Name: a pre-clinical rat model for the study of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery
Uploaded: 2019-11-08T14:00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery at JoVE.com

Forskningsprojektet blev udført på Jesús Usón minimalt invasive Operations Center (CCMIJU), en del af IKT Nanbiosis. Undersøgelsen blev udført med hjælp fra følgende Nanbiosis-enheder: U21, eksperimentel operationsstue; U22, dyre boliger; og U14, celleterapi. Dette arbejde blev støttet af ISCIII Project PI16/02164. Funder havde ingen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og analyse, beslutning om at udgive eller manuskript forberedelse. En særlig tak til María Pérez for at forberede tallene og for Fernanda Carrizosa til konstant at opmuntre og støtte den videnskabelige bibliografi.

Alle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med det etiske udvalg af Jesús Usón minimalt invasive kirurgi Center og velfærds retningslinjerne for den regionale regering, der er baseret på europæisk lovgivning.
1. klargøring af presurgisk og kirurgisk behandling
<ol><li>Hus Wistar rotter vejer 290 – 350 g i bure ved 22 – 25 °C med fri adgang til mad og vand. Acclimate i 1 uge før operationen for at forhindre stress-induceret problemer.</li>
	<li>Placer en rotte i en anæstesi induktions kammer, levere 5 min ilt (0.5-1 L/min), og bruge en vaporizer til at levere 5% Sevofluran til at fremkalde anæstesi.</li>
	<li>Tag rotten ud af kammeret, når anæstesi er induceret. Placer inhalations ansigtsmaske på rotter og give en strømningshastighed på 2% Sevofluran for at opretholde anæstesi. Tjek for den manglende reaktion på en tå knivspids.</li>
	<li>Brug en øjen beskyttelses salve til at forhindre tørring af hornhinden og beskadigelse.</li>
	<li>Overvåge dyret under generel anæstesi som følger: Placer et rektal termometer (35.9-37,5 °C), Kontroller slimhindens farve, og Placer en gnaver pulsoximeter for at kontrollere for O2 mætning (> 95%) puls (250 – 450 bpm).</li>
	<li>Brug en varme støtte (elektriske varmepuder eller cirkulerende vand tæpper) for at undgå hypotermi og forbedre post-proceduremæssig anæstesi opsving.</li>
	<li>Injicer 5 mL varm subkutan fysiologisk saltvandsopløsning for at opretholde korrekt hydrering.</li>
	<li>Give analgetiske og anti-inflammatoriske lægemidler (meloxicam 1 mg/kg/dag) og profylaktisk antibiotika (enrofloxacin 7,5 mg/kg/dag) subkutant før proceduren og for 5 dage postoperativt.</li>
	<li>Barbering dyrets abdominale og inginal områder.</li>
	<li>Påfør aktuel povidon-jod, efterfulgt af 70% ethanol. Dæk dyret med et sterilt Drape.</li>
</ol>2. gratis hud flap model kirurgi
<ol><li>Ved hjælp af en kirurgisk markør, tegne en 3 cm x 6 cm flap matchende en af de 6 cm sider med maven midterlinjen. Dernæst gøre en 6 cm hud indsnit i midterlinjen af maven og to vinkelret 3 cm indsnit i den øvre og nedre del af 6 cm midterlinje indsnit.</li>
	<li>For at starte dissekting den designede 3 cm x 6 cm hudklap, brug saks og Adson tang til at hæve klappen (snarere end en skalpel) på grund af hudens mobilitet.</li>
	<li>Træk forsigtigt flappen fra kranie området mod hale området for at hjælpe med dissektion og Identificer den epigastriske pedile omgivet af det rigelige løse bindevæv.</li>
	<li>Dissekere klappen pedile uden at røre den eller ved at gribe den adventitia så lidt som muligt for at undgå at beskadige beholderen væggen.</li>
	<li>Brug 8/0 nylon suturer til at tage de proksimale, femorale kar, laterale circumflex femorale kar og saphenøse fartøjer. Derved leveres perfusion af flappen af femoral arterien og fortsætter direkte gennem den overfladiske hale epigastriske arterie, mens den venøse dræning udføres af den overfladiske hale epigastriske vene mod femoral vene.</li>
	<li>Klemme den vaskulære pedile og derefter skære det til at starte 8 h iskæmi periode. Under proceduren bruge elektriske tæpper til at opretholde temperaturen. To 5 ml injektioner med varm (25 °C) 0,9% saltvandsopløsning administreres subkutant. Den første administration udføres 2 h efter begyndelsen af proceduren; og den anden ved afslutningen af proceduren for at opnå en ordentlig genopretning af dyret.</li>
	<li>Brug hepariniseret saltvandsopløsning (100 U/mL) til at perfuse flappen og fjerne det stagnerende blod fra mikrocirkulationen.</li>
	<li>Brug 10/0 nylon suturer til at udføre de mikrokirurgiske anastomoser.</li>
	<li>Efter 8 h af iskæmi, reperfuse klap ved at fjerne de microvaskulære klemmer og kontrollere den vaskulære patency som beskrevet nedenfor.</li>
</ol>3. intraoperativ vurdering
<ol><li>Udfør en manuel test af patency (Tøm og genopfyldnings test) for vene og arterien. For at gøre dette, skal du bruge to mikrokirurgisk pincet, placere dem distale til anastomose og udføre malkningen. Frigør den nærmeste pincet til anastomose stedet først. Hvis blodgennemstrømningen fortsætter efter en vaskulær sektion er tømt, så anastomose er patent.</li>
	<li>Vurdere blodgennemstrømningen ved hjælp af en transit-tid ultralyd flow meter og mikrokirurgiske sonder.
