Name: time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다, 건강의 국립 연구소. 프로젝트 번호 1ZIANS003137.

주의 사항: 이 프로토콜은 클래스 IV 레이저의 사용을 포함하고 적절한 교육 및 안전 지침을 따라야합니다. 직접 또는 산란된 레이저 광에 눈이나 피부에 노출되지 않도록 하십시오. 참고: 프로토콜에는 6단계가 포함되어 있습니다. 워크플로는 그림 1A에표시됩니다.
1. 플립 아웃 기술을 사용하여 개별 뉴런에 라벨링...

<ol>
	<li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis.">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li><li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation.">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. 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T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+optical+imaging+of+nervous+system+development.">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+Automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloQuant+reveals+increased+filopodia+density+during+breast+cancer+progression.">FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. 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여기에서, 우리는 우리가 기록하고 Drosophila 애벌레 두뇌에 있는 개별적으로 표지된 뉴런에 있는 수지상 가지의 동적 행동을 정량화하기 위하여 개발한 프로토콜을 기술합니다. 특히, 우리의 라이브 이미징 프로토콜은 우리가 애벌레 LNv의 전체 수지상 아버를 캡처하고 그 수상 돌기 지점의 동적 상태의 글로벌 뷰를 제공 할 수 있도록 특정 매개 변수를 포함하고 있습니다. 그러나, 우리의 정...

수상돌기는 감각및 시냅스 입력을 수신하고 처리하는 특수 신경 구획입니다. 수지상 아버의 복잡하고 고정 된 구조는 발견 이후 강도 높은 조사를 받고 있습니다. 제노푸스 광학 지각 신경세포, 병아리 망막 신경절 세포, 초파리 시스템의 수지상 수공(da) 뉴런을 포함한 다수의 모델 시스템이 개발, 리모델링 및 가소성을 연구하기 위해 설립되었습니다. 신경 모수석1,2,3,4. Drosophila 복부 측측 뉴런 (LNvs)은 비행 행동의 circadian 규칙에 있는 그들의 중요한 기능을 위해 처음에 확인된 시각적 투영 뉴런의 단5. 연구는 또한 애벌레 광수용체 (P)6,7의직접적인 후발성 표적으로 애벌레 LNvs의 역할을 밝혔다. 중요한 것은, 다른 빛 정권에서 개발 애벌레를 배양하는 것은 강하게 수지상 가소성 연구를위한 새로운 모델로 LNvs의 적합성을 입증, LNvs의 크기에 영향을 미친다7. 우리 그룹의 최근 연구는 더 LNv 덴드 라이트의 크기와 수지상 가지의 동적 동작 모두 경험 의존가소성표시8,9를나타냅니다. 이 작업의 일환으로, 우리는 2nd 또는 3rd instar 애벌레에서 LNvs의 수상 돌기 역학에 대한 분석을 수행하기 위해 새로운 라이브 이미징 및 정량화 프로토콜을 개발했습니다.
Drosophila 애벌레 두뇌의 투명한 본질은 살아있는 화상 진찰을 위해 이상적입니다. 그러나, LNvs의 수지상 아버는 애벌레 뇌 엽6의중심에 조밀하게 내심이 있는 애벌레 시신경제(LON)에 위치한다. 손상되지 않은 뇌 조직에서 미세 한 모수석 가지와 필로포디아의 이미지를 캡처하기 위해 2 광자 현미경을 사용하여 빛 침투깊이를 높이고 라이브 이미징 실험10동안 광독성을 감소시킵니다. 이 설정을 사용하여, 우리는 성공적으로 뉴런의 명백한 형태 학적 악화를 관찰하지 않고 30 분 이상 LNvs에 라이브 이미징 실험을 수행했다. 또한, 플립 아웃 기술을 사용하여 유전자 조작은 우리가 또한 개별 지점의 움직임을 모니터링하기위한 중요한 멤브레인 태그 GFP로 개별 LNvs를 라벨 수있도록 11,12, 13 .
최적의 광학 해상도로 LNv 수지상 아버의 모든 가지의 동적 거동을 포착하기 위해 프레임당 1분에서 10~30분 동안 높은 공간 해상도로 새로 해부된 애벌레 뇌 이식에 대한 타임랩스 3D 이미징을 수행했습니다. 수상돌기는 매우 동적이며, 분기의 큰 비율은 10 분 창 내에서 관찰 가능한 변화를 표시합니다. 이것은 4D 이미지 데이터 세트를 기반으로 분기 동작을 정량화, 수상 돌기 역학을 공부의 주요 기술적 과제 중 하나에 이르게. 이전에 설정된 메서드에는 정확도 부족 및 과도한 시간 요구 사항을 비롯한 다양한 제한 사항이 있습니다. 따라서 이미지 후처리, 지점 단자의 수동 마킹 및 이미지 주석 소프트웨어를 사용하여 자동 4D 스팟 추적을 결합한 반자동 방법을 개발했습니다. 점점의 3D 좌표를 기준으로 서로 다른 시점에서 분기 터미널의 움직임을 계산합니다. 그런 다음 데이터를 내보내고 분석하여 분기 역학의 정량적 측정을 생성합니다. 이 방법은 기존 가지의 확장 및 철회 이벤트의 지속 기간 및 범위뿐만 아니라 새로운 가지의 형성을 정확하게 평가하여 많은 수의 뉴런에서 수상 돌기 역학을 모니터링 할 수 있게합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision II multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>79751-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>upright configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>for processing .csv files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td colspan="2">Scientific Volume Imaging</td>
			<td>for drift correction and deconvolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for 3D visualization and image annotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons

고도의 운동성 수지상 필로포디아는 초기 발달 단계에서 뉴런에 널리 존재합니다. 이러한 탐색 동적 분기 주변 환경을 샘플링 하 고 잠재적인 시 냅 스 파트너와 접촉을 시작. 수지상 분지 역학과 시냅토 발생 사이의 연결이 잘 확립되어 있지만, 개발 및 활동 의존적 인 프로세스가 수지상 분기 역학을 조절하는 방법은 잘 이해되지 않습니다. 이것은 부분적으로 생체 내 시스템을 사용하여 이러한 미세 구조의 라이브 이미징 및 정량적 분석과 관련된 기술적 어려움에 기인한다. 우리는 개별적으로 유전 접근을 사용하여 표지될 수 있고 살아있는 화상 진찰을 위해 접근할 수 있는 Drosophila 애벌레 복부 측삭 신경세포 (LNvs)를 사용하여 수상돌기 역학을 공부하는 방법을 설치했습니다. 이 시스템을 활용하여 타임랩스 라이브 이미징을 통해 단일 라벨이 부착된 LNv의 전체 수지상 아버의 분기 역학을 포착하는 프로토콜을 개발했습니다. 그런 다음 드리프트 보정 및 디톤볼루션을 통해 이미지 품질을 개선하기 위해 후처리를 수행한 다음 모든 분기 단말의 공간 위치에 별칭을 하여 단일 분기 수준에서 분기 역학을 분석했습니다. 마지막으로 터미널 추적에 의해 생성된 좌표 정보를 사용하여 분기 역학을 정량화하기 위해 R스크립트(보충 파일)및 특정 매개 변수를 개발했습니다. 전체적으로, 이 프로토콜은 우리가 높은 시간및 공간 적 분해능을 가진 신경 수지상 아버의 가지 역학의 상세한 정량적 설명을 달성할 수 있게 한다. 우리가 개발 한 방법은 일반적으로 시험관 내 및 생체 내 조건 모두에서 드물게 표지 된 뉴런에 적용 할 수 있습니다.

