Name: time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Detta arbete stöds av intramural forsknings program för nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke, National Institutes of Health. Projektnummer 1ZIANS003137.

Försiktighet: Detta protokoll omfattar användning av klass IV-lasrar och kommer att kräva ordentlig utbildning och säkerhetsriktlinjer som skall följas. Undvik ögon-eller hudexponering för direkt eller spridd laserljus. Anmärkning: Protokollet innehåller sex steg. Arbetsflödet visas i figur 1A.
1. märkning enskilda nervceller med hjälp av flip-out teknik
Anmärkning...

<ol>
	<li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis.">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li><li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation.">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).</li><li>Cline, H., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+dendritic+arbor+development+and+plasticity+by+glutamatergic+synaptic+input:+a+review+of+the+synaptotrophic+hypothesis.">The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis.</a> The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).</li><li>Helfrich-Forster, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphology+of+the+clock-gene-expressing+lateral+neurons+of+Drosophila+melanogaster.">Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).</li><li>Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+larval+visual+system:+High-resolution+analysis+of+a+simple+visual+neuropil.">The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil.</a> Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).</li><li>Yuan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Structural+and+Functional+Plasticity+in+Drosophila+Larval+Visual+System.">Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System.</a> Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).</li><li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+targets+dynamic+filopodia+in+regulating+dendrite+maturation+and+synaptogenesis.">Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Lipophorin+Receptors+Supports+Neuronal+Adaptation+to+Chronic+Elevations+of+Activity.">Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity.</a> Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li><li>Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+generation+of+marked+clones+in+Drosophila.">Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila.</a> Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).</li><li>del Valle Rodr&#237;guez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9, 47 (2011).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+optical+imaging+of+nervous+system+development.">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+Automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloQuant+reveals+increased+filopodia+density+during+breast+cancer+progression.">FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Urban&#269;i&#269;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodyan:+An+open-source+pipeline+for+the+analysis+of+filopodia.">Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).</li></ol>

Här beskriver vi ett protokoll som vi utvecklat för att registrera och kvantifiera det dynamiska beteendet hos dendritiska grenar i individuellt märkta neuroner i Drosophila larv hjärnor. Särskilt vår Live Imaging-protokollet innehåller specifika parametrar som gör det möjligt för oss att fånga hela dendritiska Arbor av en larv LNV och ge en global bild av det dynamiska tillståndet i dess Dendrit grenar. Men eftersom våra kvantifieringsmetoder starkt förlitar sig på anteckningen av filial terminal...

