Name: time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית מחקר הפנים של המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ, המכונים הלאומיים לבריאות. . פרויקט מספר 1ZIANS003137

זהירות: פרוטוקול זה כולל את השימוש של מחלקה IV לייזרים ידרוש הכשרה נאותה והנחיות בטיחות לעקוב. להימנע עין או חשיפה לעור לאור לייזר ישיר או מפוזר. הערה: הפרוטוקול כולל שישה שלבים. זרימת העבודה מוצגת באיור 1א.
1. תיוג נוירונים בודדים ב?...

<ol>
	<li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis.">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li><li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation.">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).</li><li>Cline, H., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+dendritic+arbor+development+and+plasticity+by+glutamatergic+synaptic+input:+a+review+of+the+synaptotrophic+hypothesis.">The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis.</a> The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).</li><li>Helfrich-Forster, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphology+of+the+clock-gene-expressing+lateral+neurons+of+Drosophila+melanogaster.">Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).</li><li>Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+larval+visual+system:+High-resolution+analysis+of+a+simple+visual+neuropil.">The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil.</a> Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).</li><li>Yuan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Structural+and+Functional+Plasticity+in+Drosophila+Larval+Visual+System.">Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System.</a> Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).</li><li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+targets+dynamic+filopodia+in+regulating+dendrite+maturation+and+synaptogenesis.">Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Lipophorin+Receptors+Supports+Neuronal+Adaptation+to+Chronic+Elevations+of+Activity.">Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity.</a> Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li><li>Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+generation+of+marked+clones+in+Drosophila.">Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila.</a> Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).</li><li>del Valle Rodr&#237;guez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9, 47 (2011).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+optical+imaging+of+nervous+system+development.">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+Automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloQuant+reveals+increased+filopodia+density+during+breast+cancer+progression.">FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Urban&#269;i&#269;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodyan:+An+open-source+pipeline+for+the+analysis+of+filopodia.">Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).</li></ol>

כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפיתחנו כדי להקליט ולכמת את ההתנהגות הדינמית של ענפים דנדריטים באופן אינדיבידואלי התווית נוירונים במוח זחל דרוסופילה . בעיקר, פרוטוקול ההדמיה החי שלנו מכיל פרמטרים ספציפיים שמאפשרים לנו ללכוד את כל הארבור הדנדריטי של זחל החוצה ולספק תצוגה גלובלית של המצב הד?...

