Name: time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Dette arbeidet er støttet av intramural Research program of National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag, National Institutes of Health. Prosjektnummer 1ZIANS003137.

Forsiktig: Denne protokollen innebærer bruk av klasse IV lasere og vil kreve riktig opplæring og sikkerhetsretningslinjer som skal følges. Unngå øye-eller hud eksponering for direkte eller spredt laser lys. Merk: Protokollen inneholder seks trinn. Arbeidsflyten vises i figur 1A.
1. merking individuelle neurons bruke flip-out teknikk
Merk: Singelen merking av LNvs ...

<ol>
	<li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis.">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li><li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation.">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).</li><li>Cline, H., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+dendritic+arbor+development+and+plasticity+by+glutamatergic+synaptic+input:+a+review+of+the+synaptotrophic+hypothesis.">The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis.</a> The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).</li><li>Helfrich-Forster, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphology+of+the+clock-gene-expressing+lateral+neurons+of+Drosophila+melanogaster.">Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).</li><li>Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+larval+visual+system:+High-resolution+analysis+of+a+simple+visual+neuropil.">The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil.</a> Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).</li><li>Yuan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Structural+and+Functional+Plasticity+in+Drosophila+Larval+Visual+System.">Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System.</a> Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).</li><li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+targets+dynamic+filopodia+in+regulating+dendrite+maturation+and+synaptogenesis.">Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Lipophorin+Receptors+Supports+Neuronal+Adaptation+to+Chronic+Elevations+of+Activity.">Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity.</a> Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li><li>Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+generation+of+marked+clones+in+Drosophila.">Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila.</a> Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).</li><li>del Valle Rodr&#237;guez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9, 47 (2011).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+optical+imaging+of+nervous+system+development.">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+Automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloQuant+reveals+increased+filopodia+density+during+breast+cancer+progression.">FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Urban&#269;i&#269;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodyan:+An+open-source+pipeline+for+the+analysis+of+filopodia.">Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).</li></ol>

Her beskriver vi en protokoll vi utviklet for å spille inn og kvantifisere den dynamiske atferden til dendrittiske grener i individuelt merket neurons i Drosophila larvestadiet hjerner. Spesielt vår Live Imaging protokollen inneholder spesifikke parametre som gjør oss i stand til å fange hele dendrittiske Arbor av en larvestadiet LNv og gi en global visning av den dynamiske tilstanden til sine dendrit grener. Men, fordi våre kvantifisering metoder tungt avhengige av merknaden om gren terminaler, neurons med...