Dendriter är specialiserade neuronala fack som tar emot och bearbetar sensoriska och synaptiska indata. Den komplexa och stereotypa strukturen av dendritiska arbors har varit under intensiv utredning sedan deras upptäckt. Ett antal modellsystem, inklusive Xenopus Optic tectal nervceller, chick retinal ganglion celler, och dendritiska arborization (da) nervceller i Drosophila systemet, har inrättats för att studera utveckling, ombyggnad och plasticitet av neuronala dendriter1,2,3,4. Drosophila ventrala laterala neuroner (lnvs) är en grupp av visuella projektion neuroner initialt identifierats för sina viktiga funktioner i dygns reglering av flyga beteenden5. Studier avslöjade också rollen av larv lnvs som direkt postsynaptiska mål för larv fotoreceptorer (PRS)6,7. Viktigare, odling utveckla larver i olika ljus regimer starkt påverkar storleken på LNvs dendritiska arbors, visar lämpligheten av LNvs som en ny modell för att studera dendritiska plasticitet7. Nyligen arbete från vår grupp ytterligare visar att både storleken på LNV Dendrit och det dynamiska beteendet hos dendritiska grenar displayen Experience-beroende plasticitet8,9. Som en del av detta arbete har vi utvecklat en ny Live Imaging och kvantifiering protokoll för att utföra analyser på Dendrit dynamiken i lnvs från 2nd eller 3RD INSTAR larver.
Den transparenta karaktären hos Drosophila larv Brain gör den idealisk för levande avbildning. Men den dendritiska arbors av lnvs är belägna i tätt innerverade larv Optic neuropil (Lon) i mitten av larv Brain LOB6. För att fånga bilder av fina Dendrit grenar och filopodia i intakt hjärnvävnad, vi använder två-Photon mikroskopi, vilket ökar djupet av ljus inträngning och minskar fototoxicitet under Live Imaging experiment10. Med hjälp av denna inställning, vi framgångsrikt utfört Live Imaging experiment på LNvs för över 30 min utan att observera uppenbara morfologiska försämring av neuron. Dessutom, genetiska manipulationer med hjälp av flip-out tekniken möjligt för oss att märka de enskilda lnvs med ett membran taggade GFP, som också är kritisk för övervakning av förflyttningar av enskilda grenar11,12,13 .
För att fånga det dynamiska beteendet hos alla grenar på LNV dendritiska Arbor med optimal optisk upplösning, utförde vi tidsförlopp 3D-avbildning på nyligen dissekerade larv Brain djur med en hög rumslig upplösning på 1 min per ram för 10 till 30 min. utveckla LNV dendriter är mycket dynamisk, med en stor andel av grenarna visar observerbara förändringar inom 10 min fönster. Detta leder till en av de viktigaste tekniska utmaningarna i att studera Dendrit dynamik, kvantifiera gren beteende baserat på 4D bild datauppsättningar. Tidigare etablerade metoder har olika begränsningar, inklusive bristande noggrannhet och överdriven tid krav. Därför har vi utvecklat en semi-automatisk metod som kombinerar bild efter bearbetning, manuell märkning av grenterminaler, och automatisk 4D spot tracing med hjälp av en bild anteckning programvara. Vi beräknar Förflyttningar av grenterminaler vid olika tidpunkter baserat på 3D-koordinaterna för fläckarna. Data exporteras sedan och analyseras för att producera kvantitativa mätningar av filialens dynamik. Denna metod bedömer noggrant varaktigheten och omfattningen av förlängning och återgående händelser av befintliga grenar, samt bildandet av nya grenar, vilket gör att vi kan övervaka Dendrit dynamik i ett stort antal nervceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision II multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>79751-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>upright configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>for processing .csv files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td colspan="2">Scientific Volume Imaging</td>
			<td>for drift correction and deconvolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for 3D visualization and image annotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons

Mycket rörliga dendritiska filopodia är allmänt närvarande i nervceller på tidiga utvecklingsstadier. Dessa undersökande dynamiska grenar prov den omgivande miljön och initiera kontakter med potentiella synaptiska partners. Även om sambandet mellan dendritiska grenen dynamik och synaptogenes är väl etablerad, hur utvecklings-och aktivitetsberoende processer reglera dendritiska gren dynamik är inte förstått. Detta beror delvis på de tekniska svårigheterna i samband med levande avbildning och kvantitativa analyser av dessa fina strukturer med hjälp av ett in vivo-system. Vi etablerade en metod för att studera Dendrit dynamik med hjälp Drosophila larv ventrala laterala nervceller (lnvs), som kan vara individuellt märkta med genetiska metoder och är tillgängliga för Live Imaging. Dra nytta av detta system, utvecklade vi protokoll för att fånga gren dynamiken i hela dendritiska Arbor av en enda märkt LNv genom time-lapse Live Imaging. Vi utförde sedan efter bearbetning för att förbättra bildkvaliteten genom avdrift korrigering och deconvolution, följt av att analysera gren dynamiken på en gren nivå genom att kommentera rumsliga positioner av alla gren terminaler. Slutligen utvecklade vi R-skript (kompletterande fil) och specifika parametrar för att kvantifiera filialens dynamik med hjälp av den koordinatinformation som genererats av terminalspårningen. Kollektivt, detta protokoll tillåter oss att uppnå en detaljerad kvantitativ beskrivning av gren dynamiken i neuronala dendritiska Arbor med hög temporala och rumsliga upplösning. De metoder vi utvecklat är i allmänhet tillämpas på glest märkta neuroner i både in vitro-och in vivo villkor.

