Name: a pre-clinical rat model for the study of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery
Uploaded: 2019-11-08T14:00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery at JoVE.com

Het onderzoeksproject werd uitgevoerd in het minimaal invasieve chirurgie centrum van Jesús Usón (CCMIJU), onderdeel van de ICTS Nanbiosis. De studie werd uitgevoerd met hulp van de volgende Nanbiosis-eenheden: U21, experimentele operatiekamer; U22, huisvesting van dieren; en U14, celtherapie. Dit werk werd ondersteund door ISCIII project PI16/02164. De Funder had geen rol in het studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit om te publiceren of manuscript voorbereiding. Speciale dank gaat uit naar María Pérez voor de voorbereiding van de cijfers en naar Fernanda Carrizosa voor voortdurende aanmoediging en ondersteuning van de wetenschappelijke bibliografie.

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische commissie van het minimaal invasieve chirurgie centrum van Jesús Usón en de welzijns richtlijnen van de regionale overheid die gebaseerd zijn op Europese wetgeving.
1. presurgische en chirurgische voorbereiding
<ol><li>Huis Wistar ratten met een gewicht van 290 – 350 g in kooien bij 22 – 25 °C met gratis toegang tot voedsel en water. Acclimate voor 1 week voorafgaand aan de operatie om stress-geïnduceerde problemen te voorkomen.</li>
	<li>Plaats een rat in een anesthetische inductie kamer, lever 5 minuten zuurstof (0,5-1 L/min) en gebruik een vaporizer om 5% Sevofluraan te leveren om anesthesie te induceren.</li>
	<li>Neem de rat uit de kamer zodra anesthesie wordt geïnduceerd. Plaats het inhalatie gezichtsmasker op de rat en zorg voor een debiet van 2% Sevofluraan om anesthesie te handhaven. Controleer het gebrek aan reactie op een teen pinch.</li>
	<li>Gebruik een oogbeschermingzalf om het drogen van het hoornvlies en beschadiging te voorkomen.</li>
	<li>Bewaak het dier onder algemene verdoving als volgt: plaats een rectale thermometer (35,9 – 37,5 °C), Controleer de kleur van het slijmvlies en plaats een knaagdieren puls-Oximeter om te controleren op de verzadiging van de O2 (> 95%) en hartslag (250 – 450 BPM).</li>
	<li>Gebruik een warmte-ondersteuning (elektrische verwarming pads of circulerende water dekens) om hypothermie te voorkomen en verbetering van de post-procedurele anesthesie herstel.</li>
	<li>Injecteer 5 mL warme subcutane fysiologische zoutoplossing om de juiste hydratatie te behouden.</li>
	<li>Bieden pijnstillende en ontstekingsremmende geneesmiddelen (Meloxicam 1 mg/kg/dag) en profylactische antibiotica (enrofloxacine 7,5 mg/kg/dag) subcutaan vóór de ingreep en gedurende 5 dagen postoperatief.</li>
	<li>Scheer de buik-en inguinale gebieden van het dier.</li>
	<li>Breng actuele Povidon-jodium, gevolgd door 70% ethanol. Bedek het dier met een steriele Drape.</li>
</ol>2. gratis huid klep model chirurgie
<ol><li>Teken met een chirurgische marker een flap van 3 cm x 6 cm die overeenkomt met een van de 6 cm zijden met de buik middenlijn. Vervolgens, maak een 6 cm huid incisie op de middenlijn van de buik en twee loodrecht 3 cm incisies in het bovenste en onderste deel van de 6 cm middellijn incisie.</li>
	<li>Om te beginnen met het ontleden van de ontworpen huid flap van 3 cm x 6 cm, gebruikt u een schaar en een Adson-tang om de klep (in plaats van een scalpel) te verhogen vanwege de mobiliteit van de huid.</li>
	<li>Trek voorzichtig de flap van het schedel gebied naar het caudale gebied om te helpen met de dissectie en Identificeer de epigastrische pedile omringd door het overvloedige losse bindweefsel.</li>
	<li>Ontleden de klepsteel zonder hem aan te raken of door de adventitia zo weinig mogelijk te grijpen om beschadiging van de wand van het vat te voorkomen.</li>
	<li>Gebruik 8/0 nylon hechtingen om te occluden door middel van ligaturen de proximale caudal femorale vaten, laterale circumflex femorale vaten en onderhoudende bloedvaten. Daardoor wordt de perfusie van de flap geleverd door de femorale slagader en gaat direct door de oppervlakkige caudal epigastrische slagader, terwijl de veneuze drainage wordt uitgevoerd door de oppervlakkige caudale epigastrische ader naar de femorale ader.</li>
	<li>Klem de vasculaire pedile en snijd het vervolgens om te beginnen de 8 h ischemie periode. Gebruik tijdens de procedure elektrische dekens om de temperatuur te behouden. Twee injecties van 5 ml warme (25 °C) 0,9% zoutoplossing worden subcutaan toegediend. De eerste toediening wordt uitgevoerd 2 h na het begin van de procedure; en de tweede aan het einde van de procedure om een goed herstel van het dier te verkrijgen.</li>
	<li>Gebruik gehepariniseerd zoutoplossing (100 U/ml) om de flap te parfuseren en het stagnerende bloed uit de microcirculatie te verwijderen.</li>
	<li>Gebruik 10/0 nylon hechtingen om de microchirurgische anastomoses uit te voeren.</li>
	<li>Na 8 h van ischemie, reparfuseer de flap door het verwijderen van de microvasculaire klemmen en controleer de vasculaire doorgankelijkheid zoals hieronder beschreven.</li>
</ol>3. intraoperatieve beoordeling
<ol><li>Voer een handmatige test van de testen uit (lege en navul test) voor de ader en slagader. Om dit te doen, gebruik twee microchirurgische Tang, plaats ze distale aan de anastomose en voer het melken. Laat eerst de dichtstbijzijnde Tang naar de anastomose-site. Als de bloedstroom voortduurt nadat een vasculaire sectie is geleegd, dan is de anastomose patent.</li>
