Name: time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het Nationaal Instituut voor neurologische aandoeningen en beroerte, National Institutes of Health. Project nummer 1ZIANS003137.

Let op: Dit protocol heeft betrekking op het gebruik van klasse IV-lasers en vereist goede opleidings-en veiligheidsrichtlijnen die moeten worden nageleefd. Vermijd blootstelling van ogen of huid aan direct of verstrooid laserlicht. Opmerking: Het protocol bevat zes stappen. De werkstroom wordt weergegeven in afbeelding 1A.
1. labelen van individuele neuronen met behulp van de flip-out techniek
<p class="jove...

<ol>
	<li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis.">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li><li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation.">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).</li><li>Cline, H., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+dendritic+arbor+development+and+plasticity+by+glutamatergic+synaptic+input:+a+review+of+the+synaptotrophic+hypothesis.">The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis.</a> The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).</li><li>Helfrich-Forster, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphology+of+the+clock-gene-expressing+lateral+neurons+of+Drosophila+melanogaster.">Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).</li><li>Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+larval+visual+system:+High-resolution+analysis+of+a+simple+visual+neuropil.">The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil.</a> Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).</li><li>Yuan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Structural+and+Functional+Plasticity+in+Drosophila+Larval+Visual+System.">Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System.</a> Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).</li><li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+targets+dynamic+filopodia+in+regulating+dendrite+maturation+and+synaptogenesis.">Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Lipophorin+Receptors+Supports+Neuronal+Adaptation+to+Chronic+Elevations+of+Activity.">Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity.</a> Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li><li>Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+generation+of+marked+clones+in+Drosophila.">Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila.</a> Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).</li><li>del Valle Rodr&#237;guez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9, 47 (2011).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+optical+imaging+of+nervous+system+development.">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+Automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloQuant+reveals+increased+filopodia+density+during+breast+cancer+progression.">FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Urban&#269;i&#269;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodyan:+An+open-source+pipeline+for+the+analysis+of+filopodia.">Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).</li></ol>

Hier beschrijven we een protocol dat we hebben ontwikkeld om het dynamische gedrag van dendritische takken in individueel gelabelde neuronen in Drosophila larvale hersenen op te nemen en te kwantificeren. Met name ons Live Imaging protocol bevat specifieke parameters die ons in staat stellen om het hele dendritische prieel van een larvale LNV vast te leggen en een globaal beeld te bieden van de dynamische toestand van haar dendriet takken. Omdat onze kwantificeringsmethoden echter sterk afhankelijk zijn van de a...

