Name: time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Ce travail est soutenu par le Programme de recherche intra-muros de l'Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux, National Institutes of Health. Numéro de projet 1ZIANS003137.

MISE EN GARDE: Ce protocole implique l'utilisation de lasers de classe IV et nécessitera une formation appropriée et des directives de sécurité à suivre. Évitez l'exposition des yeux ou de la peau à la lumière laser directe ou dispersée. REMARQUE: Le protocole comprend six étapes. Le flux de travail est indiqué dans la figure 1A.
1. Étiquetage des neurones individuels à l'aide de la technique Flip-ou...

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	<li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis.">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li><li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation.">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. 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T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+optical+imaging+of+nervous+system+development.">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+Automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloQuant+reveals+increased+filopodia+density+during+breast+cancer+progression.">FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Urban&#269;i&#269;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodyan:+An+open-source+pipeline+for+the+analysis+of+filopodia.">Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).</li></ol>

Ici, nous décrivons un protocole que nous avons développé pour enregistrer et quantifier le comportement dynamique des branches dendritiques dans les neurones individuellement étiquetés dans les cerveaux larvaires de Drosophila. Notamment, notre protocole d'imagerie en direct contient des paramètres spécifiques qui nous permettent de capturer l'ensemble de l'arborescence dendritique d'un LNv larvaire et de fournir une vue globale de l'état dynamique de ses branches dendrite. Cependant, parce que nos mét...

Les dendrites sont des compartiments neuronaux spécialisés qui reçoivent et traitent l'entrée sensorielle et synaptique. La structure complexe et stéréotypée des arborescences dendritiques fait l'objet d'une intense enquête depuis leur découverte. Un certain nombre de systèmes modèles, y compris les neurones tecattiques optiques Xenopus, les cellules ganglionnaires rétiniennes de poussins et les neurones d'arborescence dendritique (da) dans le système Drosophila, ont été mis en place pour étudier le développement, le remodelage et la plasticité des dendrites neuronales1,2,3,4. Les neurones latéraux ventral de Drosophila (LNvs) sont un groupe de neurones de projection visuelle initialement identifiés pour leurs fonctions importantes dans la régulation circadienne des comportements de mouche5. Des études ont également révélé le rôle des LNv larvaires comme cible postsynaptique directe des photorécepteurs larvaires (PR)6,7. Il est important de noter que la culture de larves en développement dans différents régimes de lumière affecte fortement la taille des arborescences dendritiques de LNvs, démontrant l'adéquation des LNvs en tant que nouveau modèle pour l'étude de la plasticité dendritique7. Les travaux récents de notre groupe indiquent en outre que la taille de la dendrite LNv et le comportement dynamique des branches dendritiques affichent l'expérience-dépendance plasticité8,9. Dans le cadre de ces travaux, nous avons mis au point un nouveau protocole d'imagerie et de quantification en direct pour effectuer des analyses sur la dynamique dendrite des LNv à partir de 2nd ou 3rd instar larves.
La nature transparente du cerveau larvaire Drosophila le rend idéal pour l'imagerie en direct. Cependant, les arborescences dendritiques des LNv sont situées dans le neuropil optique larvaire densément innervé (LON) au centre du lobe du cerveau larvaire6. Pour capturer des images de branches fines de dendrite et de filopodia dans le tissu cérébral intact, nous utilisons la microscopie à deux photons, qui augmente la profondeur de pénétration de la lumière et réduit la phototoxicité lors d'expériences d'imagerie en direct10. En utilisant cette configuration, nous avons effectué avec succès des expériences d'imagerie en direct sur les LNv pendant plus de 30 min sans observer la détérioration morphologique évidente du neurone. En outre, les manipulations génétiques utilisant la technique Flip-out nous ont permis d'étiqueter les LNvs individuels avec une membrane marquée GFP, qui est également critique pour surveiller les mouvements des branches individuelles11,12,13 .
Pour capturer le comportement dynamique de toutes les branches de l'arborescence dendritique LNv avec une résolution optique optimale, nous avons effectué l'imagerie 3D time-lapse sur des explants de cerveau larvaire fraîchement disséqués avec une haute résolution spatiale à 1 min par cadre pendant 10 à 30 min. Développer LNvv. Les dendrites sont très dynamiques, avec un grand pourcentage des branches affichant des changements observables dans la fenêtre de 10 min. Cela conduit à l'un des principaux défis techniques dans l'étude de la dynamique des dendrites, quantifiant le comportement des branches à partir des ensembles de données d'image 4D. Les méthodes précédemment établies ont diverses limitations, y compris le manque d'exactitude et l'exigence excessive de temps. Par conséquent, nous avons développé une méthode semi-automatique qui combine le post-traitement d'image, le marquage manuel des terminaux de branche, et le traçage 4D automatique de tache utilisant un logiciel d'annotation d'image. Nous calculons les mouvements des terminaux de branche à différents points de temps en fonction des coordonnées 3D des taches. Les données sont ensuite exportées et analysées pour produire des mesures quantitatives de la dynamique des branches. Cette méthode évalue avec précision la durée et l'étendue des événements d'extension et de rétraction des branches existantes, ainsi que la formation de nouvelles branches, ce qui nous permet de surveiller la dynamique des dendrites dans un grand nombre de neurones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision II multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>79751-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>upright configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>for processing .csv files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td colspan="2">Scientific Volume Imaging</td>
			<td>for drift correction and deconvolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for 3D visualization and image annotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons

