Name: a pre-clinical rat model for the study of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery
Uploaded: 2019-11-08T14:00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery at JoVE.com

Das Forschungsprojekt wurde am Zentrum für minimalinvasive Chirurgie (CCMIJU), Teil der ICTS Nanbiosis, durchgeführt. Die Studie wurde mit Unterstützung der folgenden Nanbiose-Einheiten durchgeführt: U21, experimenteller Operationssaal; U22, Tierhaltung; und U14, Zelltherapie. Diese Arbeit wurde durch das ISCIII-Projekt PI16/02164 unterstützt. Der Geldgeber spielte keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datensammlung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Manuskriptvorbereitung. Ein besonderer Dank gilt Maria Pérez für die Vorbereitung der Figuren und Fernanda Carrizosa für die ständige Förderung und Unterstützung der wissenschaftlichen Bibliographie.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Ethik-Komitee des Zentrums für minimalinvasive Chirurgie von Jes es Uson und den Wohlfahrtsrichtlinien der Regionalregierung durchgeführt, die auf europäischen Rechtsvorschriften basieren.
1. Prächirurgische und chirurgische Präparation
<ol><li>Haus Wistar Ratten mit einem Gewicht von 290–350 g in Käfigen bei 22–25 °C mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. Akklimatisieren Sie 1 Woche vor der Operation, um stressinduzierte Probleme zu verhindern.</li>
	<li>Legen Sie eine Ratte in eine Anästhesie-Induktionskammer, liefern Sie 5 min Sauerstoff (0,5-1 L/min), und verwenden Sie einen Verdampfer, um 5% Sevofluran zu liefern, um Anästhesie zu induzieren.</li>
	<li>Nehmen Sie die Ratte aus der Kammer, sobald die Anästhesie induziert ist. Legen Sie die Inhalationsgesichtsmaske auf die Ratte und bieten Sie eine Durchflussrate von 2% Sevofluran, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Überprüfen Sie, ob auf eine Zehenklemme nicht reagiert wird.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Augenschutzsalbe, um Hornhauttrocknung und Beschädigung zu verhindern.</li>
	<li>Überwachen Sie das Tier unter Vollnarkose wie folgt: Legen Sie ein Rektalthermometer (35,9–37,5 °C) auf, überprüfen Sie die Farbe der Schleimhaut und positionieren Sie ein Nagetier-Pulsoximeter, um die O2-Sättigung zu überprüfen (>95%) Herzfrequenz (250–450 bpm).</li>
	<li>Verwenden Sie eine Wärmeunterstützung (elektrische Heizkissen oder zirkulierende Wasserdecken), um Unterkühlung zu vermeiden und die Rückgewinnung der anästhesienden Zeit nach der Prozedur zu verbessern.</li>
	<li>Injizieren Sie 5 ml warme subkutane physiologische Salzlösung, um die richtige Hydratation aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Geben Sie vor dem Eingriff subkutan und 5 Tage postoperativ schmerzlindernde und entzündungshemmende Medikamente (Meloxicam 1 mg/kg/Tag) und prophylaktische Antibiotika (Enrofloxacin 7,5 mg/kg/Tag) an.</li>
	<li>Rasieren Sie die Bauch- und Leistenbereiche des Tieres.</li>
	<li>Wenden Sie topisches Povidon-Jod an, gefolgt von 70% Ethanol. Bedecken Sie das Tier mit einem sterilen Vorhang.</li>
</ol>2. Kostenlose Skin Flap Model Chirurgie
<ol><li>Zeichnen Sie mit einem chirurgischen Marker eine 3 cm x 6 cm Klappe, die zu einer der 6 cm Seiten mit der Bauchmitte passt. Als nächstes machen Sie einen 6 cm Hautschnitt an der Mittellinie des Bauches und zwei senkrechte 3 cm Schnitte am oberen und unteren Teil des 6 cm Mittellinienschnitts.</li>
	<li>Um die entworfene 3 cm x 6 cm Hautklappe zu sezieren, verwenden Sie Scheren und Adson Zangen, um die Klappe (anstelle eines Skalpells) aufgrund der Hautbeweglichkeit zu heben.</li>
	<li>Ziehen Sie die Klappe vorsichtig aus dem Schädelbereich in Richtung des kaudalen Bereichs, um bei der Zerlegung zu helfen und die epigastrische Pedikle zu identifizieren, die vom reichlichen losen Bindegewebe umgeben ist.</li>