	<ol>
<li>Mål diameteren af pedile fartøjerne for at vælge den korrekte størrelse for strømnings sonder. Bemærk: En 0,7 mm flow sonde kan måle fartøjer, der spænder fra 0,4 mm til 0,7 mm; en 1,0 mm flow sonde kan måle fartøjer, der spænder fra 0,7 mm til 1,0 mm; en 1,5 mm flow sonde kan måle fartøjer, der spænder fra 1,0 mm til 1,5 mm.</li>
		<li>Placer målbeholderen i ultralyds detekterings vinduet (mellem reflektoren og transducerne) på strømnings sonden for at kvantificere strømnings volumenet. Bemærk: Hold sonden neutral i forhold til fartøjets plan for at undgå spændinger eller træk.</li>
		<li>Kontroller kvaliteten af den akustiske kobling ved at observere, at alle søjlerne er grønne på displayet. Bemærk: Hvis det er svært at få god akustisk kobling, brug ultralyds gel eller fysiologisk saltvandsopløsning topisk.</li>
		<li>Når der opnås en god kobling, og beholderen anbringes i det akustiske vindue uden spændinger, skal du klikke på Optag -knappen på displayet for at gemme dataene. Bemærk: For at opnå en pålidelig og korrekt måling skal du sørge for, at bølgeform mønsteret konstant kan gentages.</li>
	</ol></li>
	<li>Når det er gjort, brug Polyglycolsyre (PGA) 4-0 absorberbare flettet suturer (16mm 3/8 trekantet nål) for at lukke huden. Brug et simpelt afbrudt mønster til at opretholde styrke og vævs position, hvis en del af suturen er bidt af rotter postoperativt.</li>
	<li>Vurder klappen i mikrocirkulationen ved hjælp af laser speckle Contrast-analyse (LASCA).
	<ol>
<li>Lav en ny optagelse for hvert dyr og for hver opfølgning af studiet. Til dette, klik på fil/ny optagelse. Der åbnes et nyt vindue, og opsætningspanelet vises. Rediger derefter oplysningerne for projektets navn, emne, operatør og optagelses navn.</li>
		<li>For at opnå maksimal reproducerbarhed, standardisere følgende parametre: arbejdsdistance, måleområde, punkt tæthed, billedhastighed og omgivende lysforhold.<ol>
<li>Juster arbejdsafstanden ved at flytte laseren i forhold til vævet. Zoom ind eller ud laserhovedet mod væv af interesse. Klik på billed opsætningfor at kontrollere den målte værdi. Her, sat til 12,0 cm.</li>
			<li>Standardiser måleområdet ved at indtaste den ønskede bredde og højde ved billed opsætningen. Den designede flap måler 3 cm x 6 cm. Til denne måling skal du vælge en bredde på 4,0 cm og en højde på 7,0 cm for at have lidt ekstra plads.</li>
			<li>Indstil punkt tætheden så højt i billed opsætningen. Høj, medium og lav er de tre muligheder.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ved Opsætning af billedoptagelse skal du vælge billed hastigheden (10 billeder/s) for optagelsen og varig heden (1 min) af optagelsen. Bemærk: Har samme omgivende lysforhold i operationsstuen, mens de opererer eller udfører vurderingerne.</li>
		<li>Klik på knappen Optag for at starte optagelsen. Opsætningspanelet erstattes af optage panelet. Data gemmes automatisk. Tag Snapshots under proceduren for at muliggøre yderligere sammenligning. Bemærk: Perfusions skalaen kan ændres for at forbedre visualiseringen (Klik på værktøjer | Filtre og farveskalaer | Perfusions skala | Manual 0-150), men de målte perfusions værdier vil ikke blive påvirket. Før og efter optagelsen, kan forskellige områder af interesse (ROIs) oprettes for at måle perfusion i dem. Her vurderede vi kun området for den praktiserede klap (3 cm x 6 cm).</li>
	</ol></li>
	<li>Brug ImageJ software til at måle overlevelses-og nekrose områderne.
	<ol>
<li>Find en lineal på siden af flappen, og Tag kontrol billeder til makroskopiske målinger af flap overlevelses området.</li>
		<li>Hvis du vil evaluere billeder, skal du åbne ImageJ-brugergrænsefladen. Klik på filer , og Åbn det billede, der skal måles.</li>
		<li>Vælg lige linje i værktøjskassen og tegn en lige linje over 1 cm af linealen. Klik på analysér | Indstil skala og introducere i tekstfeltet for kendt afstand værdien af 1 cm.</li>
		<li>Klik på polygon markeringsværktøjet og træk polygon linjerne over flappen for at beregne det levedygtige område. I sidste ende, klik på analysér | Foranstaltning for at opnå arealværdien.</li>
	</ol></li>
	<li>Placer en postoperative dressing på dyret før huset for at forhindre selv-lemlæstelse af det kirurgiske område. Efter procedurerne anbringes dyrene i bure enkeltvis i et rum med temperaturkontrol (22 °C til 25 °C).</li>
</ol>4. postoperativ vurdering og vævs prøvetagning
<ol><li>Anæstetize rotten ved 7 postoperative dage for flap vurdering og vævs prøvetagning ved at følge de samme trin, der tidligere er beskrevet i denne protokol (trin 1,2 og 1,3). Check for dybden af anæstesi ved manglende reaktion på tåen knivspids.</li>
	<li>Fotografere operationsområdet for at muliggøre makroskopiske målinger af klappen overlevelse og nekrose områder. Foretage de postoperative makroskopiske målinger efter de samme trin i den intraoperativ vurdering, som tidligere er forklaret i protokollen (trin 3,5). Bemærk: Vær opmærksom, mens du bruger polygon markeringsværktøjet ved at trække linjerne på klappen, som afgrænser det levedygtige område (målt i cm2). Procentdelen af det levedygtige areal kan beregnes som (cm2 af levedygtige areal/cm2 af samlede flap område) × 100.</li>