Dendrites zijn gespecialiseerde neuronale compartimenten die ontvangen en verwerken van sensorische en synaptische input. De complexe en stereotiepe structuur van dendritische Arbors is sinds hun ontdekking intensief onderzocht. Een aantal modelsystemen, waaronder Xenopus optische tectale neuronen, Chick retinale ganglioncellen en dendritische arborization (da) neuronen in het Drosophila systeem, zijn opgericht om de ontwikkeling, verbouwing en plasticiteit van neuronale dendrites1,2,3,4. Drosophila ventrale laterale neuronen (Lnv's) zijn een groep visuele projectie neuronen die aanvankelijk werden geïdentificeerd voor hun belangrijke functies in de circadiane regulatie van vlieggedrag5. Studies onthulde ook de rol van larvale lnvs als de directe postsynaptische doelstelling van de larvale fotoreceptoren (PRS)6,7. Belangrijk is dat het kweken van larven in verschillende licht regimes sterk van invloed is op de grootte van Lnv's ' dendritische Arbors, die de geschiktheid van LNvs aantonen als een nieuw model voor het bestuderen van dendritische plasticiteit7. Recent werk van onze groep wijst er verder op dat zowel de grootte van de LNV dendriet als het dynamische gedrag van de dendritische takken ervaring-afhankelijke plasticiteit weergeven8,9. Als onderdeel van dit werk ontwikkelden we een nieuw live beeld-en kwantificerings protocol om analyses uit te voeren over de dendriet-dynamiek van Lnv's van 2ND of 3RD instar larven.
De transparante aard van de hersenen Drosophila larvale maakt het ideaal voor Live beeldvorming. Echter, de dendritische Arbors van lnvs bevinden zich in de dichtbevolkte larvale optische neuropil (LON) in het midden van de larvale hersenen kwab6. Om beelden van fijne dendriet takken en filopodia in het intacte hersenweefsel vast te leggen, gebruiken we twee-photon microscopie, die de diepte van licht penetratie verhoogt en de fototoxiciteit vermindert tijdens Live Imaging experimenten10. Met behulp van deze instellingen hebben we met succes Live Imaging experimenten uitgevoerd op Lnv's voor meer dan 30 minuten zonder de duidelijke morfologische verslechtering van het neuron te observeren. Bovendien hebben genetische manipulaties met behulp van de flip-out techniek ons in staat om de individuele lnv's te labelen met een membraan gelabeld GFP, dat ook cruciaal is voor het bewaken van de bewegingen van individuele takken11,12,13 .
Om het dynamische gedrag van alle takken op de LNv dendritische Arbor met optimale optische resolutie vast te leggen, hebben we time-lapse 3D-beeldvorming uitgevoerd op vers ontleed larvale hersen explanten met een hoge ruimtelijke resolutie op 1 min per frame voor 10 tot 30 min. ontwikkelen van LNv dendrites zijn zeer dynamisch, met een groot percentage van de takken weergegeven waarneembare veranderingen binnen de 10 min venster. Dit leidt tot een van de belangrijkste technische uitdagingen bij het bestuderen van dendriet-dynamiek, het kwantificeren van vertakkings gedrag op basis van de 4D-beeldgegevens sets. Eerder vastgestelde methoden hebben verschillende beperkingen, waaronder gebrek aan nauwkeurigheid en buitensporige tijd vereiste. Daarom hebben we een semi-automatische methode ontwikkeld die de nabewerking van afbeeldingen, handmatige markering van de aftakkingen van de filialen en automatische 4D-spot tracering met behulp van een afbeelding aantekening software combineert. We berekenen de bewegingen van de filialen op verschillende tijdstippen op basis van de 3D-coördinaten van de spots. De gegevens worden vervolgens geëxporteerd en geanalyseerd om kwantitatieve metingen van de vertakkings dynamiek te produceren. Deze methode beoordeelt nauwkeurig de duur en omvang van de uitbreiding en terugtrekking gebeurtenissen van bestaande takken, evenals de vorming van nieuwe takken, waardoor we de dendriet dynamiek in een groot aantal neuronen bewaken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision II multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>79751-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>upright configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>for processing .csv files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td colspan="2">Scientific Volume Imaging</td>
			<td>for drift correction and deconvolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for 3D visualization and image annotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons

Zeer beweeglijke dendritische filopodia zijn op grote schaal aanwezig in neuronen in vroege ontwikkelingsstadia. Deze verkennende dynamische takken proeven de omgeving en initiëren contacten met potentiële synaptische partners. Hoewel de verbinding tussen dendritische tak dynamiek en synaptogenese is goed vastgesteld, hoe ontwikkelings-en activiteitsafhankelijke processen reguleren dendritische tak dynamiek is niet goed begrepen. Dit is deels te wijten aan de technische moeilijkheden in verband met de Live beeldvorming en kwantitatieve analyses van deze fijne constructies met behulp van een in vivo systeem. We hebben een methode opgezet om dendriet-dynamiek te bestuderen met behulp van Drosophila larvale ventrale laterale neuronen (Lnv's), die individueel kunnen worden geëtiketteerd met behulp van genetische benaderingen en toegankelijk zijn voor Live beeldvorming. Door gebruik te maken van dit systeem hebben we protocollen ontwikkeld om de tak dynamiek van de hele dendritische Arbor van één gelabeld LNv te veroveren door middel van time-lapse Live beeldvorming. Vervolgens hebben we nabewerking uitgevoerd om de beeldkwaliteit te verbeteren door middel van drift correctie en deconvolutie, gevolgd door het analyseren van de vertakkings dynamiek op het single-Branch niveau door de ruimtelijke posities van alle filiaal terminals te annoveren. Ten slotte ontwikkelden we R-scripts (aanvullend bestand) en specifieke parameters om de vertakkings dynamiek te kwantificeren met behulp van de coördinaten informatie die wordt gegenereerd door de Terminal tracering. Collectief, dit protocol stelt ons in staat om een gedetailleerde kwantitatieve beschrijving van de tak dynamiek van de neuronale dendritische Arbor met hoge temporele en ruimtelijke resolutie te bereiken. De methoden die we ontwikkelden zijn over het algemeen toepasbaar op dungelabelde neuronen in zowel in vitro als in vivo condities.

