Name: time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Este trabalho é apoiado pelo programa de pesquisa intramural do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e AVC, institutos nacionais de saúde. Número do projeto 1ZIANS003137.

Atenção: Este protocolo envolve o uso de lasers de classe IV e exigirá orientações adequadas de treinamento e segurança a serem seguidas. Evite a exposição dos olhos ou da pele à luz laser direta ou dispersa. Nota: O protocolo inclui seis etapas. O fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1a.
1. rotulagem neurônios individuais usando a técnica flip-out
Nota: ...

<ol>
	<li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis.">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li><li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation.">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. 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T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+optical+imaging+of+nervous+system+development.">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Urban&#269;i&#269;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodyan:+An+open-source+pipeline+for+the+analysis+of+filopodia.">Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).</li></ol>

Aqui, nós descrevemos um protocolo que nós desenvolvemos para registrar e quantificar o comportamento dinâmico de filiais dendríticas em neurônios individualmente etiquetados no cérebro larval da Drosophila . Notavelmente, nosso protocolo de imagens ao vivo contém parâmetros específicos que nos permitem capturar todo o mandril dendrítico de um LNV larval e fornecer uma visão global do estado dinâmico de seus ramos dendrito. No entanto, como nossos métodos de quantificação dependem fortemente da an...

Os dendrites são compartimentos neuronais especializados que recebem e processam a entrada sensorial e sináptica. A estrutura complexa e estereotipada de mandris dendríticos tem sido intensa investigação desde a sua descoberta. Um número de sistemas do modelo, incluindo neurônios tectal de Xenopus ótico, pilhas retinal do gânglio do pintainho, e os neurônios dendríticas da arborização (da) no sistema de Drosophila , foram estabelecidos para estudar o desenvolvimento, a remodelação e a plasticidade de dendritos neuronal1,2,3,4. Os neurônios laterais da Drosophila ventral (lnvs) são um grupo de neurônios de projeção Visual inicialmente identificados por suas importantes funções na regulação circadiana de comportamentos de mosca5. Os estudos igualmente revelaram o papel de lnvs larval como o alvo pós-sináptica direto dos FOTORRECEPTORES larval (PRS)6,7. É importante ressaltar que a cultura do desenvolvimento de larvas em diferentes regimes de luz afeta fortemente o tamanho dos mandris dendríticos do LNvs, demonstrando a adequação dos LNvs como um novo modelo para o estudo da plasticidade dendrítica7. O trabalho recente do nosso grupo indica ainda que tanto o tamanho do dendrito LNV quanto o comportamento dinâmico dos galhos dendríticos exibem a plasticidade dependente da experiência8,9. Como parte deste trabalho, desenvolvemos um novo protocolo de imagem e quantificação ao vivo para realizar análises sobre a dinâmica dendrito de lnvs de larvasde 2 ou 3RD instar.
A natureza transparente do cérebro de Drosophila larval fá-lo ideal para a imagem latente viva. No entanto, os mandris dendríticos de lnvs estão situados no neurópilo óptico larval densamente inervado (lon) no centro do lobo cerebral larval6. Para captar imagens de galhos de dendrito finos e filopónicos no tecido cerebral intacto, utilizamos microscopia de dois fótons, o que aumenta a profundidade da penetração da luz e reduz a fototoxicidade durante experimentos de imagem ao vivo10. Usando esta configuração, realizamos com sucesso experimentos de imagem ao vivo em LNvs por mais de 30 min sem observar a deterioração morfológica óbvia do Neuron. Além disso, as manipulações genéticas utilizando a técnica flip-out permitiram-nos rotular os lnvs individuais com uma membrana etiquetada GFP, que também é fundamental para o monitoramento dos movimentos de ramos individuais11,12,13 .
Para capturar o comportamento dinâmico de todas as filiais no mandril dendríticas de LNV com definição ótica óptima, nós executamos a imagem latente do tempo-lapso 3D em explantes de cérebro larval recentemente dissecados com uma definição espacial elevada em 1 minuto por o frame para 10 a 30 minutos. desenvolvendo LNV dendritos são altamente dinâmicos, com uma grande percentagem dos ramos exibindo mudanças observáveis dentro da janela de 10 min. Isso leva a um dos principais desafios técnicos no estudo da dinâmica dendrito, quantificando o comportamento do ramo baseado nos conjuntos de dados de imagem 4D. Os métodos previamente estabelecidos têm várias limitações, incluindo a falta da exatidão e a exigência de tempo excessiva. Conseqüentemente, nós desenvolvemos um método semiautomático que combine o borne-processamento da imagem, a marcação manual dos terminais da filial, e o traçado 4D automático do ponto usando um software da anotação da imagem. Calculamos os movimentos dos terminais de filial em diferentes pontos temporais com base nas coordenadas 3D das manchas. Os dados são então exportados e analisados para produzir medições quantitativas da dinâmica da filial. Este método avalia com precisão a duração e extensão dos eventos de prorrogação e retração das ramificações existentes, bem como a formação de novos ramos, permitindo-nos monitorar a dinâmica dendrito em um grande número de neurônios.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision II multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>79751-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>upright configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>for processing .csv files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td colspan="2">Scientific Volume Imaging</td>
			<td>for drift correction and deconvolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for 3D visualization and image annotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons

