Name: time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Proje numarası 1ZIANS003137.

DİkKAT: Bu protokol sınıf IV lazerlerin kullanımını içerir ve uygun eğitim ve güvenlik yönergeleriuyulmasını gerektirir. Doğrudan veya dağınık lazer ışığına göz veya cilt maruz kaçının. NOT: Protokol altı adım dan oluşur. İş akışı Şekil 1A'dagösterilmiştir.
1. Flip-out Tekniğini Kullanarak Bireysel Nöronların Etiketlemi
NOT: LNvs ...

<ol>
	<li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis.">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li><li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation.">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).</li><li>Cline, H., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+dendritic+arbor+development+and+plasticity+by+glutamatergic+synaptic+input:+a+review+of+the+synaptotrophic+hypothesis.">The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis.</a> The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).</li><li>Helfrich-Forster, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphology+of+the+clock-gene-expressing+lateral+neurons+of+Drosophila+melanogaster.">Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).</li><li>Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+larval+visual+system:+High-resolution+analysis+of+a+simple+visual+neuropil.">The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil.</a> Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).</li><li>Yuan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Structural+and+Functional+Plasticity+in+Drosophila+Larval+Visual+System.">Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System.</a> Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).</li><li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+targets+dynamic+filopodia+in+regulating+dendrite+maturation+and+synaptogenesis.">Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Lipophorin+Receptors+Supports+Neuronal+Adaptation+to+Chronic+Elevations+of+Activity.">Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity.</a> Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li><li>Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+generation+of+marked+clones+in+Drosophila.">Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila.</a> Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).</li><li>del Valle Rodr&#237;guez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9, 47 (2011).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+optical+imaging+of+nervous+system+development.">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+Automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloQuant+reveals+increased+filopodia+density+during+breast+cancer+progression.">FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Urban&#269;i&#269;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodyan:+An+open-source+pipeline+for+the+analysis+of+filopodia.">Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).</li></ol>

Burada, Drosophila larva beyinlerinde tek tek etiketlenmiş nöronlarda dendritik dalların dinamik davranışını kaydetmek ve ölçmek için geliştirdiğimiz bir protokolü tanımlıyoruz. Özellikle, canlı görüntüleme protokolümüz, bir larva LNv'nin dendritik arbor'unu yakalamamızı ve dendrit dallarının dinamik durumunu küresel olarak görmemizi sağlayan özel parametreler içerir. Ancak, sayısallaştırma yöntemlerimiz ağırlıklı olarak dal terminallerinin ek açıklamalarına dayandığı...