	<li>Sezieren Sie den Klappen-Pedikle, ohne ihn zu berühren oder indem Sie die Adventitia so wenig wie möglich erfassen, um eine Beschädigung der Gefäßwand zu vermeiden.</li>
	<li>Verwenden Sie 8/0 NylonNähte, um durch Ligaturen die proximalen kaudalen Femoralgefäße, seitlichen Zirkumflex-Femoralgefäße und saphenous Gefäße zu verschließen. Dabei wird die Durchblutung der Klappe durch die Femoralarterie bereitgestellt und setzt sich direkt durch die oberflächliche kaudale epigastrische Arterie fort, während die venöse Drainage durch die oberflächliche kaudale epigastrische Vene in Richtung der femoralen Vene durchgeführt wird.</li>
	<li>Klemmen Sie den vaskulären Pedikeln und schneiden Sie ihn dann, um die 8 h Ischämieperiode zu beginnen. Während des Verfahrens verwenden Sie elektrische Decken, um die Temperatur zu halten. Zwei 5 ml Injektionen warmer (25°C) 0,9% Salinelösung werden subkutan verabreicht. Die erste Verabreichung erfolgt 2 h nach Beginn des Verfahrens; und die zweite am Ende des Verfahrens, um eine ordnungsgemäße Verwertung des Tieres zu erhalten.</li>
	<li>Verwenden Sie eine heparinisierte Salinelösung (100 U/ml), um die Klappe zu durchdringen und das stagnierende Blut aus der Mikrozirkulation zu entfernen.</li>
	<li>Verwenden Sie 10/0 Nylon Nähte, um die mikrochirurgischen Anastomosen durchzuführen.</li>
	<li>Nach 8 h Ischämie, reperfuse die Klappe durch Entfernen der mikrovaskulären Klemmen und überprüfen Sie die vaskuläre Durchgängigkeit wie unten beschrieben.</li>
</ol>3. Intraoperative Beurteilung
<ol><li>Führen Sie einen manuellen Patzerprüfung (Leer- und Nachfülltest) für die Vene und arteriende Arterie durch. Um dies zu tun, verwenden Sie zwei mikrochirurgische Zangen, positionieren Sie sie distal zur Anastomose und führen Sie das Melken durch. Lassen Sie zuerst die nächsten Zangen an der Anastomose-Stelle frei. Wenn der Blutfluss nach dem Leeren eines Gefäßabschnitts fortgesetzt wird, ist die Anastomose patentiert.</li>
	<li>Bewerten Sie den Blutfluss mit einem Transit-Zeit-Ultraschall-Durchflussmesser und mikrochirurgischen Sonden.
	<ol>
<li>Messen Sie den Durchmesser der Pedikusgefäße, um die richtige Größe für die Durchflusssonden zu wählen. HINWEIS: Eine 0,7 mm Durchflusssonde kann Behälter im Bereich von 0,4 mm bis 0,7 mm messen; eine 1,0 mm Durchflusssonde kann Behälter im Bereich von 0,7 mm bis 1,0 mm messen; eine 1,5 mm Durchflusssonde kann Behälter im Bereich von 1,0 mm bis 1,5 mm messen.</li>
		<li>Platzieren Sie das Zielgefäß im Ultraschall-Sensorfenster (zwischen Reflektor und Messumformer) der Durchflusssonde, um das Durchflussvolumen zu quantifizieren. HINWEIS: Halten Sie die Sonde neutral an die Ebene des Schiffes, um Jegliche Spannung oder Ziehen zu vermeiden.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Qualität der akustischen Kupplung, indem Sie beobachten, dass alle Balken auf dem Display grün sind. HINWEIS: Wenn es schwierig ist, eine gute akustische Kopplung zu erhalten, verwenden Sie Ultraschallgel oder physiologische Kochsalzlösung topisch.</li>
		<li>Wenn eine gute Kopplung erreicht ist und das Gefäß ohne Spannung in das akustische Fenster gelegt wird, klicken Sie auf die Aufnahmetaste auf dem Display, um die Daten zu speichern. HINWEIS: Um eine zuverlässige und korrekte Messung zu erhalten, stellen Sie sicher, dass das Wellenformmuster ständig wiederholbar ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Einmal fertig, verwenden Sie Polyglykolsäure (PGA) 4-0 rezidiorbierbare geflochtene Nähte (16mm 3/8 dreieckige Nadel), um die Haut zu schließen. Verwenden Sie ein einfaches unterbrochenes Muster, um Kraft und Gewebeposition zu erhalten, wenn ein Teil der Naht postoperativ von der Ratte abgebissen wird.</li>
	<li>Bewerten Sie die Mikrozirkulation der Klappe mithilfe der Laserspeck-Kontrastanalyse (LASCA).