	<li>Beoordeel de bloedstroom met behulp van een transit-time ultrasone flowmeter en microchirurgische sondes.
	<ol>
<li>Meet de diameter van de stekel vaten om de juiste maat voor de stromings voelers te kiezen. Opmerking: Een 0,7 mm stroom sonde kan schepen van 0,4 mm tot 0,7 mm meten; een 1,0 mm stroom sonde kan schepen van 0,7 mm tot 1,0 mm meten; een 1,5 mm stroom sonde kan schepen van 1,0 mm tot 1,5 mm meten.</li>
		<li>Plaats het doelvat in het Ultrasone detectie venster (tussen de reflector en de transducers) van de stromings sonde om het debiet volume te kwantificeren. Opmerking: Houd de sonde neutraal op het vlak van het vat, om elke spanning of trekken te voorkomen.</li>
		<li>Controleer de kwaliteit van de akoestische koppeling door te observeren dat alle staven groen op het display zijn. Opmerking: Als het moeilijk is om een goede akoestische koppeling te krijgen, gebruik dan topisch ultrasone gel of fysiologische zoutoplossing.</li>
		<li>Wanneer een goede koppeling wordt bereikt en het vat zonder spanning in het akoestische venster wordt geplaatst, klikt u op de opname knop op het display om de gegevens op te slaan. Opmerking: Om een betrouwbare en correcte meting te verkrijgen, moet u ervoor zorgen dat het golfvorm patroon voortdurend herhaalbaar is.</li>
	</ol></li>
	<li>Eenmaal gedaan, gebruik Polyglycolic acid (PGA) 4-0 absorbabele gevlochten hechtingen (16mm 3/8 driehoekige naald) om de huid te sluiten. Gebruik een eenvoudig onderbroken patroon om de sterkte en weefsel positie te behouden als een deel van de hecht wordt gebeten door de rat postoperatief.</li>
	<li>Evalueer de microcirculatie van de flap met behulp van laser spikkel contrast analyse (Lasca).
	<ol>
<li>Maak een nieuwe opname voor elk dier en voor elke follow-up van de studie. Klik hiervoor op bestand/nieuwe opname. Er wordt een nieuw venster geopend en het deelvenster Setup wordt weergegeven. Bewerk vervolgens de informatie van de projectnaam, het onderwerp, de operator en de opname naam.</li>
		<li>Voor maximale reproduceerbaarheid Standaardiseer de volgende parameters: werkafstand, meetgebied, puntdichtheid, framesnelheid en omgevingslicht.<ol>
<li>Pas de werkafstand aan door de laser in relatie tot het weefsel te verplaatsen. Zoom in of uit de laserkop naar het weefsel van belang. Klik op installatiekopie instellenom de gemeten waarde te controleren. Hier, ingesteld op 12,0 cm.</li>
			<li>Standaardiseer het meetgebied door de gewenste breedte en hoogte in te voeren bij het instellen van de afbeelding. De ontworpen flap meet 3 cm x 6 cm. Selecteer voor deze meting een breedte van 4,0 cm en een hoogte van 7,0 cm om wat extra ruimte te hebben.</li>
			<li>Stel de puntdichtheid zo hoog in de installatiekopiein. Hoog, gemiddeld en laag zijn de drie opties.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Selecteer bij de installatie kopie vastleggen de frame snelheid (10 afbeeldingen/s) voor de opname en de duur (1 min) van de opname. Opmerking: Dezelfde omgevingslicht conditie hebben in de operatiekamer tijdens het werken of uitvoeren van de Beoordelingen.</li>
		<li>Klik op de knop opnemen om de opname te starten. Het configuratie scherm wordt vervangen door het Opnamepaneel. Gegevens worden automatisch opgeslagen. Maak momentopnamen tijdens de procedure om verdere vergelijking mogelijk te maken. Opmerking: De perfusie schaal kan worden gewijzigd om visualisatie te verbeteren (Klik op extra | Filters en Kleurschalen | Perfusie schaal | Handmatig 0-150), maar de gemeten perfusie waarden zullen niet worden beïnvloed. Voor en na de opname kunnen verschillende interessegebieden (ROIs) worden gecreëerd om de perfusie binnen hen te meten. Hier hebben we alleen het gebied van de geoefende flap (3 cm x 6 cm) geëvalueerd.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik ImageJ-software om de overlevings-en necrose-gebieden te meten.
	<ol>
<li>Zoek een liniaal aan de zijkant van de flap en neem de controle Foto's voor macroscopische metingen van het overlevings gebied van de flap.</li>
		<li>Open de gebruikersinterface van ImageJ om Foto's te evalueren. Klik op bestand en Open de te meten afbeelding.</li>
		<li>Selecteer rechte lijn in de gereedschapsset en teken een rechte lijn over 1 cm van de liniaal. Klik op analyseren | Stel schaal in en introduceer in het tekstvak voor bekende afstand de waarde van 1 cm.</li>
		<li>Klik op het gereedschap Veelhoek selecteren en teken de veelhoek lijnen over de flap om het levensvatbare gebied te berekenen. Uiteindelijk, klik op analyseren | Maatregel om de waarde van het gebied te verkrijgen.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats een postoperatieve dressing op het dier vóór huisvesting om zelfverminking van het chirurgische gebied te voorkomen. Na de procedures worden dieren individueel ondergebracht in kooien, in een ruimte met temperatuurregeling (22 °C tot 25 °C).</li>
</ol>4. postoperatieve beoordeling en weefsel bemonstering
<ol><li>Anesthetiseer de rat op 7 postoperatieve dagen voor de flap beoordeling en weefsel bemonstering door het volgen van dezelfde stappen eerder beschreven in dit Protocol (stappen 1,2 en 1,3). Controleer op de diepte van de anesthesie door het gebrek aan reactie op de teen pinch.</li>