Dendritler duyusal ve sinaptik girişi alan ve işleyen özel nöronal bölmelerdir. Dendritik çardakların karmaşık ve basmakalıp yapısı, keşiflerinden bu yana yoğun bir soruşturma altında. Model sistemleri, Xenopus optik tectal nöronlar, civciv retinaganglion hücreleri ve drosophila sisteminde dendritik arborization (da) nöronlar da dahil olmak üzere, geliştirme, remodeling ve plastisite incelemek için kurulmuştur nöronal dendritler1,2,3,4. Drosophila ventral lateral nöronlar (LNvs) görsel projeksiyon nöronlar bir grup başlangıçta sinek davranışları sirkadiyen düzenleme önemli işlevleri için tanımlanan5. Çalışmalar da larva fotoreseptörleri doğrudan postsinaptik hedef olarak larva LNvs rolünü ortaya (PRs)6,7. Daha da önemlisi, farklı ışık rejimlerinde gelişmekte olan larvaların kültürlenerek LNvs 'dendritik arbors boyutunu güçlü etkiler, dendritik plastisite eğitimi için yeni bir model olarak LNvs uygunluğunu gösteren7. Grubumuzdan son çalışmalar daha lnv dendrit boyutu ve dendritik dalların dinamik davranış deneyim bağımlı plastisite8,9görüntülemek gösterir. Bu çalışmanın bir parçası olarak, 2veya 3 instar larvasından LNvs'nin dendrit dinamiği üzerinde analiz yapmak için yeni bir canlı görüntüleme ve niceleme protokolü geliştirdik.
Drosophila larva beyninin şeffaf doğası onu canlı görüntüleme için ideal hale getirir. Ancak, LNvs dendritik arbors larva beyin lobmerkezindeyoğun innerve larva optik nöropil (LON) bulunmaktadır 6 . Bozulmamış beyin dokusunda ince dendrit dalları ve filopodia görüntüleri yakalamak için, biz ışık penetrasyon derinliğini artırır ve canlı görüntüleme deneyleri sırasında fototoksisite azaltır iki foton mikroskopi, kullanmak10. Bu kurulumu kullanarak, nöronun belirgin morfolojik bozulmasını gözlemlemeden LNvs üzerinde 30 dakikadan fazla canlı görüntüleme deneyleri gerçekleştirdik. Buna ek olarak, Flip-out tekniğini kullanarak genetik manipülasyonlar bize bir membran gfp etiketli ile bireysel LNvs etiketlemek için etkin, hangi da bireysel dalların hareketlerini izlemek için kritik11,12,13 .
LNv dendritik arbor'daki tüm dalların dinamik davranışını optimum optik çözünürlüğe sahip olarak yakalamak için, 10 ila 30 dakika boyunca kare başına 1 dk yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip, yeni diseksiyonlu larva beyin ekstrelerinde hızlandırılmış 3D görüntüleme gerçekleştirdik. dendritler son derece dinamiktir ve dalların büyük bir yüzdesi 10 dk'lık pencerede gözlemlenebilir değişiklikler gösterir. Bu, dendrite dinamiğinin incelenmesinde, 4B görüntü veri kümelerine dayalı dal davranışının ölçülmesinde en önemli teknik zorluklardan birine yol açar. Daha önce kurulan yöntemler, doğruluk eksikliği ve aşırı zaman gereksinimi de dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar vardır. Bu nedenle, görüntü işleme sonrası, şube terminallerinin manuel işaretleme ve görüntü ek açıklama yazılımı kullanarak otomatik 4D nokta izleme birleştiren yarı otomatik bir yöntem geliştirdik. Şube terminallerinin hareketlerini noktalardaki 3B koordinatları esas alınabılarak farklı zaman noktalarında hesaplıyoruz. Veriler daha sonra dışa aktarılır ve şube dinamiğinin nicel ölçümlerini üretmek için analiz edilir. Bu yöntem, mevcut dalların uzatma ve geri çekilme olaylarının süresini ve kapsamını ve yeni dalların oluşumunu doğru bir şekilde değerlendirerek çok sayıda nöronda dendrite dinamiklerini izlememizi sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision II multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>79751-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>upright configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>for processing .csv files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td colspan="2">Scientific Volume Imaging</td>
			<td>for drift correction and deconvolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for 3D visualization and image annotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons

Son derece hareketli dendritik filopodia erken gelişim evrelerinde nöronlarda yaygın olarak mevcuttur. Bu araştırmacı dinamik dallar çevredeki ortamı örneklemektedir ve potansiyel sinaptik ortaklarla temaslar başlatır. Dendritik dal dinamiği ile sinaptogenez arasındaki bağlantı iyi kurulmuş olsa da, gelişimsel ve aktiviteye bağlı süreçlerin dendritik dal dinamiği nasıl düzenlediği tam olarak anlaşılamamıştır. Bunun nedeni kısmen canlı görüntüleme ve in vivo sistemi kullanılarak bu ince yapıların kantitatif analizleri ile ilgili teknik zorluklardır. Drosophila larva ventral lateral nöronlar (LNvs) kullanarak dendrit dinamiği incelemek için bir yöntem oluşturduk, bu yöntem genetik yaklaşımlar kullanılarak ayrı ayrı etiketlenebilir ve canlı görüntüleme için erişilebilir. Bu sistemden yararlanarak, tüm dendritik çardakların dal dinamiklerini yakalamak için protokoller geliştirdik. Daha sonra sürüklenme düzeltme ve dekonvolution yoluyla görüntü kalitesini artırmak için post-processing gerçekleştirdik ve ardından tüm şube terminallerinin mekansal konumlarını ekleyerek tek dal düzeyinde dal dinamiklerini analiz ettik. Son olarak, terminal izleme tarafından oluşturulan koordinat bilgilerini kullanarak şube dinamiklerini ölçmek için R komut dosyaları(Tamamlayıcı Dosya)ve özel parametreler geliştirdik. Topluca, bu protokol bize yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlük ile nöronal dendritik arbor dal dinamikleri ayrıntılı bir nicel açıklamasını elde etmek için izin verir. Geliştirdiğimiz yöntemler genellikle hem in vitro hem de in vivo koşullarda seyrek etiketli nöronlar için geçerlidir.