הדנדריטים הם תאי עצבים מיוחדים המקבלים ומעבדים את הקלט החושי והסינפטית. המבנה המורכב והסטרמוקליד של סוכת דנדריטי כבר תחת חקירה אינטנסיבית מאז גילויו. מספר מערכות מודל, כולל הנוירונים האופטיים tectal אופטי, בחורה ברשתית גנגליון תאים, ו arborization הדנדריטים (da) נוירונים במערכת Drosophila ילה , הוקמו כדי ללמוד את הפיתוח, שיפוץ ופלסטיות של . דנדריטים כפתונטים1,2,3,4 דרוזופילה ונטלי נוירונים לרוחב (lnvs) הם קבוצה של נוירונים הקרנה חזותית מזוהה בתחילה עבור הפונקציות החשובות שלהם בוויסות אחראי של התנהגויות לטוס5. מחקרים גם חשפו את התפקיד של זחל החוצה כיעד הפוסט-סינפטיות הישיר של הזחל הפוטוקטורים (PRs)6,7. חשוב לעשות זאת, כאשר מדובר בפיתוח זחלים במשטרים אור שונים, משפיע בחריפות על גודל הארבורס הדנדריטי, הממחיש את ההתאמה של אינvs כמודל חדש לחקר הפלסטיות הדנדריטי7. העבודה האחרונה מהקבוצה שלנו מצביעה עוד על כך שהגודל של הדנדריטים המורק וההתנהגות הדינמית של הענפים הדנדריטים מציגים הפלסטיות התלוי בחוויית החוויה8,9. כחלק מעבודה זו, פיתחנו הדמיה חדשה ופרוטוקול הקוונפיקציה לבצע ניתוח על הדינמיקה הדנדריטים של lnvsמ 2 או 3 הזחלים סינטסיומאיה.
האופי השקוף של מוח הזחל דרוזוהילה הופך אותו לאידיאלי להדמיה חיה. עם זאת, סוכת הדנדריטים של lnvs ממוקמים בצפיפות innervated זחל אופטית נוירופיל (LON) במרכז האונה המוח זחל6. כדי ללכוד את התמונות של ענפים דנדריטים בסדר הרקמה ברקמת המוח שלמים, אנו מנצלים שני פוטון מיקרוסקופ, אשר מגדיל את העומק של חדירה אור ומפחית את הרעילות במהלך ניסויים הדמיה חיה10. באמצעות התקנה זו, בוצע בהצלחה ניסויים הדמיה חיה על LNvs במשך 30 דקות בלי להתבונן הידרדרות מורפולוגית הברורה של העצב. בנוסף, מניפולציות גנטיות באמצעות הטכניקה להעיף החוצה איפשר לנו לתייג את האינvs הבודד עם קרום מתויג gfp, אשר גם קריטי לניטור התנועות של ענפים בודדים11,12,13 .
כדי ללכוד את ההתנהגות הדינמית של כל הענפים על הארבור הדנדריטי עם הרזולוציה האופטית האופטימלית, הצלחנו לבצע הדמיה תלת-ממדית על-ידי הדמייה מוחית של זחל טרי עם רזולוציה מרחבית גבוהה ב 1 דקות לכל מסגרת עבור 10 עד 30 דקות. פיתוח מידע דנדריטים הם דינמיים מאוד, עם אחוז גדול של ענפים המציגים שינויים הנצפה בתוך החלון 10 דקות. זה מוביל לאחד האתגרים הטכניים העיקריים של לימוד הדינמיקה של הדנדריטים, התנהגות הענף ככמת מבוסס על ערכות נתוני התמונה 4-d. שיטות שנקבעו בעבר יש מגבלות שונות, כולל חוסר דיוק ודרישות זמן מופרז. לכן, פיתחנו למחצה אוטומטי שיטה המשלבת עיבוד לאחר התמונה, סימון ידני של מסופי הסניפים, ו-4D אוטומטי העקיבה באמצעות תוכנה ביאור תמונה. אנו מחשבים את התנועות של מסופי הענף בנקודות זמן שונות המבוססות על קואורדינטות 3D של הנקודות. לאחר מכן הנתונים יוצאו ונותחו כדי לייצר מדידות כמותיים של דינמיקת הענף. שיטה זו מעריך במדויק את המשך וההיקף של אירועי הארכה והנסיגה של ענפים קיימים, כמו גם היווצרות של ענפים חדשים, ומאפשר לנו לנטר את הדינמיקה של הדנדריטים במספר רב של נוירונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision II multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>79751-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>upright configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>for processing .csv files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td colspan="2">Scientific Volume Imaging</td>
			<td>for drift correction and deconvolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for 3D visualization and image annotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons

מאוד מורצפת הדנדריטים הדנדרידיה נמצאים באופן נרחב בנוירונים בשלבים התפתחותיים מוקדם. הענפים הדינמיים הללו מדגימות את הסביבה ומפעילים אנשי קשר עם שותפים סינפטיים פוטנציאליים. למרות הקשר בין הדינמיקה של הענף הדנדריטי לבין synaptogenesis הוא מבוסס היטב, כיצד תהליכים התפתחותיים ותלויי פעילות לווסת את הדינמיקה ענף הדנדריטים אינו מובן היטב. זה בחלקו בשל הקשיים הטכניים הקשורים הדמיה חיה ניתוחים כמותיים של אלה מבנים בסדר באמצעות מערכת vivo. הקמנו שיטה לחקור את הדינמיקה של הדנדריטים באמצעות דרוסופילה זחל ונטולי לרוחב נוירונים (lnvs), אשר ניתן לתייג באופן אינדיבידואלי באמצעות גישות גנטיות ונגישים להדמיה חיה. ניצול של מערכת זו, פיתחנו פרוטוקולים כדי ללכוד את הדינמיקה הענף של הארבור הדנדריטים כולו של מסומן בודד באמצעות הדמיה בזמן ההדמיה חי. לאחר מכן בוצעו לאחר עיבוד כדי לשפר את איכות התמונה באמצעות תיקון הסחף ופירוק, ואחריו ניתוח דינמיקת הענף ברמת הענף היחיד על ידי ביאור מיקומים מרחביים של כל מסופי הסניפים. לבסוף, פיתחנו R סקריפטים (קובץ משלים) ופרמטרים ספציפיים כדי לכמת את הענף דינמיקה באמצעות מידע הקואורדינטות שנוצר על ידי מעקב הטרמינל. באופן קולקטיבי, פרוטוקול זה מאפשר לנו להשיג תיאור כמותי מפורט של הדינמיקה הענף של ארבור הדנדריטי העצבי עם הזמן הגבוה ורזולוציה מרחבית. השיטות שפיתחנו חלות בדרך כלל על נוירונים בעלי תוויות בדלילות הן בתוך מבחנה והן בתנאים vivo.