Met behulp van het hierboven beschreven Live Imaging protocol, leggen we een hoge resolutie beeld stapels vast voor de daaropvolgende analyses en kwantificering. Aanvullende video 1 toont de reeks met maximale intensiteit geprojecteerd (MIP) die is verzameld van een vertegenwoordiger afzonderlijk gelabeld LNV. afbeelding 2B toont de corresponderende montage van acht frames van de beeld reeks. In beide deelvensters markeren pi...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Hier beschrijven we de methode die we hebben gebruikt voorbeeld zeer beweeglijke dendritische filopodia in een live voorbereiding van de hersenen Drosophila larvale, en het protocol dat we hebben ontwikkeld om time-lapse 3D-beeldverwerkings sets voor kwantitatieve beoordelingen van dendriet te kwantificeren dynamiek in het ontwikkelen van neuronen.

Time-lapse Live beeldvorming en kwantificering van snelle dendritische tak dynamiek bij de ontwikkeling van Drosophila neuronen

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Dit protocol biedt een nieuwe aanpak voor het kwantificeren van de tak dynamiek van de dendritische prieel en het ontwikkelen van neuronen met behulp van live time lapse imaging en een 3D-beeld annotatie software. Deze techniek beeldt en volgt de takterminals die een snelle en efficiënte methode bieden voor het meten van het dynamische gedrag van dendritische filopodia. Onderzoek met behulp van deze methode geeft inzicht in het begrijpen van hoe ontwikkeling en activiteit dendriet morfogenese reguleren.Onze methoden zijn van toepassing op schaars gelabelde neuronen in zowel in vitro als in vivo settings. Houd er bij het uitvoeren van deze procedure rekening mee dat de beeldparameters zorgvuldig moeten worden aangepast om een voldoende temporele en ruimtelijke resolutie te bereiken. Om hersenen te oogsten van larve drosophila, onder een ontleden microscoop gebruik maken van een paar van nummer vijf standaard tip dissectie forcept om een larvenexemplaar op zijn plaats te houden, terwijl het gebruik van de andere om zorgvuldig ontleden van de hersenen, het behoud van de oogschijven, hersenklobben, en ventrale zenuwstreng.Verwijder vervolgens de bijgevoegde spieren om elke beweging van het monster tijdens de beeldvorming te minimaliseren. Wanneer alle hersenen zijn geoogst, gebruik vacuüm vet om een vierkante kamer te trekken op een glazen glijbaan en voeg 20 microliters van externe zoutoplossing aan de kamer. Gebruik de tangen om de hersenen over te brengen naar de kamer en de posities van de hersenen onder de microscoop aan te passen met de rugkanten naar boven gericht.Bedek de kamer met een glazen afdekbrief en druk zachtjes op de afdekslip om monsterdring tijdens de beeldvormingsprocedure te verminderen. Om hersenexplants te identificeren die individueel gelabelde neuronen bevatten, selecteert u binnen 30 minuten na de dissectie een 40X wateronderdompelingsdoelstelling en een epifluorescentielichtbron. Selecteer een twee fotonlaser van 920 nanometer en een niet-Dscan-detector en stel de beeldvormingsparameters in om de beelden te verzamelen op 512 bij 512 pixels per frame en één minuut per Z-stack gedurende 10 minuten.Pas vervolgens de optische en digitale zoom aan om een voldoende X- Y- en Z-resolutie te bereiken en tegelijkertijd de dekking van de hele dendritische prieel binnen een minuut te garanderen. De instellingen genereren afbeeldingen met een typische X, Y, Z-resolutie van 0,11 bij 0,11 bij 0,25 micrometer. Open voor driftcorrectie het interessebestand in een geschikt driftcorrectiesoftwareprogramma en klik op Microscopische parameters bewerken en bewerken.Stel het microscooptype in op Breed veld voor de twee fotonafbeeldingen als er een optie voor twee foton is en volg de workflow die door de software is gedefinieerd. Open voor deconvolution het afgekoppelde beeld in de deconvolution-software en volg de workflow. Sla vervolgens de gedeconvolveerde afbeelding op in een bestandstype dat wordt ondersteund door de daaropvolgende beeldannotatiesoftware