위에서 설명한 라이브 이미징 프로토콜을 사용하여 후속 분석 및 정량화를 위해 고해상도 이미지 스택을 캡처합니다. 보조 비디오 1은 LNv. 도 2B가 개별적으로 라벨이 붙은 대표적인 로부터 수집된 최대 강도 투영(MIP) 이미지 시리즈를 도시하며, 이미지 시리즈의 8프레임에 상응하는 몽타주를 나타낸다. 두 패널에서 화살촉은...

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Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

여기에서는 Drosophila 애벌레 뇌의 실시간 준비에서 매우 운동성 수지상 필로포디아를 이미지화하기 위해 사용한 방법과 수상돌기의 정량적 평가를 위해 시간 경과 3D 이미징 데이터 세트를 정량화하기 위해 개발한 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 개발에 역학.

초파리 뉴런 개발시 빠른 수지상 분지 역학의 시간 경과 라이브 이미징 및 정량화

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

이 프로토콜은 수지상 식목의 분기 역학을 정량화하고 라이브 타임 랩스 이미징 및 3D 이미지 기여 소프트웨어를 사용하여 뉴런을 개발하는 새로운 접근 방식을 제공합니다. 이 기술은 수지상 filopodia의 동적 동작을 측정하기 위한 빠르고 효율적인 방법을 제공하는 분기 단자 이미지를 추적하고 추적합니다. 이 방법을 이용한 연구는 개발 및 활동이 어떻게 말단 형태 발생을 조절하는지 이해하는 통찰력을 제공합니다.우리의 방법은 시험관 내 및 생체 내 설정 모두에서 드물게 표지 된 뉴런에 적용 할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 충분한 시간적 및 공간 해상도를 달성하기 위해 이미징 매개 변수를 신중하게 조정해야 합니다. 애벌레 drosophila에서 두뇌를 수확하기 위해, 해부 현미경에서 1 쌍의 표준 팁 해부 집게를 사용하여 다른 한 쌍을 조심스럽게 뇌를 해부하는 동안 애벌레 표본을 제자리에 고정하고 눈 디스크, 뇌 엽 및 복부 신경 코드를 보존하십시오.그런 다음 부착 된 근육을 제거하여 이미징 중에 샘플의 움직임을 최소화하십시오. 모든 뇌가 수확되면 진공 그리스를 사용하여 사각형 챔버를 유리 슬라이드에 끌어당기고 챔버에 외부 식염수 용액 20 마이크로리터를 추가하십시오. 집게를 사용하여 뇌를 챔버로 옮기고 현미경으로 뇌의 위치를 조정합니다.유리 커버 슬립으로 챔버를 덮고 커버 슬립을 부드럽게 눌러 이미징 시술 중에 샘플 표류를 줄입니다. 개별적으로 표지된 뉴런을 포함하는 뇌 박종을 식별하려면 해부 에서 30 분 이내에 40X 물 침지 목표와 상피 광원을 선택합니다. 920 나노미터와 비 Dscan 검출기로 조정된 두 개의 광자 레이저를 선택하고 이미징 매개 변수를 프레임당 512픽셀, Z 스택당 1분으로 10분 동안 수집하도록 설정합니다.그런 다음 광학 및 디지털 줌을 조정하여 충분한 X, Y, Z 해상도를 달성하면서 1분 이내에 전체 수지상 식소의 커버리지를 보장합니다. 설정은 0.25 마이크로미터에 0.11 x 0.11x0.11의 일반적인 X, Y, Z 해상도로 이미지를 생성합니다. 드리프트 보정의 경우 적합한 드리프트 보정 소프트웨어 프로그램에 대한 관심 파일을 열고 미세 매개 변수 편집및 편집을 클릭합니다.두 개의 광자 옵션이 있는 경우 현미경 유형을 와이드 필드로 설정하고 소프트웨어에 정의된 워크플로우를 따릅니다. 디포온볼루션의 경우 드리프트 수정 된 이미지를 디온 볼루션 소프트웨어에서 열고 워크플로를 따릅니다. 