Yukarıda açıklanan canlı görüntüleme protokolünü kullanarak, sonraki analizler ve niceleme için yüksek çözünürlüklü görüntü yığınları yakalarız. Ek Video 1, tek tek etiketli lnv. Şekil 2B, görüntü serisinin sekiz karesinin ilgili montajını gösteren bir temsilciden toplanan maksimum yoğunluklu (MIP) görüntü serisini gösterir. Her iki panelde de ok uçları geri çekme olaylarını işaretle...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Burada, Drosophila larva beyninin canlı bir hazırlığında son derece hareketli dendritik filopodia'yı görüntülemek için uyguladığımız yöntemi ve dendritin kantitatif değerlendirmeleri için hızlandırılmış 3D görüntüleme veri kümelerini ölçmek için geliştirdiğimiz protokolü anlatıyoruz. nöronlar gelişmekte dinamikleri.

Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Bu protokol, dendritik arbor'un dal dinamiklerini ölçmek ve canlı zaman atlamalı görüntüleme ve 3D görüntü ek açıklama yazılımı kullanarak nöronlar geliştirmek için yeni bir yaklaşım sağlar. Bu teknik, dendritik filopodia'nın dinamik davranışlarını ölçmek için hızlı ve verimli bir yöntem sağlayan dal terminallerini görüntüler ve izler. Bu yöntemi kullanarak yapılan araştırmalar, gelişim ve aktivitenin dendrite morfogenezi nasıl düzenlediğini anlamayı sağlar.Yöntemlerimiz hem in vitro hem de in vivo ortamlarda seyrek etiketli nöronlar için geçerlidir. Bu yordamı gerçekleştirirken, yeterli zamansal ve uzamsal çözünürlüğe ulaşmak için görüntüleme parametrelerinin dikkatle ayarlanması gerektiğini unutmayın. Larva drosophila beyin hasat için, bir diseksiyon mikroskop altında bir çift beş standart uç diseksiyon forceps yerinde bir larva örneği tutmak için diğer kullanırken dikkatle beyin dışarı incelemek için, göz diskleri, beyin lobları ve ventral sinir kordonu koruyarak.Daha sonra görüntüleme sırasında numunenin herhangi bir hareketini en aza indirmek için bağlı kasları çıkarın. Tüm beyinler hasat edildiğinde, bir cam slayt üzerine bir kare oda çizmek ve hazneye 20 mikrolitre harici tuzlu çözelti eklemek için vakum yağı kullanın. Beyinleri odaya aktarmak ve sırt kenarları yukarı bakacak şekilde mikroskop altındaki beyinlerin pozisyonlarını ayarlamak için çersepsi kullanın.Bir cam kapak fişi ile oda kapağı ve görüntüleme işlemi sırasında örnek sürüklenen azaltmak için kapak fişi hafifçe basın. Ayrı ayrı etiketlenmiş nöronlar içeren beyin ekstrelerini tanımlamak için, diseksiyondan sonraki 30 dakika içinde 40X su daldırma hedefi ve epifloresan ışık kaynağı seçin. 920 nanometre ve Dscan olmayan bir dedektöre ayarlanmış iki foton lazer seçin ve görüntüleme parametrelerini 512'de kare başına 512 piksel ve 10 dakika boyunca Z-stack başına bir dakika olarak toplamak için ayarlayın.Daha sonra, bir dakika içinde tüm dendritik arbor kapsama sağlarken yeterli X, Y, Z çözünürlüğü elde etmek için optik ve dijital zum ayarlayın. Ayarlar, 0,11 x 0,11 x 0,25 mikrometre ile tipik bir X, Y, Z çözünürlüğüne sahip görüntüler oluşturur. Drift düzeltme için, uygun bir drift düzeltme yazılımı programında ilgi dosyasını açın ve Mikroskobik Parametreleri Edit ve Edit'i tıklatın.