O filopódia dendríticas altamente motile é extensamente atual nos neurônios em estágios desenvolventes adiantados. Essas ramificações dinâmicas exploratórias amostram o ambiente circundante e iniciam contatos com potenciais parceiros sinápticos. Embora a conexão entre a dinâmica do ramo dendrítico e a sinaptogênese esteja bem estabelecida, como os processos de desenvolvimento e dependentes da atividade regulam a dinâmica do ramo dendrítico não é bem compreendido. Isto é em parte devido às dificuldades técnicas associadas com a imagem latente viva e análises quantitativas destas estruturas finas usando um sistema in vivo. Nós estabelecemos um método para estudar a dinâmica do dendrito usando os neurônios laterais ventral da Drosophila larval (lnvs), que podem individualmente ser etiquetados usando aproximações genéticas e são acessíveis para a imagem latente viva. Aproveitando-se deste sistema, nós desenvolvemos protocolos para capturar a dinâmica do ramo de todo o mandril dendrítico de um único rotulado LNv através de imagens ao vivo de lapso temporal. Em seguida, realizamos pós-processamento para melhorar a qualidade da imagem através da correção de deriva e deconvolução, seguido pela análise dinâmica de ramo no nível de filial única, anotando posições espaciais de todos os terminais de filial. Por fim, desenvolvemos scripts R (arquivo suplementar) e parâmetros específicos para quantificar a dinâmica de ramificação usando as informações de coordenadas geradas pelo rastreamento do terminal. Coletivamente, este protocolo permite-nos alcançar uma descrição quantitativa detalhada da dinâmica do ramo do mandril dendrítico neuronal com alta resolução temporal e espacial. Os métodos que nós desenvolvemos são geralmente aplicáveis aos neurônios escassamente etiquetados em condições in vitro e in vivo.

Usando o protocolo de imagem ao vivo descrito acima, capturamos pilhas de imagens de alta resolução para as análises e quantificação subsequentes. O vídeo complementar 1 mostra a série da imagem projetada da intensidade máxima (MIP) coletada de um representante individualmente etiquetado LNV. a Figura 2B mostra a montagem correspondente de oito quadros da série de imagens. Em ambos os painéis, os setas marcam evento...

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Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Aqui, nós descrevemos o método que nós empregamos à imagem filopódia dendríticas altamente motile em uma preparação viva do cérebro larval da Drosophila , e o protocolo que nós desenvolvemos para quantificar conjuntos de dados da imagem latente do lapso de tempo 3D para avaliações quantitativas do dendrito dinâmica no desenvolvimento de neurônios.