Dendrites er spesialisert neuronal rom som mottar og behandler sensorisk og Synaptic innspill. Den komplekse og stereotype strukturen av dendrittiske arbors har vært under intens etterforskning siden oppdagelsen deres. En rekke modellsystemer, inkludert Xenopus optikk tectal neurons, chick retinal Ganglion celler, og dendrittiske arborization (da) neurons i Drosophila systemet, har blitt etablert for å studere utvikling, remodeling og plastisitet av neuronal dendrites1,2,3,4. Drosophila ventrale lateral neurons (LNvs) er en gruppe av visuell projeksjon neurons utgangspunktet identifisert for deres viktige funksjoner i døgn regulering av fly atferd5. Studier avslørte også rollen som larvestadiet LNvs som direkte postsynaptic målet for larvestadiet fotoreseptorene (PRs)6,7. Viktigere, dyrking utvikle larver i ulike lys regimer sterkt påvirker størrelsen på LNvs ' dendrittiske arbors, demonstrere egnetheten av LNvs som en ny modell for å studere dendrittiske plastisitet7. Nyere arbeid fra vår gruppe videre indikerer at både størrelsen på LNv dendrit og den dynamiske atferden til dendrittiske grener displayet Experience-avhengige plastisitet8,9. Som en del av dette arbeidet, utviklet vi en ny Live Imaging og kvantifisering protokoll for å utføre analyser på dendrit dynamikken i LNvs fra 2nd eller 3Rd skikkelsen larver.
Den gjennomsiktige natur Drosophila larvestadiet hjernen gjør det ideelt for Live Imaging. Imidlertid er den dendrittiske arbors av LNvs ligger i tett innervated larvestadiet optikk neuropil (LON) i sentrum av larvestadiet hjerne flik6. For å ta bilder av fine dendrit grener og filopodia i intakt hjernevev, bruker vi to-Foton mikroskopi, noe som øker dybden av lys penetrasjon og reduserer Phototoksisitet under Live Imaging eksperimenter10. Ved hjelp av dette oppsettet, vi vellykket utført Live Imaging eksperimenter på LNvs for over 30 min uten å observere åpenbare morfologiske forverring av Nevron. I tillegg genetisk manipulasjoner ved hjelp av flip-out teknikken gjorde oss i stand til å merke den enkelte LNvs med en membran merket GFP, som også er avgjørende for å overvåke bevegelsene til enkelte grener11,12,13 .
For å fange den dynamiske atferden til alle grener på LNv dendrittiske Arbor med optimal optisk oppløsning, utførte vi time-lapse 3D Imaging på fersk dissekert larvestadiet hjernen explants med en høy romlig oppløsning på 1 min per ramme for 10 til 30 min. utvikle LNv dendrites er svært dynamiske, med en stor prosentandel av grenene som viser merkbare endringer innenfor 10 min vinduet. Dette fører til en av de viktigste tekniske utfordringene i å studere dendrit dynamikk, kvantifisere gren atferd basert på 4D bildedata settene. Tidligere etablerte metoder har ulike begrensninger, inkludert mangel på nøyaktighet og overdreven tid kravet. Derfor har vi utviklet en semi-automatisk metode som kombinerer bilde etterbehandling, manuell merking av grenen terminaler, og automatisk 4D flekk sporing ved hjelp av et bilde merknad programvare. Vi beregner bevegelsene til gren terminaler på forskjellige tidspunkter basert på 3D-koordinatene til flekkene. Dataene eksporteres deretter og analyseres for å gi kvantitative målinger av gren dynamikken. Denne metoden vurderer nøyaktig varigheten og omfanget av forlengelse og tilbaketrekking hendelser av eksisterende grener, samt dannelsen av nye grener, slik at vi kan overvåke dendrit dynamikk i et stort antall neurons.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision II multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>79751-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>upright configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>for processing .csv files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td colspan="2">Scientific Volume Imaging</td>
			<td>for drift correction and deconvolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for 3D visualization and image annotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons

Svært aktive dendrittiske filopodia er allment tilstede i neurons på tidlige utviklingsmessige stadier. Disse undersøkende dynamiske grener prøve det omkringliggende miljøet og initiere kontakter med potensielle Synaptic partnere. Selv om forbindelsen mellom dendrittiske gren dynamikk og synaptogenesis er godt etablert, hvordan utviklingsmessige og aktivitet-avhengige prosesser regulere dendrittiske grenen dynamikk er ikke godt forstått. Dette skyldes delvis tekniske problemer knyttet til live Imaging og kvantitative analyser av disse fine strukturene ved hjelp av et in vivo-system. Vi etablerte en metode for å studere dendrit dynamikk ved hjelp av Drosophila larvestadiet ventrale lateral neurons (LNvs), som kan være individuelt merket ved hjelp av genetiske tilnærminger og er tilgjengelig for Live Imaging. Utnytter dette systemet, utviklet vi protokoller for å fange grenen dynamikk av hele dendrittiske Arbor av en enkelt merket LNv gjennom time-lapse Live Imaging. Vi deretter utførte etterbehandling for å forbedre bildekvaliteten gjennom drift korreksjon og deconvolution, etterfulgt av analysere gren dynamikk på single-grenen nivå ved å kommentere romlige posisjoner på alle gren terminaler. Til slutt utviklet vi R-skript (tilleggsfil) og spesifikke parametre for å kvantifisere gren dynamikk ved hjelp av koordinat informasjonen som genereres av Terminal sporingen. Kollektivt, denne protokollen tillater oss å oppnå en detaljert kvantitativ beskrivelse av grenen dynamikk av neuronal dendrittiske Arbor med høy Temporal og romlig oppløsning. Metodene vi utviklet er generelt gjelder for tynt merket neurons i både in vitro og in vivo forhold.