באמצעות פרוטוקול הדמיה חיה המתואר לעיל, אנו ללכוד ערימות תמונה ברזולוציה גבוהה עבור ניתוחים וכימות הבאים. וידאו משלים 1 מראה את העוצמה המקסימלית מוקרן (mip) סדרת תמונה שנאסף נציג באופן אינדיבידואלי המסומן Lnv. איור 2B מציג את המיזוג המקביל ש...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו מועסקים התמונה המרצפת הדנדריטי מאוד בהכנה חיה של המוח הזחל Drosophila ילה , ואת הפרוטוקול שפיתחנו לכמת זמן קפיצה 3d מערכות הדמיה עבור הערכות כמותית של דנדט דינמיקה בפיתוח נוירונים.

זמן פקיעה הדמיה חיה הקוונפיקציה של הענף הדנדריטים המהירה בפיתוח של דרוזופילה נוירונים

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

פרוטוקול זה מספק גישה חדשה לכימות דינמיקת הענפים של הארבור הדנדריטי ופיתוח נוירונים באמצעות הדמיה בזמן אמת ותופס ביאור תמונה תלת-ממדית. טכניקה זו מדמה ומעקב אחר מסופי הענף ומספקת שיטה מהירה ויעילה למדידת ההתנהגויות הדינמיות של פילופודיה דנדריטית. מחקר בשיטה זו מספק תובנה להבנת האופן שבו פיתוח ופעילות מווסתים את מורפוגנזה דנדריט.השיטות שלנו ישימות לנוירונים המסווים בדלילות הן בהגדרות הפריה והן בהגדרות ה-vivo. בעת ביצוע הליך זה, זכור כי יש להתאים את פרמטרי ההדמיה בקפידה כדי להשיג רזולוציה זמנית ומחזורית מספקת. כדי לקצור מוחות מדרוסופילה זחל, תחת מיקרוסקופ מנתח להשתמש בזוג אחד של מלקחיים ניתוח קצה סטנדרטי מספר חמש להחזיק דגימת זחל במקום תוך שימוש השני כדי לנתח בזהירות את המוח, שמירה על דיסקיות העין, אונות המוח, ואת חוט העצב הגחוני.לאחר מכן להסיר את השרירים המצורפים כדי למזער כל תנועה של המדגם במהלך הדמיה. כאשר כל המוחות נקצרו, השתמש בשומן ואקום כדי לצייר תא מרובע על מגלשת זכוכית ולהוסיף 20 מיקרוליטרים של תמיסת מלח חיצונית לתא. השתמש במקלפים כדי להעביר את המוח לתא ולהתאים את תנוחות המוח מתחת למיקרוסקופ כאשר הצדדים הגביים פונים כלפי מעלה.מכסים את התא עם להחליק כיסוי זכוכית ולחץ בעדינות על החלקת הכיסוי כדי להפחית את הדגימה נסחף במהלך הליך ההדמיה. כדי לזהות מפלי מוח המכילים נוירונים המסומן בנפרד, בתוך 30 דקות מהניתוח בחר מטרת טבילת מים פי 40 ומקור אור אפיפלואורסצנטי. בחר לייזר פוטון שני מכוון 920 ננומטר גלאי שאינו Dscan ולהגדיר את הפרמטרים הדמיה כדי לאסוף את התמונות ב 512 על ידי 512 פיקסלים לכל מסגרת ודקה אחת לכל מחסנית Z במשך 10 דקות.לאחר מכן, התאימו את הזום האופטי והדיגיטלי כדי להשיג רזולוציית X, Y, Z מספקת תוך הקפדה על הכיסוי של כל האילנות הדנדריטית תוך דקה אחת. ההגדרות ייצרו תמונות ברזולוציית X, Y, Z טיפוסית של 0.11 על 0.11 על 0.25 מיקרומטר. לתיקון להיסחף, לפתוח את הקובץ של עניין בתוכנית תיקון להיסחף מתאים ולחץ על עריכה ועריכה של פרמטרים מיקרוסקופיים.