	<li>Fotografeer het chirurgische gebied om macroscopische metingen van de overlevings-en necrose gebieden van flap mogelijk te maken. Maak de postoperatieve macroscopische metingen volgens dezelfde stappen van de intraoperatieve beoordeling die eerder in het protocol zijn toegelicht (stap 3,5). Opmerking: Let op het gebruik van het gereedschap Veelhoek selecteren door de lijnen op de klep te tekenen die het levensvatbare gebied afbakent (gemeten in cm2). Het percentage van het levensvatbare gebied kan worden berekend als (cm2 van levensvatbare oppervlakte/cm2 van het totale flap gebied) × 100.</li>
	<li>Evalueer de microcirculatie van de flap met behulp van de LASCA-techniek (stap 3,4) om perfusie verschillen te visualiseren en te kwantificeren</li>
	<li>Na de macroscopische analyse, verwijder de 4/0 hechtingen en stijg de flap om de vasculaire pedile bloedstroom opnieuw te beoordelen met behulp van de transit-time echografie.</li>
	<li>
Voer weefsel bemonstering uit door de flap in de lengterichting te verdelen in twee delen van 1,5 cm x 6 cm.
	<ol>
<li>Dompel één deel in een biopsie container met 4% Paraformaldehyde bij kamertemperatuur voor verdere histologische analyses.</li>
		<li>Introduceer het andere deel van het weefsel in een cryopreservatie Tube, dompel het in vloeibare stikstof en invriezen de buis door het op-80 °c voor toekomstige moleculaire analyses op te slaan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanreren de rat onder algemene inhalatie anesthesie met behulp van een snelle intracardiale injectie van 2 M KCl/kg volgens de aanbevelingen van het ethisch comité.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Siemionow, M., Arslan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia/reperfusion+injury:+a+review+in+relation+to+free+tissue+transfers.">Ischemia/reperfusion injury: a review in relation to free tissue transfers.</a> Microsurgery. 24 (6), 468-475 (2004).</li><li>Wang, W. Z., Baynosa, R. C., Zamboni, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+ischemia-reperfusion+injury+for+the+plastic+surgeon:+2011.">Update on ischemia-reperfusion injury for the plastic surgeon: 2011.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (6), 685-692 (2011).</li><li>Chen, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+presentation+of+the+first+signs+of+vascular+compromise+dictates+the+salvage+outcome+of+free+flap+transfers.">Timing of presentation of the first signs of vascular compromise dictates the salvage outcome of free flap transfers.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 120 (1), 187-195 (2007).</li><li>Sears, E. D., Chung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replantation+of+finger+avulsion+injuries:+a+systematic+review+of+survival+and+functional+outcomes.">Replantation of finger avulsion injuries: a systematic review of survival and functional outcomes.</a> The Journal of Hand Surgery. 36 (4), 686-694 (2011).</li><li>Caterson, E. J., Lopez, J., Medina, M., Pomahac, B., Tullius, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+injury+in+vascularized+composite+allotransplantation.">Ischemia-reperfusion injury in vascularized composite allotransplantation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 24 (1), 51-56 (2013).</li><li>Amin, K. R., Wong, J. K. F., Fildes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+Reduce+Ischemia+Reperfusion+Injury+in+Vascularized+Composite+Allotransplantation+of+the+Limb.">Strategies to Reduce Ischemia Reperfusion Injury in Vascularized Composite Allotransplantation of the Limb.</a> The Journal of Hand Surgery. 42 (12), 1019-1024 (2017).</li><li>Barre-Sinoussi, F., Montagutelli, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+are+essential+to+biological+research:+issues+and+perspectives.">Animal models are essential to biological research: issues and perspectives.</a> Future Science OA. 1 (4), (2015).</li><li>Shaughness, G., Blackburn, C., Ballestin, A., Akelina, Y., Ascherman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Thrombosis+Formation+in+1-mm-Diameter+Arterial+Anastomoses+with+Transit-Time+Ultrasound+Technology.">Predicting Thrombosis Formation in 1-mm-Diameter Arterial Anastomoses with Transit-Time Ultrasound Technology.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (6), 1400-1405 (2017).</li><li>Ballestin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+injury+in+a+rat+microvascular+skin+free+flap+model:+A+histological,+genetic,+and+blood+flow+study.">Ischemia-reperfusion injury in a rat microvascular skin free flap model: A histological, genetic, and blood flow study.</a> PloS One. 13 (12), 0209624 (2018).</li><li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Arterial+Anatomy+of+the+Murine+Hindlimb:+Functional+Role+in+the+Design+and+Understanding+of+Ischemia+Models.">Characterization of the Arterial Anatomy of the Murine Hindlimb: Functional Role in the Design and Understanding of Ischemia Models.</a> PloS One. 8 (12), (2013).</li><li>Smit, J. M., Zeebregts, C. J., Acosta, R., Werker, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+free+flap+monitoring+in+the+last+decade:+a+critical+review.">Advancements in free flap monitoring in the last decade: a critical review.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (1), 177-185 (2010).