	<li>Vurder klappen i mikrocirkulationen ved hjælp af LASCA-teknikken (trin 3,4) for at visualisere og kvantificere perfusions forskelle</li>
	<li>Efter den makroskopiske analyse, fjerne 4/0 suturer og stige klap til at revurdere den vaskulære pedile blodgennemstrømning ved hjælp af transit-tid ultralyd.</li>
	<li>
Udfør vævs prøvetagning ved at dividere flappen i længderetningen i to dele på 1,5 cm x 6 cm.
	<ol>
<li>Sænk den ene del i en biopsi beholder med 4% PARAFORMALDEHYD ved stuetemperatur for yderligere histologiske analyser.</li>
		<li>Indfør den anden del af vævet i et kryopreserverings slange, Sænk den i flydende nitrogen, og kryopreserver derefter røret ved at opbevare det ved-80 °C for fremtidige molekylære analyser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanize rotten under generel inhalations anæstesi ved hjælp af en hurtig intrakardiel injektion af 2 M KCl/kg ifølge etiske komité anbefalinger.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Siemionow, M., Arslan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia/reperfusion+injury:+a+review+in+relation+to+free+tissue+transfers.">Ischemia/reperfusion injury: a review in relation to free tissue transfers.</a> Microsurgery. 24 (6), 468-475 (2004).</li><li>Wang, W. Z., Baynosa, R. C., Zamboni, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+ischemia-reperfusion+injury+for+the+plastic+surgeon:+2011.">Update on ischemia-reperfusion injury for the plastic surgeon: 2011.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (6), 685-692 (2011).</li><li>Chen, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+presentation+of+the+first+signs+of+vascular+compromise+dictates+the+salvage+outcome+of+free+flap+transfers.">Timing of presentation of the first signs of vascular compromise dictates the salvage outcome of free flap transfers.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 120 (1), 187-195 (2007).</li><li>Sears, E. D., Chung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replantation+of+finger+avulsion+injuries:+a+systematic+review+of+survival+and+functional+outcomes.">Replantation of finger avulsion injuries: a systematic review of survival and functional outcomes.</a> The Journal of Hand Surgery. 36 (4), 686-694 (2011).</li><li>Caterson, E. J., Lopez, J., Medina, M., Pomahac, B., Tullius, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+injury+in+vascularized+composite+allotransplantation.">Ischemia-reperfusion injury in vascularized composite allotransplantation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 24 (1), 51-56 (2013).</li><li>Amin, K. R., Wong, J. K. F., Fildes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+Reduce+Ischemia+Reperfusion+Injury+in+Vascularized+Composite+Allotransplantation+of+the+Limb.">Strategies to Reduce Ischemia Reperfusion Injury in Vascularized Composite Allotransplantation of the Limb.</a> The Journal of Hand Surgery. 42 (12), 1019-1024 (2017).</li><li>Barre-Sinoussi, F., Montagutelli, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+are+essential+to+biological+research:+issues+and+perspectives.">Animal models are essential to biological research: issues and perspectives.</a> Future Science OA. 1 (4), (2015).</li><li>Shaughness, G., Blackburn, C., Ballestin, A., Akelina, Y., Ascherman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Thrombosis+Formation+in+1-mm-Diameter+Arterial+Anastomoses+with+Transit-Time+Ultrasound+Technology.">Predicting Thrombosis Formation in 1-mm-Diameter Arterial Anastomoses with Transit-Time Ultrasound Technology.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (6), 1400-1405 (2017).</li><li>Ballestin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+injury+in+a+rat+microvascular+skin+free+flap+model:+A+histological,+genetic,+and+blood+flow+study.">Ischemia-reperfusion injury in a rat microvascular skin free flap model: A histological, genetic, and blood flow study.</a> PloS One. 13 (12), 0209624 (2018).</li><li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Arterial+Anatomy+of+the+Murine+Hindlimb:+Functional+Role+in+the+Design+and+Understanding+of+Ischemia+Models.">Characterization of the Arterial Anatomy of the Murine Hindlimb: Functional Role in the Design and Understanding of Ischemia Models.</a> PloS One. 8 (12), (2013).</li><li>Smit, J. M., Zeebregts, C. J., Acosta, R., Werker, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+free+flap+monitoring+in+the+last+decade:+a+critical+review.">Advancements in free flap monitoring in the last decade: a critical review.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (1), 177-185 (2010).</li><li>Krag, C., Holck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+the+patency+test+in+microvascular+anastomosis:+Correlation+between+observed+patency+and+size+of+intraluminal+thrombus:+An+experimental+study+in+rats.">The value of the patency test in microvascular anastomosis: Correlation between observed patency and size of intraluminal thrombus: An experimental study in rats.