvidere, at både størrelsen af lnv dendrit og den dynamiske opførsel af dendritiske grene viser erfarings afhængig plasticitet8,9. Som en del af dette arbejde, udviklede vi en ny live Imaging og kvantificering protokol til at udføre analyse på dendrit dynamik af LNvs fra 2nd eller 3Rd INSTAR larver.
Den gennemsigtige natur af Drosophila larve hjernen gør den ideel til levende billeddannelse. Men de dendritiske Dorne af lnvs er beliggende i den tætbefolkede larve optisk neuropil (Lon) i midten af larve hjernen lobe6. For at fange billeder af fine dendrit grene og filopodia i intakt hjernevæv, bruger vi to-foton mikroskopi, hvilket øger dybden af lys penetration og reducerer fototoksicitet under levende billeddannelse eksperimenter10. Ved hjælp af denne opsætning, vi med succes udført Live imaging eksperimenter på LNvs for over 30 min uden at observere indlysende morfologiske forringelse af neuron. Hertil kommer, at genetiske manipulationer ved hjælp af flip-out teknik gjorde det muligt for os at mærke de enkelte lnvs med en membran Tagged gfp, som også er afgørende for overvågning af bevægelser af de enkelte grene11,12,13 .
For at fange den dynamiske opførsel af alle grene på lnv dendritiske Arbor med optimal optisk opløsning, udførte vi time-lapse 3D imaging på frisk dissekeret larve Brain bruskeksplantater med en høj rumlig opløsning på 1 min pr frame for 10 til 30 min. udvikling af lnv dendritter er meget dynamiske, med en stor procentdel af grenene viser observerbare ændringer inden for 10 min vindue. Dette fører til en af de vigtigste tekniske udfordringer i at studere dendrit dynamik, kvantificere gren adfærd baseret på 4D-billed datasæt. Tidligere etablerede metoder har forskellige begrænsninger, herunder manglende nøjagtighed og overdreven tid krav. Derfor udviklede vi en halvautomatisk metode, der kombinerer billed efterbehandling, manuel markering af afdelings terminalerne og automatisk 4D-spot sporing ved hjælp af en billed anmærknings software. Vi beregner bevægelserne af afdelings terminaler på forskellige tidspunkter baseret på 3D-koordinaterne for pletterne. Dataene eksporteres og analyseres derefter for at producere kvantitative målinger af gren dynamikken. Denne metode præcist vurderer varigheden og omfanget af udvidelse og tilbagetrækning begivenheder af eksisterende filialer, samt dannelsen af nye grene, så vi kan overvåge dendrit dynamik i et stort antal neuroner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision II multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>79751-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>upright configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>for processing .csv files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td colspan="2">Scientific Volume Imaging</td>
			<td>for drift correction and deconvolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for 3D visualization and image annotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons

Meget motile sædceller dendritiske filopodia er bredt til stede i neuroner på tidlige udviklingsmæssige stadier. Disse sonderende dynamiske grene prøve det omgivende miljø og indlede kontakter med potentielle synaptiske partnere. Selv om forbindelsen mellem dendritiske gren dynamik og synaptogenesis er veletableret, hvordan udviklingsmæssige og aktivitets afhængige processer regulerer dendritiske gren dynamik er ikke godt forstået. Dette skyldes til dels de tekniske vanskeligheder i forbindelse med levende billeddannelse og kvantitative analyser af disse fine strukturer ved hjælp af et in vivo-system. Vi etablerede en metode til at studere dendrit dynamik ved hjælp af Drosophila larve ventrale laterale neuroner (lnvs), som kan være individuelt mærket ved hjælp af genetiske tilgange og er tilgængelige for levende billeddannelse. Drage fordel af dette system, vi udviklet protokoller til at fange gren dynamik i hele dendritiske Arbor af en enkelt mærket lnv gennem time-lapse Live imaging. Derefter udførte vi post-processing for at forbedre billedkvaliteten gennem drift korrektion og dekoncentrering, efterfulgt af at analysere gren dynamik på single-Branch niveau ved at kommentere rumlige positioner af alle gren terminaler. Endelig har vi udviklet R scripts (supplerende fil) og specifikke parametre for at kvantificere gren dynamik ved hjælp af koordinat oplysninger genereret af Terminal tracing. Kollektivt, denne protokol giver os mulighed for at opnå en detaljeret kvantitativ beskrivelse af gren dynamik af neuronal dendritiske Arbor med høj tidsmæssig og rumlig opløsning. De metoder, vi udviklede, gælder generelt for tyndt mærkede neuroner i både in vitro-og in vivo-tilstande.