</li><li>Krag, C., Holck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+the+patency+test+in+microvascular+anastomosis:+Correlation+between+observed+patency+and+size+of+intraluminal+thrombus:+An+experimental+study+in+rats.">The value of the patency test in microvascular anastomosis: Correlation between observed patency and size of intraluminal thrombus: An experimental study in rats.</a> British Journal of Plastic Surgery. 34, 64-66 (1981).</li><li>Selber, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+study+of+transit-time+flow+volume+measurement+for+intraoperative+evaluation+and+optimization+of+free+flaps.">A prospective study of transit-time flow volume measurement for intraoperative evaluation and optimization of free flaps.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (2), 270-281 (2013).</li><li>Briers, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+speckle+contrast+imaging:+theoretical+and+practical+limitations.">Laser speckle contrast imaging: theoretical and practical limitations.</a> Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066018 (2013).</li><li>Zotterman, J., Bergkvist, M., Iredahl, F., Tesselaar, E., Farnebo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+partial+and+full+venous+outflow+obstruction+in+a+porcine+flap+model+using+laser+speckle+contrast+imaging.">Monitoring of partial and full venous outflow obstruction in a porcine flap model using laser speckle contrast imaging.</a> Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 69 (7), 936-943 (2016).</li><li>Zotterman, J., Tesselaar, E., Farnebo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+laser+speckle+contrast+imaging+to+predict+flap+necrosis:+An+experimental+study+in+a+porcine+flap+model.">The use of laser speckle contrast imaging to predict flap necrosis: An experimental study in a porcine flap model.</a> Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 72 (5), 771-777 (2019).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Microchirurgische vrije weefsel overdrachten zijn uitgegroeid tot de methode van keuze voor het reconstrueren van grote gebreken. Een periode van ischemie optreedt tijdens dergelijke vrije weefsel overdrachten. Wanneer deze periode de tolerantie van het weefsel overschrijdt, kan I/R-letsel falen van de geoefende vrije flap9veroorzaken. De beschrijving van de methodologie om een kostenbesparend en translationeel preklinisch model te ontwikkelen om I/R-letsel in reconstructieve microchirurgie te bestuderen, kan bijdragen aan de studie van verschillende verbindingen om dit pathofysiologisch proces tegen te gaan.
In het diermodel beschreven, nadat de vasculaire ligaturen werden geplaatst en de vrije flap werd verhoogd, geen hindledemaat bloedstroom compromissen werden opgemerkt, noch pijn of slap. Zoals Kochi et al.10 beschreef, liet ons model ook drie neven routes door intramusculaire netwerken.
Bewaking van vrije kleppen is van groot belang11, als berging is omgekeerd gerelateerd aan de duur tussen ischemie begin en de klinische herkenning. Voor dit doel moeten vrije kleppen intra-en postoperatief worden bestudeerd.
Intra-operatief, de veelgebruikte lege en navul test of de akoestische Doppler maken identificatie mogelijk, maar niet kwantificering van stroom aanwezigheid of afwezigheid via een anastomose12. Om deze reden gebruikten we de transit-time echografie-technologie, een nieuwe methode waarmee chirurgen de bloedtoevoer van microchirurgische anastomosen13kunnen kwantificeren. In onze studie, alle microchirurgische anastomosen waren patent na 8 h van ischemische belediging en aan het einde van de studie. Onmiddellijk na de oprichting van de microchirurgische anastomoses, merkten we hogere bloedstroom volumes dan de minima aanbevolen in de literatuur8. Dit voorspelde goede pedile perfusie aan het einde van de studie, waaruit blijkt dat de resultaten niet werden beïnvloed door de micro-chirurgische techniek, maar eerder door de I/R blessure cascade van gebeurtenissen. Deze techniek is echter niet vrij van beperkingen. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, moeten de microchirurgische voelers neutraal worden gehouden voor het vlak van het vat, niet trekken of spanning creëren. Een goede akoestische koppeling is nodig om een goed signaal te verkrijgen, dat kan worden bereikt met behulp van ultrasone gel of zoutoplossing. Een kwalitatief hoogwaardig koppelings signaal, dat door de apparatuur wordt geleverd, is een belangrijke parameter die tijdens de metingen moet worden overwogen.
We hebben LASCA gebruikt, ook wel bekend als laser spikkel contrast Imaging of laser spikkel Imaging, postoperatief14. Deze technologie vertegenwoordigt een waardevolle techniek voor semi-kwantitatieve real-time mapping van Flow binnen vrije kleppen zoals hier geverifieerd. Een van de beperkingen is dat de resultaten worden geleverd in willekeurige eenheden en niet direct gerelateerd aan de werkelijke stroomwaarden. In deze zin, verder onderzoek is nodig om te valideren van deze correlatie. Laser doppler-flowmetrie wordt vaker gebruikt, maar beperkt door het feit dat het alleen perfusie meet in een enkel punt in de flap, terwijl LASCA de detectie van regionale veranderingen in huidperfusie in de flap15mogelijk maakt. Bovendien werd in een recente studie16 aangegeven dat Lasca de regio's met een hoog risico op postoperatieve flap necrose kan vervoors pellen. Onze resultaten suggereren dat LASCA een veelbelovende techniek is voor de peri-en postoperatieve bewaking van vrije kleppen.