</a> British Journal of Plastic Surgery. 34, 64-66 (1981).</li><li>Selber, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+study+of+transit-time+flow+volume+measurement+for+intraoperative+evaluation+and+optimization+of+free+flaps.">A prospective study of transit-time flow volume measurement for intraoperative evaluation and optimization of free flaps.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (2), 270-281 (2013).</li><li>Briers, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+speckle+contrast+imaging:+theoretical+and+practical+limitations.">Laser speckle contrast imaging: theoretical and practical limitations.</a> Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066018 (2013).</li><li>Zotterman, J., Bergkvist, M., Iredahl, F., Tesselaar, E., Farnebo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+partial+and+full+venous+outflow+obstruction+in+a+porcine+flap+model+using+laser+speckle+contrast+imaging.">Monitoring of partial and full venous outflow obstruction in a porcine flap model using laser speckle contrast imaging.</a> Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 69 (7), 936-943 (2016).</li><li>Zotterman, J., Tesselaar, E., Farnebo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+laser+speckle+contrast+imaging+to+predict+flap+necrosis:+An+experimental+study+in+a+porcine+flap+model.">The use of laser speckle contrast imaging to predict flap necrosis: An experimental study in a porcine flap model.</a> Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 72 (5), 771-777 (2019).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Mikrokirurgiske frie vævs overførsler er blevet den foretrukne metode til genopbygning af store defekter. En periode med iskæmi opstår under sådanne gratis vævs overførsler. Når denne periode overstiger vævs tolerance, kan I/R skade forårsage svigt af den praktiserede fri klap9. Beskrivelsen af metodologien til udvikling af en omkostningseffektiv og translationel præklinisk model til undersøgelse i/R skade i rekonstruktiv mikrokirurgi kan bidrage til at lede studiet af forskellige forbindelser til at modvirke denne patofysiologiske proces.
I den beskrevne dyremodel, efter at de vaskulære ligaturer blev placeret og den frie klap blev hævet, ingen baglemmer Blood flow kompromiser blev noteret, heller ikke smerte eller Limp. Som Kochi et al.10 beskrevet, efterlod vores model også tre sikkerheds ruter gennem intramuskulære netværk.
Overvågning af gratis flapper er af stor betydning11, da bjærgning er omvendt relateret til varigheden mellem iskæmi debut og dens kliniske anerkendelse. Til dette formål bør gratis flapper undersøgt intra-og postoperativt.
Intraoperativt, den udbredte tomme og genopfyldnings test eller den akustiske Doppler muliggør identifikation, men ikke kvantificering af flow tilstedeværelse eller fravær gennem en anastomose12. Af denne grund brugte vi transit-time ultralyd teknologi, en ny metode, der tillader kirurger at kvantificere blodstrømmen af mikrokirurgisk anastomoser13. I vores undersøgelse, alle mikrokirurgisk anastomoser var patent efter 8 h af iskæmisk fornærmelse såvel som i slutningen af undersøgelsen. Umiddelbart efter oprettelsen af de mikrokirurgisk anastomoses bemærkede vi højere blodgennemstrømning end det anbefalede minimumsantal i litteratur8. Denne forudsagte god pedile perfusion i slutningen af undersøgelsen, viser, at resultaterne ikke var påvirket af den mikrokirurgiske teknik, men snarere af I/R skade kaskade af hændelser. Men denne teknik er ikke fri for begrænsninger. For at opnå pålidelige resultater skal de mikrokirurgiske sonder holdes neutrale i forhold til fartøjets plan, ikke trække det eller skabe spændinger. En god akustisk kobling er nødvendig for at opnå et korrekt signal, som kan opnås ved hjælp af ultralyd gel eller saltvand. Et koblings signal af høj kvalitet, der leveres af udstyret, er en vigtig parameter at overveje under målingerne.
Vi har brugt LASCA, også kendt som laser speckle Contrast Imaging eller laser speckle Imaging, postoperativt14. Denne teknologi repræsenterer en værdifuld teknik til semi-kvantitativ real-time kortlægning af flow inden for gratis flapper som verificeret her. En af begrænsningerne er, at resultaterne leveres i vilkårlige enheder og ikke direkte relateret til faktiske flowværdier. I denne forstand, yderligere forskning er nødvendig for at validere denne sammenhæng. Laser Doppler flowmetry er mere almindeligt anvendt, men begrænset af det faktum, at det kun måler perfusion i et enkelt punkt i klap, mens LASCA tillader påvisning af regionale ændringer i huden perfusion inden for klap15. Endvidere indikerede en nylig undersøgelse16 , at lasca kan forudsige regionerne med høj risiko for postoperativ flap nekrose. Vores resultater tyder på, at LASCA er en lovende teknik til den peri-og postoperative overvågning af gratis flaps.