	<ol>
<li>Erstellen Sie eine neue Aufzeichnung für jedes Tier und für jede Folgeder der Studie. Klicken Sie hierzu auf Datei/Neue Aufzeichnung. Ein neues Fenster wird geöffnet, und der Einrichtungsbereich wird angezeigt. Bearbeiten Sie dann die Informationen zu Projektname, Betreff, Operator und Aufzeichnungsname.</li>
		<li>Um die reproduzierbarkeit zu erreichen, standardisieren Sie die folgenden Parameter: Arbeitsabstand, Messbereich, Punktdichte, Bildrate und Umgebungslichtbedingungen.<ol>
<li>Passen Sie den Arbeitsabstand an, indem Sie den Laser in Relation zum Gewebe bewegen. Zoomen Sie den Laserkopf in Richtung des Interessierenseins. Um nach dem Messwert zu suchen, klicken Sie auf Image Setup. Hier auf 12,0 cm eingestellt.</li>
			<li>Standardisieren Sie den Messbereich, indem Sie die gewünschte Breite und Höhe beim Image-Setupeingeben. Die entworfene Klappe misst 3 cm x 6 cm. Wählen Sie für diese Messung eine Breite von 4,0 cm und eine Höhe von 7,0 cm aus, um zusätzlichen Platz zu haben.</li>
			<li>Legen Sie die Punktdichte im Image-Setupso hoch fest. Hoch, Mittel und Niedrig sind die drei Optionen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wählen Sie im Image Capture Setup die Bildrate (10 Bilder/s) für die Aufnahme und die Dauer (1 min) der Aufnahme aus. HINWEIS: Haben Sie die gleiche Umgebungslicht-Zustand im Operationssaal während der Bedienung oder Durchführung der Bewertungen.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen, um mit der Aufzeichnung zu beginnen. Das Setup-Panel wird durch das Aufnahmepanel ersetzt. Die Daten werden automatisch gespeichert. Erstellen Sie während des Verfahrens Momentaufnahmen, um einen weiteren Vergleich zu ermöglichen. HINWEIS: Die Perfusionsskala kann geändert werden, um die Visualisierung zu verbessern (Klicken Sie auf Extras | Filter und Farbskalen | Perfusionsskala | Manuell 0 - 150), aber die gemessenen Perfusionswerte bleiben unberührt. Vor und nach der Aufzeichnung können verschiedene Interessengebiete (ROIs) erstellt werden, um die Perfusion in ihnen zu messen. Hier haben wir nur den Bereich der geübten Klappe (3 cm x 6 cm) ausgewertet.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie ImageJ-Software, um die Überlebens- und Nekrosebereiche zu messen.