Microchirurgie is uitgegroeid tot een gemeenschappelijke chirurgische techniek voor reconstructie die het mogelijk maakt voor interventies (bv. vrije weefsel overdrachten) om complexe weefsel defecten te herstellen, replantation van geampuleerde ledematen, en zelfs samengestelde weefsel allotransplantaties.
Microchirurgische reconstructies zijn ideaal voor een breed scala aan defecten veroorzaakt door traumatische verwondingen, brandwonden of oncologische resecties. Echter, er is een laag percentage van de vrije flap falen, waaronder ischemie-reperfusie (I/R) letsel is een van de belangrijkste verantwoordelijke factoren. Alle microchirurgisch overgedragen weefsels doorstaan een verplichte periode van ischemie gevolgd door het reperfusie. Deze periode van primaire ischemie wordt meestal goed verdragen; het succespercentage van de microchirurgische ingrepen overschrijdt dus 90%1,2. Slechts 63,7% van de kleppen die een chirurgische revisie vereisen, kan echter volledig worden opgeslagen3. Bovendien, in gevallen van herplantage van vinger avulsion verwondingen, het succespercentage is 66%4; en in gevallen van samengestelde weefsel allotransplantatie lijden I/r letsel, afwijzings percentages worden verhoogd sinds de I/r letsel activeert aangeboren immuniteit5,6.
Daarom is de studie van dit pathofysiologisch fenomeen van belang. Diermodellen zijn essentieel voor het onderzoeken van fysiologische mechanismen en het beoordelen van nieuwe therapieën voordat het kan worden toegepast op mensen7. De anatomie van het vaartuig en de fysiologische gelijkenissen tussen ratten en mensen maken ratten tot een ideaal model voor het onderzoek van biologische processen zoals I/R-letsel.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de creatie van een rat Free Skin flap model met I/R letsel, evenals verschillende mogelijkheden voor intra-en postoperatieve evaluaties. Het algemene doel van deze methode is om een nuttig preklinisch model te beschrijven om I/R-letsel en mogelijke behandelingen te bestuderen om de bijbehorende schade te verminderen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:681px;" width="681">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">AureFlo Unit</td>
			<td style="width:121px;">Transonic (Ithaca, USA)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Transit-time ultrasound flowmeter equipment</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle)</td>
			<td style="width:121px;">S&#38;T AG (Neuhausen, Switzerland)</td>
			<td style="width:161px;">RHR-SET. Art.No.00795</td>
			<td>Set of microsurgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">FLOW-i</td>
			<td style="width:121px;">Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Anesthesia Delivery System</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Micro clamps ABB-1</td>
			<td style="width:121px;">S&#38;T AG (Neuhausen, Switzerland)</td>
			<td style="width:161px;">00408V</td>
			<td>Double microvascular clamp with frame</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Micro clamps ABB-11</td>
			<td style="width:121px;">S&#38;T AG (Neuhausen, Switzerland)</td>
			<td style="width:161px;">00414V</td>
			<td>Double microvascular clamp without frame</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Micro clamps B-1</td>
			<td style="width:121px;">S&#38;T AG (Neuhausen, Switzerland)</td>
			<td style="width:161px;">00396V</td>
			<td>Sigle microvascular clamp</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:232px;">Nylon suture 10/0</td>
			<td style="width:121px;">Laboratorio Arag&#243; (Barcelona, Spain)</td>
			<td style="width:161px;">19921</td>
			<td>Microsurgical suture</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">OPMI Pentero 800</td>
			<td style="width:121px;">Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Surgical microscope</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">PeriCam PSI System</td>
			<td style="width:121px;">Perimed AB (J&#228;rf&#228;lla, Sweden)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Laser speckle contrast analysis equipment</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:232px;">Philips Intellivue MX450</td>
			<td style="width:121px;">Philips Medizin Systeme (B&#246;blingen, Germany)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Monitoring system</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:232px;">Protector posoperatorio para roedores</td>
			<td style="width:121px;">Fundaci&#243;n Centro de Cirug&#237;a de M&#237;nima Invasi&#243;n Jes&#250;s Us&#243;n (C&#225;ceres, Spain)</td>
			<td style="width:161px;">P201400272</td>
			<td>Postoperative protector for rodents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pre-clinical rat model for the study of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery

Ischemie-reperfusie letsel is de belangrijkste oorzaak van klep falen in reconstructieve microchirurgie. De rat is het voorkeur preklinisch diermodel op vele gebieden van biomedisch onderzoek vanwege de kosteneffectiviteit en de vertaling ervan naar de mens. Dit protocol beschrijft een methode om een preklinisch vrij huid flap model te creëren bij ratten met ischemie-reperfusie letsel. Het beschreven 3 cm x 6 cm rat vrije huid flap model is gemakkelijk te verkrijgen na de plaatsing van verschillende vasculaire ligaturen en het gedeelte van de vasculaire pedile. Dan, 8 h na de ischemische belediging en voltooiing van de microchirurgische anastomose, de vrije huid flap ontwikkelt de weefselbeschadiging. Deze letsel-gerelateerde schade aan ischemie-reperfusie kan in dit model worden bestudeerd, waardoor het een geschikt model is voor de evaluatie van therapeutische middelen om dit pathofysiologisch proces aan te pakken. Bovendien worden twee belangrijke bewakingstechnieken beschreven in het protocol voor de beoordeling van dit diermodel: transittijd echografie en laserspikkel contrast analyse.

Onmiddellijk na de oprichting van de microchirurgische anastomoses, we verkregen hogere bloedstroom volumes dan de minimale stromen aanbevolen in de literatuur8; alle microchirurgische anastomosen waren dus patent 1 week na de operatie (Figuur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60292/60292fig1.jpg"> Figuur 1: Transit-tijd echografie bloedstroom beoordeling. A) positie van de microchirurgische stromings sonde om de doorbloeding te beoordelen. B) het patroon en de kwantificering van de bloedstroom die zijn verkregen van de anastomoseerde vaten van de klepsteel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60292/60292fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Observatie van de micro circulatoire deprivatie van bloedtoevoer tijdens de ischemische belediging was mogelijk met de Lasca-techniek, inclusief de onmiddellijke Hyper perfusie tijdens de flap reperfusie, en, perioperatief, de verschillende gebieden met minder perfusie en een hoger risico op postoperatieve flap necrose die inderdaad necrotische 7 dagen na het einde van de studie (Figuur 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60292/60292fig2.jpg"> Figuur 2: Laser spikkel contrast analysetechnologie. (A) visualisatie van micro circulatoire weefsel bloed perfusie in de fysiologische toestand. (B) visualisatie van micro circulatoire weefsel bloed perfusie tijdens ischemie. (C) visualisatie van micro circulatoire weefsel bloed perfusie onmiddellijk na reperfusie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60292/60292fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
De klep overlevings gebied na 8 h van ischemie en de daaropvolgende reperfusie was rond 40%. Eerder gepubliceerde resultaten9 toonde statistisch significante verschillen wanneer dit model werd vergeleken met kleppen waar geen ischemische belediging werd toegebracht.