Med hjälp av Live Imaging-protokollet som beskrivs ovan, fångar vi högupplösta bild stackar för efterföljande analyser och kvantifiering. Kompletterande video 1 visar den maximala intensitet projicerade (MIP) bildserie som samlats in från en representant individuellt märkta LNV. figur 2B visar motsvarande montage av åtta bildrutor i Image-serien. I båda panelerna, pilspetsar Markera indragning händelser och pilar m...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Här beskriver vi den metod vi använde för att avbilda mycket rörliga dendritiska filopodia i en levande förberedelse av Drosophila larv hjärnan, och det protokoll vi utvecklat för att kvantifiera tidsförlopp 3D Imaging dataset för kvantitativa bedömningar av Dendrit dynamik i utvecklingen av nervceller.

Time-lapse Live Imaging och kvantifiering av snabba dendritiska grenen dynamik i utvecklingen Drosophila nervceller

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Detta protokoll ger en ny metod för att kvantifiera gren dynamik dendritiska berså och utveckla nervceller med hjälp av levande tid förfaller imaging och en 3D-bild anteckning programvara. Denna teknik bilder och spår grenen terminaler ger en snabb och effektiv metod för att mäta de dynamiska beteenden dendritiska filopodia. Forskning med denna metod ger insikt i att förstå hur utveckling och aktivitet reglerar dendrit morfogenes.Våra metoder är tillämpliga på glest märkta nervceller i både in vitro- och in vivo-inställningar. När du utför denna procedur, kom ihåg att de bildframställning parametrarna måste justeras noggrant för att uppnå en tillräcklig tidsmässiga och rumsliga upplösning. För att skörda hjärnor från larv drosophila, under en dissekera mikroskop använda ett par nummer fem standard spets dissekeringsånger för att hålla en larvprov på plats medan du använder den andra för att noggrant dissekera ut hjärnan, bevara ögat diskar, hjärnlober, och ventral nerv sladd.Ta sedan bort de bifogade musklerna för att minimera eventuella rörelser av provet under bildtagning. När alla hjärnor har skördats, använd vakuumfett för att dra en fyrkantig kammare på en glasrutschkana och tillsätt 20 mikroliter yttre saltlösning till kammaren. Använd triktorna för att överföra hjärnorna till kammaren och justera hjärnornas positioner under mikroskopet med ryggsidorna uppåt.Täck kammaren med en glaskåpa slip och tryck försiktigt på luckan för att minska provdrivor under bildtagningsproceduren. För att identifiera hjärnan explants som innehåller individuellt märkta nervceller, inom 30 minuter efter dissekering välj en 40X vatten nedsänkning mål och en epifluorescens ljuskälla. Välj en två fotonlaser inställd på 920 nanometer och en icke Dscan-detektor och ställ in bildbehandlingsparametrarna för att samla in bilderna på 512 med 512 pixlar per bildruta och en minut per Z-stack i 10 minuter.Justera sedan den optiska och digitala zoomen för att uppnå en tillräcklig X- Y-, Z-upplösning samtidigt som du säkerställer täckningen av hela dendritiska bersåen inom en minut. Inställningarna kommer att generera bilder med en typisk X, Y, Z upplösning på 0,11 med 0,11 x 0,25 mikrometer. För avdrift korrigering, öppna filen av intresse i en lämplig driftkorrigering program och klicka på Redigera och Redigera mikroskopiska parametrar.Ställ in mikroskoptypen till Wide Field för de två fotonbilderna om det finns ett alternativ för två fotoner och följ arbetsflödet som definierats av programvaran. För avvikelse, öppna drift korrigerad bild i deconvolution programvara och följ arbetsflödet. Spara sedan den deconvolved bilden i en filtyp som stöds av den efterföljande bildanteckningsprogramvaran som kan analysera 4D-data och rapportera de rumsliga koordinaterna för definierade fläckar inom bilden.För bildanteckning öppnar du den deconvolved bilden i programvaran bildanteckning och undersöka och markera gren tips hela tiden punkter i 3D. Bildanteckningsprogramvaran kommer att rapportera och lagra de rumsliga och tidsmässiga