La filodée dendritique très motile est largement présente dans les neurones aux premiers stades de développement. Ces branches dynamiques exploratoires échantillonnent l'environnement environnant et amorceront des contacts avec des partenaires synaptiques potentiels. Bien que le lien entre la dynamique des branches dendritiques et la synaptogénèse soit bien établi, la façon dont les processus développementaux et dépendants de l'activité régulent la dynamique des branches dendritiques n'est pas bien comprise. Cela est dû en partie aux difficultés techniques associées à l'imagerie en direct et aux analyses quantitatives de ces structures fines à l'aide d'un système in vivo. Nous avons établi une méthode pour étudier la dynamique des dendrites à l'aide des neurones larvaires ventrals de Drosophila (LNvs), qui peuvent être étiquetés individuellement à l'aide d'approches génétiques et sont accessibles pour l'imagerie en direct. Profitant de ce système, nous avons développé des protocoles pour capturer la dynamique des branches de toute l'arborescence dendritique d'un seul LNv étiqueté grâce à l'imagerie en direct en accéléré. Nous avons ensuite effectué le post-traitement pour améliorer la qualité de l'image par la correction de la dérive et la déconvolution, puis par l'analyse de la dynamique des branches au niveau d'une seule branche en annoté les positions spatiales de tous les terminaux de branche. Enfin, nous avons développé des scripts R(Fichier supplémentaire) et des paramètres spécifiques pour quantifier la dynamique des branches à l'aide des informations de coordonnées générées par le suivi terminal. Collectivement, ce protocole nous permet d'obtenir une description quantitative détaillée de la dynamique des branches de l'arborescence neuronale dendritique avec une haute résolution temporelle et spatiale. Les méthodes que nous avons développées sont généralement applicables aux neurones peu étiquetés dans des conditions in vitro et in vivo.

À l'aide du protocole d'imagerie en direct décrit ci-dessus, nous capturons des piles d'images haute résolution pour les analyses et la quantification ultérieures. La vidéo supplémentaire 1 montre la série d'images projetées d'intensité maximale (MIP) recueillies auprès d'un représentant étiqueté individuellement LNv. Figure 2B montre le montage correspondant de huit images de la série d'images. Dans les deux pa...