İki foton seçeneği varsa, iki foton görüntüsü için mikroskop türünü Geniş Alan olarak ayarlayın ve yazılım tarafından tanımlanan iş akışını izleyin. Deconvolution için, deconvolution yazılımında sürüklenen görüntüyü açın ve iş akışını izleyin. Ardından, 4B verileri çözümleme ve görüntü içindeki tanımlı noktaların uzamsal koordinatlarını raporlama yeteneğine sahip sonraki görüntü ek açıklama yazılımı tarafından desteklenen bir dosya türünde deconvolved görüntü kaydedin.Görüntü ek açıklama için, görüntü ek açıklama yazılımında deconvolved görüntü açın ve incelemek ve 3D her zaman noktalarında şube ipuçlarını işaretleyin. Görüntü ek açıklama yazılımı, işaretli dal ipuçlarının uzamsal ve zamansal koordinatlarını bildirir ve saklar. Sonraki hesaplamalar için koordinat bilgilerini CSV dosyası olarak dışa aktarın.Noktalar modülünde Otomatik Oluşturmayı Atla'yı tıklatın, El ile Edin'i tıklatın ve Otomatik Bağlantı'yı Seçili Nokta onay kutusuna işaretleyin. Zaman serisindeki kareleri gözden geçirin ve ek açıklama için bir dal seçin. Shift tuşunu basılı tutarak, nokta eklemek için şube terminal ucunu tıklatın.Ardından, İstatistikler sekmesini tıklatın, Ayrıntılı, Belirli Değerler ve Konum'u seçin. Kaydedilen mekansal ve zamansal koordinat bilgileri görüntülenir. Verileri CSV dosyası olarak aktarmak için Kaydet'i tıklatın.Şube ipucu yerleşimini 3B olarak hesaplamak için CSV dosyasını elektronik tablo olarak açın ve İzID sütununa seçin. En Küçükten En Büyüye Sırala'yı tıklatın ve Seçimi Genişlet'i kabul edin. Sıralamadan sonra, Track ID her benzersiz dendritik dalı tanımlar ve aynı daldaki noktalar aynı Track ID.The Time sütunundaki noktaları paylaşır ve farklı zaman dilimlerindeki bilgileri saklar.Elektronik tabloda, bir Mesafe sütunu ekleyin ve her iki zamansal bitişik noktanın uzaklıklarını hesaplamak için koordinatları kullanın. Tek voxel düzeyindeki küçük hareketleri ölçmek için, düzeltilmemiş sürüklenen veya kusurlu görüntü ek açıklamalarını filtrelemek için 0,3 mikrometreden küçük tüm mesafe değerlerini sıfırlayın. Ardından, Bir Yer Değiştirme sütunu oluşturun ve uzaklık sütunundaki değerleri Yer değiştirme sütununa kopyalayın.Her şube ucu için uzantı ve geri çekme olaylarını el ile atayın. Bu bir uzantıysa, pozitif yer değiştirme değerini değiştirmeden bırakın. Bu bir geri çekme ise, karşılık gelen yer değiştirme değerini negatif değere değiştirin.Ardından, yeni bir Olay sütununda, tek tek uzantı ve geri çekme olayları için yer değiştirme değerlerini toplayın. Bu videoda, ventral lateral nöron etiketli bir temsilciden toplanan maksimum yoğunluklu yansıtılan görüntü serileri gözlemlenebilir. Tek kare görüntüler, geri çekme ve uzatma olaylarının değerlendirilmesini sağlar.Şube terminallerinin yarı otomatik 4D takibi, tek tek etiketlenmiş ventral lateral nöronların dinamik dal terminallerinin gösterildiği gibi ek açıklamayapılmasına olanak sağlar. Her zaman noktasında dal hareketlerinin yönü ve uzaklığı hesaplanması, farklı gelişim selevrelerinde ayrı ayrı etiketlenmiş ventral lateral nöronlar için dendritik dal dinamiğinin karşılaştırılmasına olanak sağlar. En önemli adım diseksiyon ve montaj sırasında beyin dokusu ve dendrit morfolojisinin bütünlüğünü korumaktır.Ham görüntü serisi kalitesi de başarılı izleme ve nicelik lendirme için önemlidir. Bu tekniği kullanarak drosophila santral nöronların geliştirilmesinde dendrit filopodia'nın kantitatif analizini yapma ve dendrit maturasyonu ve sinaptogenez ile ilgili moleküler makineleri keşfetme becerisi kazandık.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Canlı görüntüleme Sf9 Hücreler ve PKC Translokasyon Aplysia Duyu Nöronlar

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Kültür sempatik nöronlar bulunan dendritik Büyüme indükleyen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...