Tempo-lapso de imagem ao vivo e quantificação da dinâmica da filial dendrítica rápida no desenvolvimento de neurônios de Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Este protocolo fornece uma nova abordagem para quantificar a dinâmica do ramo da árvore dendrítica e desenvolver neurônios usando imagens de lapso de tempo ao vivo e um software de anotação de imagem 3D. Esta técnica imagens e rastreia os terminais do ramo fornecendo um método rápido e eficiente para medir os comportamentos dinâmicos da filopodia dendrítica. A pesquisa usando este método fornece uma visão sobre como o desenvolvimento e a atividade regulam a morfogênese dendrite.Nossos métodos são aplicáveis a neurônios pouco rotulados em configurações in vitro e in vivo. Ao realizar este procedimento, lembre-se que os parâmetros de imagem devem ser cuidadosamente ajustados para alcançar uma resolução temporal e espacial suficiente. Para colher cérebros de drosophila larval, sob um microscópio dissecando use um par de fórceps de dissecção de ponta padrão número cinco para manter um espécime larval no lugar enquanto usa o outro para dissecar cuidadosamente o cérebro, preservando os discos oculares, lóbulos cerebrais e cordão nervoso ventral.Em seguida, remova os músculos ligados para minimizar qualquer movimento da amostra durante a imagem. Quando todos os cérebros forem colhidos, use graxa de vácuo para desenhar uma câmara quadrada em um escorregador de vidro e adicionar 20 microliters de solução salina externa à câmara. Use os fórceps para transferir os cérebros para a câmara e ajustar as posições do cérebro sob o microscópio com os lados dorsais voltados para cima.Cubra a câmara com um deslizamento de tampa de vidro e pressione suavemente no deslizamento da tampa para reduzir a deriva da amostra durante o procedimento de imagem. Para identificar explanações cerebrais contendo neurônios rotulados individualmente, dentro de 30 minutos da dissecção selecione um objetivo de imersão de água de 40X e uma fonte de luz de epifluorescência. Selecione um laser de dois fótons sintonizado em 920 nanômetros e um detector não Dscan e defina os parâmetros de imagem para coletar as imagens em 512 por 512 pixels por quadro e um minuto por pilha Z por 10 minutos.Em seguida, ajuste o zoom óptico e digital para obter uma resolução X, Y, Z suficiente, garantindo a cobertura de todo o arbor erótico em um minuto. As configurações gerarão imagens com uma resolução típica X, Y, Z de 0,11 por 0,11 por 0,25 micrômetros. Para correção de deriva, abra o arquivo de interesse em um programa de software de correção de deriva adequado e clique em Editar e Editar parâmetros microscópicos.Defina o tipo de microscópio para Wide Field para as duas imagens de fótons se houver uma opção de dois fótons e siga o fluxo de trabalho definido pelo software. Para a desconvolução, abra a imagem corrigida à deriva no software de desconvolução e siga o fluxo de trabalho. Em seguida, salve a imagem desconvolved em um tipo de arquivo que é suportado pelo software de anotação de imagem subsequente capaz de analisar dados 4D e relatar as coordenadas espaciais de pontos definidos dentro da imagem.Para anotação de imagem, abra a imagem desconvolved no software de anotação de imagem e examine e marque as pontas do ramo em pontos de sempre em 3D. O software de anotação de imagem informará e armazenará as coordenadas espaciais e temporais das pontas marcadas do ramo. Exporte as informações de coordenadas como um arquivo CSV para cálculos subsequentes.No módulo Pontos, clique em Pular criação automática, editar manualmente e verificar a caixa de seleção de ponto selecionado. Revise os quadros na série temporal e selecione um ramo para anotação. Segurando a tecla Shift, clique na ponta do terminal do ramal para adicionar um ponto.Em seguida, clique na guia Estatísticas, selecione Valores Detalhados, Específicos e Posição. As informações de coordenadas espaciais e temporais gravadas serão exibidas. Clique em Salvar para exportar os dados como um arquivo CSV.Para calcular a colocação da ponta da filial em 3D, abra o arquivo CSV como uma planilha e selecione a coluna Track ID. Clique em Classificar de menor para maior e aceitar Expandir a Seleção. Após a classificação, o Track ID identificará cada ramo dendrático único e os pontos da mesma filial compartilham o mesmo Track ID.A coluna Time armazenará as informações de diferentes períodos de tempo.Na planilha, adicione uma coluna Distância e use as coordenadas para calcular a distância de cada dois pontos temporalmente adjacentes. Para medir pequenos movimentos no nível único de voxel, reinicie todos os valores de distância menores que 0,3 micrômetros para filtrar qualquer anotação de imagem não corrigida ou imperfeita. Em seguida, crie uma coluna Deslocamento e copie os valores da coluna Distância para a coluna Deslocamento.Atribua manualmente os eventos de extensão e retração para cada ponta de ramo. Se for uma extensão, deixe o valor de deslocamento positivo inalterado. Se for uma retração, altere o valor de deslocamento correspondente para um valor negativo.Em seguida, em uma nova coluna Evento, somam os valores de deslocamento para eventos individuais de extensão e retração. Neste vídeo, pode-se observar uma série de imagens projetadas de intensidade máxima coletadas de um neurônio lateral ventral rotulado individualmente. Imagens de quadro único permitem avaliação dos eventos de retração e extensão.O rastreamento 4D semiautomado dos terminais de filial permite a anotação dos terminais dinâmicos de ramificação de neurônios laterais ventral rotulados individualmente, conforme demonstrado. O cálculo da direção e distância dos movimentos do ramo em cada ponto de tempo permite uma comparação da dinâmica do ramo dendrático para neurônios laterais ventrais rotulados individualmente em diferentes estágios de desenvolvimento. O passo mais importante é preservar a integridade do tecido cerebral e da morfologia de dendrite durante a dissecção e montagem.A qualidade da série de imagens brutas também é fundamental para o rastreamento e quantificação bem-sucedidos. Utilizando esta técnica, ganhamos a capacidade de realizar análise quantitativa de dendrite filopodia no desenvolvimento de neurônios centrais de drosophila e explorar as máquinas moleculares relacionadas à maturação dendrite e à sináforogógena.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-imagem de translocação da PKC em células Sf9 e em neurônios sensoriais Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Neurociência

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Induzir o crescimento dendrítico no cultivadas neurônios simpáticos

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...