koordinaterna för de markerade grentipsen. Exportera koordinatinformationen som en CSV-fil för efterföljande beräkningar.Klicka på Hoppa över automatiskt skapande i modulen Fläckar, Redigera manuellt och markera kryssrutan Koppla automatiskt till markerad dekor. Granska bildrutorna i tidsserien och välj en gren för anteckning. Håller Skift-tangenten, klicka på grenen terminal tips för att lägga till en plats.Klicka sedan på fliken Statistik, välj Detaljerade, Specifika värden och Placering. Den inspelade rumsliga och tidsmässiga koordinatinformationen kommer att visas. Klicka på Spara om du vill exportera informationen som en CSV-fil.Om du vill beräkna grenspetsplaceringen i 3D öppnar du CSV-filen som ett kalkylblad och väljer kolumnen Spåra ID. Klicka på Sortera minst till störst och acceptera Expandera markeringen. Efter sorteringen kommer Track ID att identifiera varje unik dendritgren och fläckarna från samma gren delar samma Track ID.The Time-kolumnen kommer att lagra informationen från olika tidsramar.I kalkylarket lägger du till en Distance-kolumn och använder koordinaterna för att beräkna avståndet för varannan temporalt intilliggande fläckar. För att mäta mindre rörelser på nivån med enkel voxel återställer du alla avståndsvärden som är mindre än 0,3 mikrometer för att filtrera eventuell okorrigerad drivande eller ofullkomlig bildanteckning. Därefter skapar du en Förskjutningskolumn och kopierar värdena från kolumnen Avstånd till kolumnen Förskjutning.Tilldela förlängnings- och tillbakadragningshändelser manuellt för varje grenspets. Om det är en förlängning, lämna det positiva förskjutningsvärdet oförändrat. Om det är en upprullning, ändra motsvarande förskjutningsvärde till ett negativt värde.Sedan, i en ny Händelse kolumn, summera de förskjutningsvärden för enskilda förlängning och indragning händelser. I denna video, en maximal intensitet projicerade bildserie samlas in från en representant individuellt märkt ventrala laterala neuron kan observeras. Med enstaka bildruta kan du utvärdera om de infällbara och extensionshändelserna.Halvautomaterade 4D-spårning av filialterminalerna möjliggör annotering av de dynamiska gren terminalerna för individuellt märkta ventrala laterala nervceller som visat. Beräkning av riktningen och avståndet för grenen rörelser vid varje tidpunkt kan en jämförelse av dendritiska grenen dynamik för individuellt märkta ventrala laterala nervceller på olika utvecklingsstadier. Det viktigaste steget är att bevara integriteten hos hjärnvävnaden och dendritmorfosoloy under dissekering och montering.Den råa bildserie kvalitet är också avgörande för framgångsrik spårning och kvantifiering. Med hjälp av denna teknik fick vi förmågan att utföra kvantitativ analys av dendrite filopodia i utvecklingen av drosophila centrala nervceller och att utforska de molekylära maskiner som rör dendrit mognad och synaptogenesis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-avbildning av PKC translokation hos Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live avbildning av kloner som är närbesläktade neurala stamceller i utvecklingsländerna Zebrafish framhjärnan

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulering och mitokondriell Transport: Bildproduktion i hippocampus nervceller under långa löptider

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Analys av Dendritiska Spine Morfologi i odlade CNS Neuroner

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Induktion Dendritic Tillväxten i Odlade sympatiska nervceller

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Högupplöst Live avbildning av cellens beteende i utvecklingsländerna neuroepitelet

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse avbildning av Neuroblast Migration i akuta skivor av vuxen mus framhjärnan

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motorisk nerv transection och Time-lapse avbildning av stödjeceller Beteenden Live Zebrafish

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...