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Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Ici, nous décrivons la méthode que nous avons employée pour imager la filodose dendritique fortement motivoir dans une préparation en direct du cerveau larvaire de Drosophila, et le protocole que nous avons développé pour quantifier des ensembles de données d'imagerie 3D de time-lapse pour des évaluations quantitatives du dendrite dynamique dans le développement des neurones.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Ce protocole fournit une nouvelle approche pour quantifier la dynamique des branches de la tonnelle dendritique et développer des neurones à l’aide de l’imagerie en temps réel et d’un logiciel d’annotation d’image 3D. Cette technique images et suit les terminaux de branche fournissant une méthode rapide et efficace pour mesurer les comportements dynamiques de filopodia dendritique. La recherche utilisant cette méthode donne un aperçu de la façon dont le développement et l’activité régulent la morphogenèse dendrite.Nos méthodes s’appliquent aux neurones peu étiquetés dans les milieux in vitro et in vivo. Lors de l’exécution de cette procédure, n’oubliez pas que les paramètres d’imagerie doivent être soigneusement ajustés pour atteindre une résolution temporelle et spatiale suffisante. Pour récolter les cerveaux de la drosophile larvaire, sous un microscope disséquant, utilisez une paire de forceps standard de dissection de pointe numéro cinq pour maintenir un spécimen larvaire en place tout en utilisant l’autre pour disséquer soigneusement le cerveau, en préservant les disques oculaires, les lobes cérébraux et le cordon nerveux ventral.Retirez ensuite les muscles attachés pour minimiser tout mouvement de l’échantillon pendant l’imagerie. Lorsque tous les cerveaux ont été récoltés, utilisez de la graisse sous vide pour dessiner une chambre carrée sur une glissière en verre et ajouter 20 microlitres de solution saline externe à la chambre. Utilisez les forceps pour transférer le cerveau à la chambre et ajuster les positions du cerveau sous le microscope avec les côtés dorsal face vers le haut.Couvrez la chambre d’un slip de couverture en verre et appuyez doucement sur le bordereau de couverture pour réduire la dérive de l’échantillon pendant la procédure d’imagerie. Pour identifier les explantations cérébrales contenant des neurones étiquetés individuellement, dans les 30 minutes qui ont pris la dissection, choisissez un objectif d’immersion d’eau de 40 X et une source de lumière épifluorescence. Sélectionnez un laser à deux photons réglé à 920 nanomètres et un détecteur non Dscan et définissez les paramètres d’imagerie pour recueillir les images à 512 par 512 pixels par image et une minute par Z-stack pendant 10 minutes.Ensuite, ajustez le zoom optique et numérique pour obtenir une résolution X, Y, Z suffisante tout en assurant la couverture de toute la tonnelle dendritique en moins d’une minute. Les paramètres généreront des images avec une résolution typique X, Y, Z de 0,11 par 0,11 par 0,25 micromètre. Pour la correction de la dérive, ouvrez le fichier d’intérêt dans un logiciel de correction de dérive approprié et cliquez sur Modifier et modifier les paramètres microscopiques.Réglez le type de microscope sur Wide Field pour les deux images photons s’il existe une option de deux photons et suivez le flux de travail défini par le logiciel. Pour la déconvolution, ouvrez l’image corrigée de dérive dans le logiciel de déconvolution et suivez le flux de travail. Ensuite, enregistrez l’image décontvolvée dans un type de fichier qui est pris en charge par le logiciel d’annotation d’image ultérieur capable d’analyser les données 4D et de signaler les coordonnées spatiales des taches définies dans l’image.Pour l’annotation de l’image, ouvrez l’image décontvolvée dans le logiciel d’annotation de l’image et examinez et marquez les conseils de branche à tout moment en 3D. Le logiciel d’annotation d’image signalera et stockera les coordonnées spatiales et temporelles des pointes marquées de branche. Exportez les informations de coordonnées en tant que fichier CSV pour des calculs ultérieurs.Dans le module Spots, cliquez sur Sauter la création automatique, modifier manuellement, et coché l’autoconnect à la case à cochée Spot sélectionné. Passez en revue les images de la série de temps et sélectionnez une branche pour l’annotation. En tenant la touche Shift, cliquez sur la pointe du terminal de branche pour ajouter une place.Ensuite, cliquez sur l’onglet Statistiques, sélectionnez Valeurs détaillées et spécifiques et Position. Les informations de coordonnées spatiales et temporelles enregistrées seront affichées. Cliquez sur Enregistrer pour exporter les données en tant que fichier CSV.Pour calculer le placement de pointe de branche en 3D, ouvrez le fichier CSV comme feuille de calcul et sélectionnez la colonne D’identification de la voie. Cliquez sur Trier le plus petit pour le plus grand et accepter d’élargir la sélection. Après le tri, Track ID identifiera chaque branche dendritique unique et les taches de la même branche partagent la même colonne Track ID.The Time stockera les informations à partir de différents délais.Dans la feuille de calcul, ajoutez une colonne Distance et utilisez les coordonnées pour calculer la distance de chaque deux endroits adjacents temporellement. Pour mesurer les mouvements mineurs au niveau voxel unique, réinitialisez toutes les valeurs de distance inférieures à 0,3 micromètre pour filtrer toute annotation d’image non corrigée à la dérive ou imparfaite. Ensuite, créez une colonne Déplacement et copiez les valeurs de la colonne Distance à la colonne Déplacement.Attribuez manuellement les événements d’extension et de rétractation pour chaque conseil de branche. S’il s’agit d’une extension, laissez la valeur de déplacement positive inchangée. S’il s’agit d’une rétractation, modifiez la valeur de déplacement correspondante en valeur négative.Ensuite, dans une nouvelle colonne Événement, résumez les valeurs de déplacement pour les événements individuels d’extension et de rétractation. Dans cette vidéo, une série d’images projetées d’intensité maximale recueillies auprès d’un représentant étiqueté individuellement neurone latéral ventral peut être observée. Les images à cadre unique permettent d’évaluer les événements de rétractation et d’extension.Le suivi 4D semi-automatique des terminaux de branche permet l’annotation des terminaux dynamiques de branche des neurones latéraux ventral individuellement étiquetés comme démontré. Le calcul de la direction et de la distance des mouvements de branche à chaque point de temps permet une comparaison de la dynamique de branche dendritique pour les neurones latéraux ventraux étiquetés individuellement à différents stades de développement. L’étape la plus importante est de préserver l’intégrité du tissu cérébral et de la morpholoy dendrite pendant la dissection et le montage.La qualité des séries d’images brutes est également essentielle au succès du suivi et de la quantification. En utilisant cette technique, nous avons acquis la capacité d’effectuer l’analyse quantitative de la filopodie dendrite dans le développement des neurones centraux de drosophile et d’explorer les machines moléculaires relatives à la maturation et à la synaptogenèse des dendrites.

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