הגדר את סוג המיקרוסקופ לשדה רחב עבור שתי תמונות הפוטון אם קיימת אפשרות של שני פוטון ועקוב אחר זרימת העבודה שהוגדרה על-ידי התוכנה. עבור deconvolution, לפתוח את התמונה לתקן להיסחף בתוכנת deconvolution ופעל זרימת העבודה. לאחר מכן, שמרו את התמונה המפותלת בסוג קובץ הנתמך על-ידי תוכנת ביאור התמונה הבאה המסוגלת לנתח נתוני 4D ולדווח על הקואורדינטות המרחביות של נקודות מוגדרות בתוך התמונה.לביאור תמונה, פתחו את התמונה המפותלת בתוכנת ביאור התמונה ובדקו וסמן את קצות הענף בכל נקודות הזמן ב-3D. תוכנת ביאור התמונה תדווח ותאמחסן את הקואורדינטות המרחביות והתזהיות של קצות הענף המסומנים. יצא את מידע הקואורדינטות כקובץ CSV לחישובים הבאים.במודול כתמים, לחץ על דלג על יצירה אוטומטית, ערוך באופן ידני וסמן את תיבת הסימון התחבר אוטומטית לספוט שנבחר. סקור את המסגרות בסדרת הזמנים ובחר ענף לביאור. החזקת מקש Shift לחוץ, לחץ על קצה מסוף הענף כדי להוסיף נקודה.לאחר מכן, לחץ על הכרטיסיה סטטיסטיקה, בחר מפורט, ערכים ספציפיים ומיקום. המידע המתועד של קואורדינטות מרחביות וזמן יוצג. לחץ על שמור כדי לייצא את הנתונים כקובץ CSV.לחישוב מיקום תיאור הענף ב- 3D, פתחו את קובץ ה- CSV כגיליון אלקטרוני ובחרו בעמודה 'מזהה רצועה'. לחץ על מיין מהקטן ביותר לגדול ביותר וקבל את הרחבת הבחירה. לאחר המיון, מזהה רצועה יזהה כל ענף דנדריטי ייחודי והנקודות מאותו ענף חולקות את אותו מזהה רצועה.העמודה שעה תחסן את המידע ממסגרות זמן שונות.בגיליון האלקטרוני, הוסף עמודת מרחק ולהשתמש בקואורדינטות כדי לחשב את המרחק של כל שתי נקודות סמוכות זמנית. כדי למדוד תנועות משניות ברמת voxel בודדת, אפס את כל ערכי המרחק הקטנים מ- 0.3 מיקרומטר כדי לסנן כל ביאור תמונה לא מקובץ או לא מושלם. לאחר מכן, צור עמודת תזוזה והעתק את הערכים מהעמודה מרחק לעמודה תזוזה.הקצה באופן ידני את אירועי ההרחבה והנסיגה עבור כל קצה ענף. אם זוהי הרחבה, השאר את ערך ההנעה החיובי ללא שינוי. אם זוהי נסיגה, שנה את ערך ההנעה המתאים לערך שלילי.לאחר מכן, בעמודת אירוע חדשה, סכם את ערכי ההנעה עבור אירועי הרחבה והתפטרות בודדים. בסרטון זה, ניתן לצפות בסדרת תמונות מוקרנת בעוצמה מרבית שנאספה מנציג המסוקרן בנפרד כנוירון גחוני. תמונות של מסגרת בודדת מאפשרות הערכה של אירועי הנסיגה וההרחבה.מעקב 4D Semiautomated של מסופי הענף מאפשר ביאור של מסופי הענף הדינמיים של נוירונים גחוניים המסומן בנפרד כמודגמים. חישוב הכיוון והמרחק של תנועות הענף בכל נקודת זמן מאפשר השוואה של דינמיקת הענף הדנדריטי לנוירונים גחונים המסווים בנפרד בשלבים התפתחותיים שונים. הצעד החשוב ביותר הוא שמירה על שלמות רקמת המוח ומורפולוגיה דנדריט במהלך ניתוח הרכבה.איכות סדרת התמונות הגולמיות היא גם קריטית למעקב וכמות מוצלחים. באמצעות טכניקה זו רכשנו את היכולת לבצע ניתוח כמותי של דנדריט פילופודיה בפיתוח נוירונים מרכזיים drosophila ולחקור את המכונות המולקולריות הקשורות התבגרות דנדריט ו synaptogenesis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...