그런 다음 4D 데이터를 분석하고 이미지 내에서 정의된 스팟의 공간 좌표를 보고할 수 있는 후속 이미지 기여 소프트웨어에 의해 지원되는 파일 유형으로 deconvolved 이미지를 저장합니다.이미지 음표의 경우 이미지 기여 소프트웨어에서 deconvolved 이미지를 열고 3D의 모든 시간 지점에서 분기 팁을 검사하고 표시합니다. 이미지 어음 소프트웨어는 표시된 분기 팁의 공간 및 측두측 좌표를 보고하고 저장합니다. 후속 계산을 위해 좌표 정보를 CSV 파일로 내보냅니다.스팟 모듈에서 자동 생성 건너뛰기를 클릭하고 수동으로 편집하고 선택한 스팟 확인란에 자동 연결을 선택합니다. 타임라인 시리즈의 프레임을 검토하고 성임에 대한 분기를 선택합니다. Shift 키를 잡고 분기 터미널 끝을 클릭하여 스팟을 추가합니다.그런 다음 통계 탭을 클릭하고 상세, 특정 값 및 위치를 선택합니다. 기록된 공간 및 측두구 좌표 정보가 표시됩니다. 저장을 클릭하여 데이터를 CSV 파일로 내보냅니다.분기 팁 배치를 3D로 계산하려면 CSV 파일을 스프레드시트로 열고 트랙 ID 열을 선택합니다. 가장 작은 정렬을 최대로 클릭하고 선택 확장을 수락합니다. 정렬 후 Track ID는 각 고유 수지상 분기를 식별하고 동일한 분기의 반점이 동일한 트랙 ID를 공유합니다.시간 열은 서로 다른 시간 프레임의 정보를 저장합니다.스프레드시트에서 거리 열을 추가하고 좌표를 사용하여 두 개의 시간적으로 인접한 반점의 거리를 계산합니다. 단일 복셀 수준에서 사소한 움직임을 측정하려면 0.3 마이크로미터보다 작은 모든 거리 값을 재설정하여 수정되지 않은 드리프트 또는 불완전한 이미지 음표가 필터링됩니다. 다음으로 변위 열을 만들고 거리 열에서 변위 열에 대한 값을 복사합니다.각 분기 팁에 대한 확장 및 철회 이벤트를 수동으로 할당합니다. 확장인 경우 양수 변위 값을 변경하지 않습니다. 철회인 경우 해당 변위 값을 음수 값으로 변경합니다.그런 다음 새 이벤트 열에서 개별 확장 및 철회 이벤트에 대한 변위 값을 합산합니다. 이 비디오에서는 대표자 개별적으로 표지된 복부 측면 뉴런으로부터 수집된 최대 강도 투영 이미지 시리즈를 관찰할 수 있다. 단일 프레임 이미지를 사용하면 철회 및 확장 이벤트를 평가할 수 있습니다.분기 단말의 반자동 4D 추적은 입증된 바와 같이 개별적으로 표지된 복부 측량 뉴런의 동적 분기 단말의 음표를 허용합니다. 각 시점에서 분기 운동의 방향과 거리를 계산하면 서로 다른 발달 단계에서 개별적으로 표지된 복부 측면 뉴런에 대한 수지상 분기 역학을 비교할 수 있습니다. 가장 중요한 단계는 해부 및 장착 하는 동안 뇌 조직 및 선장 모르폴로의 무결성을 보존 하는.원시 이미지 시리즈 품질은 성공적인 추적 및 정량화에도 중요합니다. 이 기술을 사용하여 우리는 drosophila 중앙 뉴런을 개발하는 데 있는 선점 성 필로포디아의 정량적 분석을 수행하고 침순 성숙과 시냅토 발생과 관련된 분자 기계를 탐구하는 능력을 얻었습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Sf9 세포에서 Aplysia 감각 뉴런에서 PKC Translocation의 라이브 영상

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

연구

신경과학

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

교양 공감 뉴런의 돌기 성장을 유도

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...