Ved hjelp av Live Imaging-protokollen beskrevet ovenfor, fanger vi opp bilde stabler med høy oppløsning for de påfølgende analysene og kvantifisering. Supplerende video 1 viser den maksimale intensiteten anslått (MIP) bildeserie Hentet fra en representant individuelt merket LNv. figur 2B viser tilsvarende montasje av åtte bilder i bildeserien. I begge panelene markerer pilspisser for hendelser og Utvidelses hendelser fo...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Her beskriver vi metoden vi brukte for å avbilde svært aktive dendrittiske filopodia i en live forberedelse av Drosophila larvestadiet hjernen, og protokollen vi utviklet for å kvantifisere tidsforløp 3D bildedata sett for kvantitative vurderinger av dendrit dynamikk i å utvikle neurons.

Time-lapse Live Imaging og kvantifisering av fast dendrittiske Branch Dynamics i utvikling Drosophila neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Denne protokollen gir en ny tilnærming til å kvantifisere grendynamikken til dendrittiske arboret og utvikle nevroner ved hjelp av live time lapse imaging og en 3D-bildemerknadsprogramvare. Denne teknikken bilder og sporer grensterminalene som gir en rask og effektiv metode for å måle den dynamiske atferden til dendrittiske filopodia. Forskning ved hjelp av denne metoden gir innsikt i å forstå hvordan utvikling og aktivitet regulerer dendritt morfogenese.Våre metoder gjelder for tynt merkede nevroner i både in vitro og in vivo-innstillinger. Når du utfører denne prosedyren, husk at bildeparametrene må justeres nøye for å oppnå en tilstrekkelig timelig og romlig oppløsning. For å høste hjerner fra larval drosophila, under et dissekerende mikroskop, bruk ett par nummer fem standard tips disseksjonskraft for å holde en larveprøve på plass mens du bruker den andre til å forsiktig dissekere ut hjernen, bevare øyeskivene, hjerneflikene og ventral nerveledning.Fjern deretter de vedlagte musklene for å minimere enhver bevegelse av prøven under bildebehandling. Når alle hjernene er høstet, bruk vakuumfett til å tegne et firkantet kammer på et glasssklie og tilsett 20 mikroliter ekstern saltløsning til kammeret. Bruk tangen til å overføre hjernen til kammeret og justere hjernens posisjoner under mikroskopet med dorsale sider vendt opp.Dekk kammeret med et glassdeksel slip og trykk forsiktig på dekselet slip for å redusere prøven drivende under bildebehandling prosedyren. For å identifisere hjernen explants som inneholder individuelt merkede nevroner, innen 30 minutter etter disseksjon velge en 40X vann nedsenking mål og en epifluorescence lyskilde. Velg en to foton laser innstilt til 920 nanometer og en ikke Dscan detektor og angi bildeparametrene for å samle bildene på 512 med 512 piksler per ramme og ett minutt per Z-stabel i 10 minutter.Deretter justerer du den optiske og digitale zoomen for å oppnå en tilstrekkelig X- og Y-, Z-oppløsning samtidig som dekningen av hele dendrittiske arboret innen ett minutt. Innstillingene vil generere bilder med en typisk X, Y, Z-oppløsning på 0,11 x 0,11 x 0,25 mikrometer. For driftkorrigering åpner du filen av interesse i et passende driftkorrigeringsprogram og klikker rediger og rediger mikroskopiske parametere.Sett mikroskoptypen til Bredt felt for de to fotonbildene hvis det er et alternativ for to foton og følger arbeidsflyten som er definert av programvaren. For overføring åpner du det driftopp korrigerte bildet i deconvolution-programvaren og følger arbeidsflyten. Deretter lagrer du det dekonvolverte bildet i en filtype som støttes av den etterfølgende bildemerknadsprogramvaren som kan analysere 4D-data og rapportere de romlige koordinatene for definerte flekker