Ved hjælp af den Live imaging-protokol, der er beskrevet ovenfor, optager vi billedstakke med høj opløsning til de efterfølgende analyser og kvantificering. Supplerende video 1 viser den beregnede maksimale INTENSITET (MIP) billedserie indsamlet fra en repræsentant individuelt mærket Lnv. figur 2B viser den tilsvarende montage af otte billeder af billedserien. I begge paneler markerer pilespidser tilbagetrækning af hæ...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Her beskriver vi den metode, vi anvendte til at afbilde meget motile sædceller dendritiske filopodia i en levende forberedelse af Drosophila larve hjernen, og den protokol, vi udviklede til at kvantificere tidsforskudt 3D imaging datasæt for kvantitative vurderinger af dendrit dynamik i udviklingen af neuroner.

Time-lapse Live Imaging og kvantificering af hurtig dendritiske gren dynamik i at udvikle Drosophila neuroner

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Denne protokol giver en ny tilgang til kvantificering filial dynamik af dendritiske arbor og udvikle neuroner ved hjælp af live time bortfalder imaging og en 3D-billede anmærkning software. Denne teknik billeder og spor grenen terminaler giver en hurtig og effektiv metode til måling af dendritiske filopodias dynamiske adfærd. Forskning ved hjælp af denne metode giver indsigt i at forstå, hvordan udvikling og aktivitet regulerer dendrite morfogenese.Vores metoder gælder for sparsomt mærkede neuroner i både in vitro- og in vivo-indstillinger. Når du udfører denne procedure, skal du huske, at billeddannelsesparametrene skal justeres omhyggeligt for at opnå en tilstrækkelig tidsmæssig og rumlig opløsning. At høste hjerner fra larve drosophila, under en dissekere mikroskop bruge et par nummer fem standard tip dissektion saftængning til at holde en larve prøve på plads, mens du bruger den anden til omhyggeligt dissekere ud i hjernen, bevare øjet diske, hjernelapper, og ventrale nerve ledning.Fjern derefter de påsatte muskler for at minimere enhver bevægelse af prøven under billeddannelse. Når alle hjerner er høstet, skal du bruge vakuum fedt til at trække et firkantet kammer på et glas dias og tilføje 20 mikroliter af eksterne saltvandsopløsning til kammeret. Brug sådanne hæceser til at overføre hjernen til kammeret og juster hjernernes positioner under mikroskopet med de dorsale sider, der vender opad.Dæk kammeret med en glasdækselseddel, og tryk forsigtigt på dækslet for at reducere prøvedrift under billeddannelsesproceduren. For at identificere hjerne explants indeholder individuelt mærkede neuroner, inden for 30 minutter efter dissektion vælge en 40X vand nedsænkning mål og en epifluorescens lyskilde. Vælg en to foton laser tunet til 920 nanometer og en ikke Dscan detektor og indstille billeddannelse parametre til at indsamle billederne på 512 med 512 pixels per ramme og et minut pr Z-stack i 10 minutter.Juster derefter den optiske og digitale zoom for at opnå en tilstrækkelig X- og Y-, Z-opløsning, samtidig med at dækningen af hele dendritiske arbor inden for et minut sikres. Indstillingerne genererer billeder med en typisk X- og Y-, Z-opløsning på 0,11 x 0,11 gange 0,25 mikrometer. For drift korrektion, åbne filen af interesse i en passende drift korrektion software program og klik redigere og redigere mikroskopiske parametre.Indstil mikroskoptypen til Wide Field for de to fotonbilleder, hvis der er en to fotonindstilling, og følg den arbejdsproces, der er defineret af softwaren. For deconvolution skal du åbne det glidekorrigerede billede i deconvolution-softwaren og følge arbejdsprocessen. Gem derefter det dekoncentralerede billede i en filtype, der understøttes af den efterfølgende billedanmærkningssoftware, der kan analysere 4D-data og rapportere de rumlige koordinater for definerede punkter i billedet.Ved