Mikrokirurgi er blevet en fælles kirurgisk teknik til genopbygning, der giver mulighed for interventioner (f. eks gratis væv overførsler) for at genoprette komplekse vævs defekter, replantation af amputerede lemmer, og selv komposit væv allotransplantationer.
Mikrokirurgiske rekonstruktioner er ideelle til en bred vifte af defekter forårsaget af traumatiske skader, forbrændinger eller onkologiske resections. Men, der er en lav procentdel af gratis klap fiasko, blandt hvilke ischemia-reperfusion (I/R) skade er en af de vigtigste ansvarlige faktorer. Alle mikrosurt overførte væv udholde en obligatorisk periode med iskæmi efterfulgt af reperfusion. Denne periode af primær iskæmi er normalt veltolereret; således, succesraten for mikrokirurgiske procedurer overstiger 90%1,2. Men kun 63,7% af flapper kræver kirurgisk revision kan være helt gemt3. Hertil kommer, i tilfælde af replantation af finger avulsionsfrakturer skader, succesraten er 66%4; og i tilfælde af sammensatte vævs når, der lider i/r-skade, øges afvisningsprocenterne, da i/r-skaden aktiverer medfødte immunitet5,6.
Derfor er studiet af dette patofysiologiske fænomen af interesse. Dyremodeller er afgørende for at undersøge fysiologiske mekanismer og vurdere nye terapier, før det kan anvendes på mennesker7. Fartøjs anatomi og de fysiologiske ligheder mellem rotter og mennesker gør rotter til en ideel model til undersøgelse af biologiske processer såsom I/R-skade.
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til oprettelse af en rotte fri hud flap model med I/R skade, samt forskellige muligheder for intra-og postoperative vurderinger. Det overordnede mål med denne metode er at beskrive en brugbar præklinisk model til at studere I/R skade og mulige behandlinger for at reducere dens relaterede skader.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:681px;" width="681">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">AureFlo Unit</td>
			<td style="width:121px;">Transonic (Ithaca, USA)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Transit-time ultrasound flowmeter equipment</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle)</td>
			<td style="width:121px;">S&#38;T AG (Neuhausen, Switzerland)</td>
			<td style="width:161px;">RHR-SET. Art.No.00795</td>
			<td>Set of microsurgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">FLOW-i</td>
			<td style="width:121px;">Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Anesthesia Delivery System</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Micro clamps ABB-1</td>
			<td style="width:121px;">S&#38;T AG (Neuhausen, Switzerland)</td>
			<td style="width:161px;">00408V</td>
			<td>Double microvascular clamp with frame</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Micro clamps ABB-11</td>
			<td style="width:121px;">S&#38;T AG (Neuhausen, Switzerland)</td>
			<td style="width:161px;">00414V</td>
			<td>Double microvascular clamp without frame</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Micro clamps B-1</td>
			<td style="width:121px;">S&#38;T AG (Neuhausen, Switzerland)</td>
			<td style="width:161px;">00396V</td>
			<td>Sigle microvascular clamp</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:232px;">Nylon suture 10/0</td>
			<td style="width:121px;">Laboratorio Arag&#243; (Barcelona, Spain)</td>
			<td style="width:161px;">19921</td>
			<td>Microsurgical suture</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">OPMI Pentero 800</td>
			<td style="width:121px;">Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Surgical microscope</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">PeriCam PSI System</td>
			<td style="width:121px;">Perimed AB (J&#228;rf&#228;lla, Sweden)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Laser speckle contrast analysis equipment</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:232px;">Philips Intellivue MX450</td>
			<td style="width:121px;">Philips Medizin Systeme (B&#246;blingen, Germany)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Monitoring system</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:232px;">Protector posoperatorio para roedores</td>
			<td style="width:121px;">Fundaci&#243;n Centro de Cirug&#237;a de M&#237;nima Invasi&#243;n Jes&#250;s Us&#243;n (C&#225;ceres, Spain)</td>
			<td style="width:161px;">P201400272</td>
			<td>Postoperative protector for rodents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pre-clinical rat model for the study of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery

Iskæmi-reperfusion skade er den vigtigste årsag til flap fiasko i rekonstruktiv mikrokirurgi. Rotten er den foretrukne prækliniske dyremodel i mange områder af biomedicinsk forskning på grund af dens omkostningseffektivitet og dens oversættelse til mennesker. Denne protokol beskriver en metode til at oprette en præklinisk fri hud flap model i rotter med iskæmi-reperfusion skade. Den beskrevne 3 cm x 6 cm rotte gratis hud flap model er let opnås efter placeringen af flere vaskulære ligaturer og den del af den vaskulære pedile. Derefter, 8 h efter den iskæmiske fornærmelse og færdiggørelse af den mikrokirurgisk anastomose, den frie hud flap udvikler vævsskader. Disse skader relateret til ischemia-reperfusion kan undersøgt i denne model, hvilket gør det til en egnet model til evaluering af terapeutiske agenser til at løse denne patofysiologiske proces. Desuden er to hoved overvågningsteknikker beskrevet i protokollen til vurdering af denne dyremodel: ultralydsteknologi til transittid og analyse af laser speckle-kontrast.

Umiddelbart efter oprettelsen af mikrokirurgisk anastomoses opnåede vi højere blodgennemstrømning end de minimums strømme, som anbefales i litteraturen8; således var alle mikrokirurgiske anastomoser patent 1 uge efter operationen (figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60292/60292fig1.jpg"> Figur 1: evaluering af ultralyds blodgennemstrømningen i transit tiden. (A) placeringen af den mikrokirurgiske strømnings sonde for at vurdere blodgennemstrømningen. B) blodgennemstrømning og kvantificering af de anastomoserede fartøjer i klap huset. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60292/60292fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Observation af mikrocirkulatorisk fratagelse af blodgennemstrømning under den iskæmiske fornærmelse var muligt med LASCA-teknikken, herunder den umiddelbare hyper perfusion under flap reperfusion, og, perioperativt, de forskellige områder med mindre perfusion og en højere risiko for postoperative flap nekrose, der var faktisk nekrotiseret 7 dage efter afslutningen af undersøgelsen (figur 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60292/60292fig2.jpg"> Figur 2: laser speckle kontrast analyse teknologi. (A) visualisering af mikrocirkulatorisk vævs blod perfusion i den fysiologiske tilstand. (B) visualisering af mikrocirkulatorisk vævs blod perfusion under iskæmi. C) visualisering af mikrocirkulatorisk vævs blod perfusion umiddelbart efter reperfusion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60292/60292fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Flappen overlevelses området efter 8 h af iskæmi og dets efterfølgende reperfusion var omkring 40%. Tidligere offentliggjorte resultater9 viste statistisk signifikante forskelle, da denne model blev sammenlignet med flapper, hvor der ikke blev påført nogen iskæmisk fornærmelse.