Watch this Scientific Journal Video about A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery at JoVE.com

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Hier beschrijven we een pre-klinisch diermodel voor het bestuderen van de pathofysiologie van ischemie-reperfusie letsel in reconstructieve microchirurgie. Dit gratis Skin flap model op basis van de oppervlakkige caudal epigastrische vaten in de rat kan ook de evaluatie van verschillende therapieën en verbindingen mogelijk maken om schade door ischemie-reperfusie letsel te neutraliseren.

Een pre-klinische rat model voor de studie van ischemie-reperfusie letsel in reconstructieve microchirurgie

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Ischemie-reperfusie letsel is de belangrijkste oorzaak van flap falen in reconstructieve microchirurgie. Deze video beschrijft een preklinisch diermodel voor de studie van deze pathofysiologie. Dit gratis huidflapmodel op basis van de oppervlakkige caudale epigastrische vaten in de rat kan de evaluatie van verschillende therapieën en verbindingen mogelijk maken om ischemie-reperfusieletselgerelateerde schade tegen te gaan.Microchirurgische reconstructies zijn ideaal voor een breed scala aan defecten. Deze procedures zorgen echter voor een verplichte periode van ischemie, gevolgd door de reperfusie. Deze periode wordt meestal goed verdragen, en het slagingspercentage van microchirurgische procedures hoger is dan 90%Echter, slechts 73,7% van de flappen die chirurgische herziening kan volledig veilig zijn.Bovendien, in gevallen van herbeplanting van vingeravulsie verwondingen, het slagingspercentage is ongeveer 60%en in gevallen van composiet weefsel re-transplantatie, lijden ischemie-reperfusie letsel projectie percentages worden verhoogd, omdat letsel activeert aangeboren immuniteit. Daarom is de studie van dit pathofysiologische fenomeen van belang. Om deze procedure te beginnen, gebruik een chirurgische marker om een drie centimeter bij zes centimeter flap te trekken, ervoor te zorgen dat een van de zes centimeter zijden overeenkomt met de buik middellijn.Maak vervolgens een incisie van zes centimeter aan de middellijn van de buik, twee loodrechte insnijdingen van drie centimeter, evenals een van zes centimeter parallel aan de eerste incisie. Om te beginnen met het ontleden van de aangewezen huidklep, gebruik schaar en Adson tangen om de flap te verhogen. Trek de flap voorzichtig van het schedelgebied naar het staartgebied.Ontleden de flappedicula zonder deze aan te raken of door de adventitia zo min mogelijk vast te grijpen om beschadiging van de vaatwand te voorkomen. 8-0 gebruiken nylon hechtingen aan de ligaturen door ligaturen de saphenous vaten, laterale circumflex femorale vaten, en de proximale caudal femorale vaten. Klem de vasculaire pedicel en snijd het om de acht uur ischemie periode te starten.Gebruik gehepariniseerde zoutoplossing om de klep te doorsurven en verwijder vervolgens het stagnerende bloed uit de microcirculatie. Gebruik 10-0 nylon hechtingen om de microchirurgische anastomoses uit te voeren. Na acht uur ischemie, reperfuse de klep door het verwijderen van de microvasculaire klemmen, en controleer de vasculaire patency.Beoordeel eerst de bloedstroom met behulp van een transit-time ultrasone flowmeter en microchirurgische sondes. Plaats het doelvat in het ultrasone detectievenster van de stroomsonde om het stroomvolume te kwantificeren. Wanneer een goede koppeling is bereikt en het vat zonder spanning in het akoestische venster wordt geplaatst, klikt u op de opnameknop op het display om de gegevens op te slaan.Gebruik hierna 4-0 opneembare hechtingen om de huid te sluiten. Gebruik de contrastanalyse van de flap om de microcirculatie van de flap te beoordelen. Maak een nieuwe opname voor elk monster en voor elke follow-up studie door te klikken op bestand, nieuwe opname.Er wordt een nieuw venster geopend waarin het installatiepaneel wordt weergegeven. Bewerk hier de informatie voor de projectnaam, onderwerp, operator en opnamenaam. Pas de werkafstand aan door de laser ten opzichte van het weefsel te verplaatsen.Zoom de laserkop in of uit naar het weefsel van belang. Standaardiseer in de beeldinstelling het meetgebied door de gewenste breedte en hoogte in te voeren. Stel de puntdichtheid in op hoog.Selecteer bij de instelling voor het vastleggen van afbeeldingen de framesnelheid en de duur voor de opname. Klik vervolgens op de opnameknop om te beginnen met opnemen. Het installatiepaneel wordt vervangen door het opnamepaneel en gegevens worden automatisch opgeslagen.Maak snapshots tijdens de procedure om verdere vergelijking mogelijk te maken. Gebruik hierna ImageJ-software om de overlevings- en necrosegebieden te meten door eerst een liniaal op de plaats van de flap te plaatsen en controlefoto's te maken voor macroscopische metingen. Selecteer in de toolbox ImageJ rechte lijn en teken een lijn over een centimeter van de liniaal.Klik op analyseren, stel schaal in en voer in het tekstvak voor bekende afstand de waarde van één centimeter in. Klik op het gereedschap veelhoekselectie en teken de veelhoeklijnen over de flap om het levensvatbare gebied te berekenen. Klik op analyseren, meten om de gebiedswaarde te verkrijgen.Plaats vervolgens een postoperatieve dressing op het dier voor de huisvesting om zelfverminking te voorkomen. Zeven dagen na de operatie, foto van de chirurgische gebied om macroscopische metingen van de flap overleving en necrose gebieden mogelijk te maken. Met behulp van de eerder beschreven laserspikkel contrastanalysetechniek, visualiseren en kwantificeren perfusie verschillen om de flap microcirculatie te beoordelen.Na de macroscopische analyse, verwijder de 4-0 hechtingen, hef de flap, en gebruik transit-time echografie om de vasculaire pedicle bloedstroom opnieuw te beoordelen. Voer weefselbemonstering uit door de flap in de lengterichting in twee delen te verdelen die 1,5 centimeter bij zes centimeter meten. Onmiddellijk na de oprichting van de microchirurgische anastomoses, verkregen we hogere bloedstroomwaarden dan de minimale stromen die in de literatuur worden aanbevolen.Zo waren alle microchirurgische anastomoses patent een week na de operatie. Observatie van de microcirculatory verdorvenheid van de bloedstroom tijdens de ischemische belediging was mogelijk met de laser spikkel contrastanalyse techniek. Dit omvat de onmiddellijke hyperperfusie tijdens de flapreperfusie en periooperatief, de verschillende gebieden met minder perfusie hadden een hoger risico op postoperatieve flapnecrose die inderdaad zeven dagen na het einde van de studie werden genept.De flap overleving gebied na acht uur van ischemie en de daaropvolgende reperfusie was ongeveer 40%Eerder gepubliceerde resultaten tonen statistisch significante verschillen wanneer dit model wordt vergeleken met flappen waar geen ischemische belediging wordt toegebracht. Vergeet niet om de flappedikel te ontleden zonder het aan te raken of door de adventitia zo weinig mogelijk te grijpen om beschadiging van de vaatwand te voorkomen, evenals het uitvoeren van de juiste microchirurgische anastomoses om complicaties als gevolg van de chirurgische techniek te voorkomen. Intraoperatief, transit-time echografie technologie stelt ons in staat om de bloedstroom van microchirurgische anastomoses kwantificeren en dus voorspellen flap perfusie.Postoperatief, laser speckle contrast analyse maakt een semi-continuïteit van real-time mapping van de stroom binnen vrije kleppen. Het is een veelbelovende techniek, maar verder onderzoek is nodig. Deze video heeft het protocol beschreven van een geschikt model voor de evaluatie van therapeutische middelen om ischemie-reperfusieletsel op het gebied van reconstructieve microchirurgie tegen te gaan.