billedanmærkning skal du åbne det dekonerede billede i billedanmærkningssoftwaren og undersøge og markere grenspidserne på alle tidspunktpunkter i 3D. Billedanmærkningssoftwaren rapporterer og gemmer de rumlige og tidsmæssige koordinater for de markerede grentips. Eksporter koordinatoplysningerne som en CSV-fil til efterfølgende beregninger.Klik på Spring automatisk oprettelse over i modulet Pletter, Rediger manuelt, og markér afkrydsningsfeltet Opret automatisk forbindelse til markeret sted. Gennemse rammerne i tidsserien, og vælg en gren til anmærkning. Hold Skift nede, skal du klikke på forgreningsterminalspidsen for at tilføje et sted.Klik derefter på fanen Statistik, vælg Detaljeret, Specifikke værdier og Placering. De registrerede rumlige og tidsmæssige koordinater vises. Klik på Gem for at eksportere dataene som en CSV-fil.Hvis du vil beregne placeringen af forgrenede tip i 3D, skal du åbne CSV-filen som et regneark og vælge kolonnen Spor id. Klik på Sortér mindste til største, og accepter Udvid markeringen. Efter sortering identificerer Track ID hver entydig dendritisk gren, og pletterne fra den samme gren deler det samme spor-id.Tidskolonnen gemmer oplysningerne fra forskellige tidsrammer.Tilføj en afstandskolonne i regnearket, og brug koordinaterne til at beregne afstanden for hver to tidsmæssigt tilstødende pletter. Hvis du vil måle mindre bevægelser på det enkelte voxelniveau, skal du nulstille alle afstandsværdier, der er mindre end 0,3 mikrometer, for at filtrere enhver ukorrigeret drifting eller ufuldkommen billedanmærkning. Opret derefter kolonnen Forskydning, og kopiér værdierne fra kolonnen Afstand til kolonnen Forskydning.Tildel forlængelses- og tilbagetrækningshændelserne manuelt for hver grenspids. Hvis det er en udvidelse, skal du lade den positive forskydningsværdi være uændret. Hvis det er en tilbagetrækning, skal du ændre den tilsvarende forskydningsværdi til en negativ værdi.I en ny hændelseskolonne skal du derefter opsummere forskydningsværdierne for individuelle udvidelses- og tilbagetrækningshændelser. I denne video, en maksimal intensitet projiceret billedserie indsamlet fra en repræsentativ individuelt mærket ventral lateral neuron kan observeres. Enkelt ramme billeder tillader evaluering af tilbagetrækning og udvidelse begivenheder.Semiautomatiseret 4D-sporing af grenterminalerne gør det muligt at anmærke de dynamiske grenterminaler af individuelt mærkede ventrale laterale neuroner som påvist. Beregning af retningen og afstanden af grenbevægelser på hvert tidspunkt giver mulighed for en sammenligning af dendritiske gren dynamik for individuelt mærket ventral laterale neuroner på forskellige udviklingsstadier. Det vigtigste skridt er at bevare integriteten af hjernevæv og dendrite morfooloy under dissektion og montering.Den rå billedseriekvalitet er også afgørende for vellykket sporing og kvantificering. Ved hjælp af denne teknik fik vi evnen til at udføre kvantitativ analyse af dendrite filopodia i udviklingen af drosophila centrale neuroner og til at udforske de molekylære maskiner i forbindelse med dendrite modning og synaptogenesis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Fremkalde dendritisvækst i dyrkede sympatiske neuroner

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Høj opløsning Live-Imaging af celle adfærd i udviklingslandene neuroepitel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse Imaging af neuroblast Migration i Akutte Skiver af den voksne Mouse forhjerne

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve transection og Time-lapse Imaging af gliacelle Behaviors Live zebrafisk

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Hurtig Mikro-iontophoresis af glutamat og GABA: et nyttigt redskab til Undersøge Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...