die 4D-gegevens kan analyseren en de ruimtelijke coördinaten van gedefinieerde vlekken in de afbeelding kan rapporteren.Open voor beeldannotatie de gedeconvolveerde afbeelding in de beeldannotatiesoftware en onderzoekt en markeer de branchtips op alle tijdstippen in 3D. De beeldannotatiesoftware rapporteert en slaat de ruimtelijke en temporele coördinaten van de gemarkeerde vertakkingstips op. Exporteer de coördinatengegevens als een CSV-bestand voor latere berekeningen.Klik in de module Vlekken op Automatisch maken overslaan, Handmatig bewerken en schakel het selectievakje Automatisch verbinden met Geselecteerde steunpoten in. Controleer de frames in de tijdreeks en selecteer een vertakking voor annotatie. Houd shift-toets, klik op de tip van de filiaalterminal om een plek toe te voegen.Klik vervolgens op het tabblad Statistieken en selecteer Gedetailleerde, specifieke waarden en positie. De opgenomen ruimtelijke en temporele coördinateninformatie wordt weergegeven. Klik op Opslaan om de gegevens als CSV-bestand te exporteren.Als u de plaatsing van de vertakkingstip in 3D wilt berekenen, opent u het CSV-bestand als spreadsheet en selecteert u de kolom Track ID. Klik op Kleinste sorteren naar grootste en accepteer De selectie uitbreiden. Na het sorteren identificeert Track ID elke unieke dendritische tak en delen de spots van dezelfde branch dezelfde Track ID.The Time-kolom slaat de informatie op uit verschillende tijdsframes.Voeg in de spreadsheet een kolom Afstand toe en gebruik de coördinaten om de afstand van elke twee tijdelijk aangrenzende plekken te berekenen. Als u kleine bewegingen op het niveau van één voxel wilt meten, stelt u alle afstandswaarden van minder dan 0,3 micrometer opnieuw in om ongecorrigeerde drifting of onvolmaakte beeldannotatie te filteren. Maak vervolgens een kolom Verplaatsing en kopieer de waarden van de kolom Afstand naar de kolom Verplaatsing.Wijs handmatig de extensie- en intrekgebeurtenissen voor elke vertakkingspunt toe. Als het een uitbreiding is, laat u de positieve verplaatsingswaarde ongewijzigd. Als het een intrekking is, wijzigt u de overeenkomstige verplaatsingswaarde in een negatieve waarde.Som vervolgens in een nieuwe kolom Gebeurtenis de verplaatsingswaarden op voor afzonderlijke extensie- en intrekgebeurtenissen. In deze video kan een maximale intensiteit geprojecteerde beeldreeks verzameld van een vertegenwoordiger individueel gelabeld ventrale laterale neuron worden waargenomen. Afbeeldingen met één frame maken evaluatie van de gebeurtenissen voor intrekking en uitbreiding mogelijk.Semigeautomateerde 4D tracking van de branch terminals maakt annotatie van de dynamische tak terminals van individueel gelabelde ventrale laterale neuronen zoals aangetoond. Berekening van de richting en afstand van de tak bewegingen op elk tijdstip punt maakt een vergelijking van de dendritische tak dynamiek voor individueel gelabelde ventrale laterale neuronen in verschillende ontwikkelingsstadia. De belangrijkste stap is het behoud van de integriteit van het hersenweefsel en dendriet morfoloy tijdens dissectie en montage.De ruwe beeldreeks kwaliteit is ook van cruciaal belang voor succesvolle tracking en kwantificering. Met behulp van deze techniek kregen we de mogelijkheid om kwantitatieve analyse van dendriet filopodia uit te voeren bij de ontwikkeling van drosophila centrale neuronen en om de moleculaire machines met betrekking tot dendriten rijping en synaptogenese te verkennen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-beeldvorming van PKC Translocatie in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulatie en Mitochondriale Transport: Live Imaging in hippocampale neuronen dan lange duur

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Het induceren van dendritische groei in gekweekte sympathische neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse imaging van neuroblast migratie in Acute Schijfjes van de volwassen muis voorhersenen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...