Research

JoVE Journal

Medicine

Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Normotherme hartstilstand en cardiopulmonale reanimatie: een muismodel van ischemie-reperfusie schade

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

In situ Transverse Rectus Abdominis Myocutaneous Flap: A Rat Model of Myocutaneous Ischemia Reperfusion Injury

In situ Transverse Rectus Abdominis Myocutaneous Flap: A Rat Model of Myocutaneous Ischemia Reperfusion Injury

In situ Transversale rectusabdominis myocutane Flap: een rat model van myocutane ischemiereperfusieletsel

Free tissue transfer is the gold standard of reconstructive surgery to repair complex defects not amenable to local options or those requiring composite ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemie-reperfusie model van Acute Kidney Injury en Post Letsel Fibrosis in Muizen

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Een muizenmodel van myocard ischemie-reperfusie schade door de eileiders van de LAD

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Inductie en beoordeling van ischemie-reperfusie schade in Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Muizenmodel van Intestinale ischemie-reperfusie schade

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Een muismodel van retinale ischemie-reperfusie letsel door misbruik van intra-oculaire druk

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Induceren van ischemie-reperfusie schade in de Mouse Ear Skin voor intravitale Multiphoton Imaging van immuunresponsen

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Evaluatie van coronaire stroom reserve na myocardiale ischemie reperfusie bij ratten

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Bewerkt Heterotopic achterpoten Osteomyocutaneous flap model in de rat voor translationele vasculaire composiet Allotransplantation onderzoek

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...