i bildet.For bildemerknad åpner du det dekonvolverte bildet i bildemerknadsprogramvaren og undersøker og merker grenstipsene til enhver tid i 3D. Bildemerknadsprogramvaren vil rapportere og lagre de romlige og timelige koordinatene til de merkede grenstipsene. Eksporter koordinatinformasjonen som en CSV-fil for etterfølgende beregninger.Klikk Hopp over automatisk oppretting, Rediger manuelt i Flekker-modulen, og merk av for Koble til valgt sted automatisk. Se gjennom rammene i tidsserien, og velg en gren for merknad. Hold Skift-tasten, klikk grensterminalspissen for å legge til et sted.Klikk deretter statistikkfanen, velg Detaljerte, Spesifikke verdier og Posisjon. Den registrerte romlige og timelige koordinatinformasjonen vises. Klikk på Lagre for å eksportere dataene som en CSV-fil.Hvis du vil beregne plasseringen av grentips i 3D, åpner du CSV-filen som et regneark og velger Spor ID-kolonnen. Klikk Sorter minste til største, og godta Utvid utvalget. Etter sortering identifiserer Spor ID hver unike dendrittiske gren, og flekkene fra samme gren deler samme Spor-ID.Tidsperioden lagrer informasjonen fra forskjellige tidsrammer.Legg til en Avstand-kolonne i regnearket, og bruk koordinatene til å beregne avstanden til hver to timelige tilstøtende steder. Hvis du vil måle mindre bevegelser på enkelt voxelnivå, tilbakestiller du alle avstandsverdiene som er mindre enn 0,3 mikrometer for å filtrere eventuelle ukorrigerte drivende eller ufullkomne bildemerknader. Deretter oppretter du en forskyvningskolonne og kopierer verdiene fra Avstand-kolonnen til Forskyvning-kolonnen.Tilordne forlengelses- og tilbaketrekkingshendelsene manuelt for hver grenspiss. Hvis det er en forlengelse, la den positive forskyvningsverdien være uendret. Hvis det er en tilbaketrekking, endrer du den tilsvarende forskyvningsverdien til en negativ verdi.Deretter summerer du deretter forskyvningsverdiene for individuelle utvidelses- og tilbaketrekkingshendelser i en ny hendelseskolonne. I denne videoen kan en maksimal intensitetsprojisert bildeserie samlet inn fra en representant individuelt merket ventral lateral neuron observeres. Bilder med én ramme tillater evaluering av tilbaketrekkings- og utvidelseshendelsene.Halvautomatisert 4D-sporing av grensterminalene tillater merknad av de dynamiske grenterminalene til individuelt merkede ventrale laterale nevroner som demonstrert. Beregning av retning og avstand av grenbevegelsene på hvert tidspunkt tillater en sammenligning av dendrittiske grendynamikken for individuelt merkede ventrale laterale nevroner på forskjellige utviklingsstadier. Det viktigste trinnet er å bevare integriteten til hjernevevet og dendrittmorfologi under disseksjon og montering.Kvaliteten på råbildeserien er også avgjørende for vellykket sporing og kvantifisering. Ved hjelp av denne teknikken fikk vi muligheten til å utføre kvantitativ analyse av dendrittfilopodia i å utvikle drosophila sentrale nevroner og å utforske molekylære maskiner i forbindelse med dendritt modning og synaptogenesis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Inducing dendrittiske Veksten i dyrkede sympatiske Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Høy oppløsning Live-Imaging of Cell Behavior i utviklingsland Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse Imaging av Neuroblast Migrasjon i Akutt Skiver av Adult Mouse forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve transection og Time-lapse Imaging av Glial Cell atferd Live Sebrafisk

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforese av glutamat og GABA: Et nyttig verktøy for å etterforske Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...