Watch this Scientific Journal Video about A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery at JoVE.com

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Her beskriver vi en præklinisk dyremodel for at studere patofysiologien af iskæmi-reperfusion skade i rekonstruktiv mikrokirurgi. Denne gratis hud flap model baseret på de overfladiske hale epigastriske fartøjer i rotter kan også give mulighed for evaluering af forskellige terapier og forbindelser til at modvirke iskæmi-reperfusion skade-relaterede skader.

En præklinisk rotte model for studiet af iskæmi-reperfusion skade i rekonstruktiv mikrokirurgi

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Iskæmi-reperfusion skade er den vigtigste årsag til flap fiasko i rekonstruktiv mikrokirurgi. Denne video beskriver en præklinisk dyremodel til studiet af denne patofysiologi. Denne gratis hud flap model baseret på de overfladiske caudal epigastriske fartøjer i rotten kan gøre det muligt at evaluere forskellige behandlinger og forbindelser til at modvirke iskæmi-reperfusion skade relaterede skader.Mikrokirurgiske rekonstruktioner er ideelle til en lang række defekter. Disse procedurer sikrer dog en obligatorisk periode af iskæmi efterfulgt af reperfusionen. Denne periode er normalt veltolereret, og succesraten for mikrokirurgiske procedurer overstiger 90%Men kun 73,7% af flapper, der kræver kirurgisk revision kan være helt sikker.I tilfælde af genplantning af finger avulsion skader, succesraten er omkring 60%, og i tilfælde af komposit væv re-transplantation, lider iskæmi-reperfusion skade fremskrivning procenter øges, da skaden aktiverer medfødte immunitet. Derfor er studiet af dette patofysiologiske fænomen af interesse. For at begynde denne procedure, bruge en kirurgisk markør til at tegne en tre centimeter med seks centimeter flap, og sørg for, at en af de seks centimeter sider matcher maven midterlinjen.Dernæst lave en seks centimeter hud snit på midterlinjen af maven, to vinkelret tre centimeter snit, samt en af seks centimeter parallelt med det første snit. For at begynde at dissekere den udpegede hudflap skal du bruge en saks og Adson-vicess til at hæve flappen. Træk forsigtigt flappen ud af kranieområdet mod haleområdet.Disseker flappen pedicle uden at røre ved det eller ved at gribe adventitia så lidt som muligt for at undgå at beskadige karvæggen. Brug 8-0 nylonsuturer til at okkludere ved ligaturer saphenous fartøjer, lateral circumflex femorale fartøjer, og den proksimale hale femorale fartøjer. Klem den vaskulære pedicle og derefter skære det til at starte de otte timer iskæmi periode.Brug hepariniseret saltvandsopløsning til at gennemgå flappen, og fjern derefter det stillestående blod fra mikrocirkulationen. Brug 10-0 nylonsuturer til at udføre de mikrokirurgiske anastomoses. Efter otte timers iskæmi, reperfuse flappen ved at fjerne de mikrovaskulære klemmer, og kontrollere den vaskulære patency.Først skal du vurdere blodgennemstrømningen ved hjælp af et transittids ultralydflowmeter og mikrokirurgiske sonder. Anbring målbeholderen i strømningssondens ultralydsfølervindue for at kvantificere flowvolumen. Når god kobling er opnået, og fartøjet er placeret i det akustiske vindue uden spænding, skal du klikke på optageknappen på displayet for at gemme dataene.Efter dette, bruge 4-0 absorberbare suturer til at lukke huden. For at vurdere flappens mikrocirkulation, skal du bruge laserspeckle kontrastanalyse. Lav en ny optagelse for hver prøve og for hver opfølgende undersøgelse ved at klikke på fil, ny optagelse.Der åbnes et nyt vindue, som viser opsætningspanelet. Her kan du redigere oplysningerne for projektnavnet, emnet, operatøren og optagelsesnavnet. Juster arbejdsafstanden ved at flytte laseren i forhold til vævet.Zoom laserhovedet ind eller ud mod det væv af interesse. I billedopsætningen skal du standardisere måleområdet ved at indtaste den ønskede bredde og højde. Indstil punkttætheden til høj.Ved opsætningen af billedoptagelse skal du vælge billedhastigheden og varigheden for optagelsen. Klik derefter på optageknappen for at starte optagelsen. Opsætningspanelet erstattes af optagelsespanelet, og data gemmes automatisk.Tag snapshots under proceduren for at muliggøre yderligere sammenligning. Derefter skal du bruge ImageJ-software til at måle overlevelses- og nekroseområderne ved først at placere en lineal på flappens sted og tage kontrolbilleder til makroskopisk måling. Vælg lige linje i værktøjskassen ImageJ, og tegn en linje over en centimeter af linealen.Klik på analysér, sæt skala, og angiv værdien på en centimeter i tekstboksen for kendt afstand. Klik på polygonmarkeringsværktøjet og tegn polygonlinjerne over flappen for at beregne det levedygtige område. Klik på analysere, måle for at opnå området værdi.Derefter placere en postoperativ dressing på dyret før opbopning for at forhindre selv-lemlæstelse. Syv dage efter operationen, fotografere det kirurgiske område for at muliggøre makroskopiske målinger af flappen overlevelse og nekrose områder. Ved hjælp af den tidligere beskrevne laserspekkelkontrastanalyseteknik visualiseres og kvantificere perfusionsforskelle for at vurdere flappens mikrocirkulation.Efter den makroskopiske analyse fjernes 4-0 suturerne, klapen hæves, og der anvendes ultralyd fra transittiden til at revurdere den vaskulære pedicle blodgennemstrømning. Udfør vævsprøvetagning ved langsgående at opdele flappen i to dele, der måler 1,5 centimeter med seks centimeter. Umiddelbart efter oprettelsen af de mikrokirurgiske anastomoses opnåede vi højere blodgennemstrømningsværdier end de minimumstrømsstrømme, der anbefales i litteraturen.Således var alle mikrokirurgiske anastomoses patent en uge efter operationen. Observation af den mikrokrekkulerende depravation af blodgennemstrømningen under den iskæmiske fornærmelse var mulig med laser speckle kontrast analyse teknik. Dette omfatter den umiddelbare hyperperfusion under flappen reperfusion og perioperatively, de forskellige områder med mindre perfusion havde en højere risiko for postoperativ flap nekrose, der faktisk blev nekrotiseret syv dage efter afslutningen af undersøgelsen.Flappen overlevelse område efter otte timers iskæmi og dens efterfølgende reperfusion var omkring 40%Tidligere offentliggjorte resultater viser statistisk signifikante forskelle, når denne model sammenlignes med flapper, hvor ingen iskæmisk fornærmelse er påført. Husk at dissekere flappen pedicle uden at røre ved det eller ved at gribe utilsigtet så lidt som muligt for at undgå at beskadige karvæggen, samt udføre ordentlig mikrokirurgiske anastomoses for at undgå komplikationer på grund af den kirurgiske teknik. Intraoperativt, transit-tid ultralyd teknologi giver os mulighed for at kvantificere blodgennemstrømningen af mikrokirurgiske anastomoses og dermed forudsige flap perfusion.Postoperativt, laser speckle kontrast analyse giver en semi-kontinuitet i real-time kortlægning af flow inden for frie flapper. Det er en lovende teknik, men der er behov for yderligere forskning. Denne video har beskrevet protokollen for en egnet model til evaluering af terapeutiske midler til at modvirke iskæmi-reperfusion skade inden for rekonstruktiv mikrokirurgi.

Research

JoVE Journal

Medicine

Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

In situ Transverse Rectus Abdominis Myocutaneous Flap: A Rat Model of Myocutaneous Ischemia Reperfusion Injury

In situ Transverse Rectus Abdominis Myocutaneous Flap: A Rat Model of Myocutaneous Ischemia Reperfusion Injury

In situ Tværgående Rectus abdominis Myocutaneous Flap: En Rat Model of Myocutaneous iskæmisk reperfusionsbeskadigelse

Free tissue transfer is the gold standard of reconstructive surgery to repair complex defects not amenable to local options or those requiring composite ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Iskæmireperfusion Model akut nyreskade og Post Injury Fibrose i mus

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

En murin model af myokardieiskæmi-reperfusionsskade gennem æggelederne for Venstre Anterior Faldende Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induktion og vurdering af iskæmi-reperfusion skade i Langendorff-perfusionerede rottehjerter

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murin model af intestinal iskæmi-reperfusionsskade

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

En mus Model of retinaiskæmi-reperfusionsskade Gennem Elevation af intraokulært tryk

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Induktion Iskæmi-reperfusionsskade i mus Øre Skin for Intravital multifotonexcitation Imaging af immunrespons

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Evaluering af koronar flow reserve efter myokardieiskæmi reperfusion hos rotter

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Modificeret Heterotopic Bagekstremitet Osteomyokutane flap model i rotte for Translationel vascularized komposit Allotransplantation forskning

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...