	<ol>
<li>Suchen Sie ein Lineal an der Seite der Klappe und nehmen Sie dann Kontrollbilder für makroskopische Messungen des Klappenüberlebensbereichs auf.</li>
		<li>Um Bilder auszuwerten, öffnen Sie die ImageJ-Benutzeroberfläche. Klicken Sie auf Datei, und öffnen Sie das zu messende Bild.</li>
		<li>Wählen Sie Gerade Linie in der Toolbox und zeichnen Sie eine gerade Linie über 1 cm des Lineals. Klicken Sie auf Analysieren | Legen Sie Skalierung fest, und führen Sie im Textfeld für bekannte Entfernungen den Wert von 1 cm ein.</li>
		<li>Klicken Sie auf das Polygon-Auswahlwerkzeug und zeichnen Sie die Polygonlinien über die Klappe, um die lebensfähige Fläche zu berechnen. Klicken Sie schließlich auf Analysieren | Measure, um den Flächenwert zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie eine postoperative Anhkleidung auf das Tier vor dem Gehäuse, um eine Selbstverstümmelung des Operationsbereichs zu verhindern. Nach den Eingriffen werden die Tiere einzeln in Käfigen untergebracht, in einem Raum mit Temperaturregelung (22°C bis 25°C).</li>
</ol>4. Postoperative Bewertung und Gewebeprobenahme
<ol><li>Anästhesisieren Sie die Ratte an 7 postoperativen Tagen für die Klappenbewertung und Gewebeprobenahme, indem Sie die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte befolgen (Schritte 1.2 und 1.3). Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch die fehlende Reaktion auf die Zehenprise.</li>
	<li>Fotografieren Sie den Operationsbereich, um makroskopische Messungen der Klappenüberlebens- und Nekrosebereiche zu ermöglichen. Führen Sie die postoperativen makroskopischen Messungen nach den gleichen Schritten der intraoperativen Bewertung durch, die zuvor im Protokoll erläutert wurden (Schritt 3.5). HINWEIS: Achten Sie bei der Verwendung des Polygonauswahlwerkzeugs darauf, indem Sie die Linien auf der Klappe zeichnen, die die lebensfähige Fläche abgrenzt (gemessen in cm2). Der Prozentsatz der lebensfähigen Fläche kann berechnet werden als (cm2 der lebensfähigen Fläche/cm2 der gesamten Klappenfläche) 100.</li>
	<li>Bewerten Sie die Mikrozirkulation der Klappe mit der LASCA-Technik (Schritt 3.4), um Perfusionsunterschiede zu visualisieren und zu quantifizieren</li>
	<li>Nach der makroskopischen Analyse entfernen Sie die 4/0 Nähte und steigen Sie die Klappe auf, um den vaskulären Pedikon-Blutfluss mit dem Transit-Zeit-Ultraschall neu zu bewerten.</li>
	<li>
Durchführung einer Gewebeentnahme durch Längsteilung der Klappe in zwei Teile von 1,5 cm x 6 cm.
	<ol>
<li>Tauchen Sie einen Teil in einen Biopsiebehälter mit 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur ein, um weitere histologische Analysen durchzuführen.</li>
		<li>Den anderen Teil des Gewebes in ein Kryokonservierungsrohr einführen, in flüssigen Stickstoff eintauchen und dann das Rohr kryoservieren, indem Sie es bei -80 °C für zukünftige molekulare Analysen speichern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanisieren Sie die Ratte unter allgemeiner Inhalationsanästhesie mit einer schnellen intrakardialen Injektion von 2 M KCl/kg gemäß den Empfehlungen der Ethikkommission.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Siemionow, M., Arslan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia/reperfusion+injury:+a+review+in+relation+to+free+tissue+transfers.">Ischemia/reperfusion injury: a review in relation to free tissue transfers.</a> Microsurgery. 24 (6), 468-475 (2004).</li><li>Wang, W. Z., Baynosa, R. C., Zamboni, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+ischemia-reperfusion+injury+for+the+plastic+surgeon:+2011.">Update on ischemia-reperfusion injury for the plastic surgeon: 2011.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (6), 685-692 (2011).</li><li>Chen, K. 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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Mikrochirurgische freigewebeübertragungen sind zur Methode der Wahl geworden, um große Defekte zu rekonstruieren. Eine Periode der Ischämie tritt während solcher Freigewebetransfers auf. Wenn dieser Zeitraum die Toleranz des Gewebes überschreitet, kann eine I/R-Verletzung zum Versagen der geübten freien Klappe9führen. Die Beschreibung der Methodik zur Entwicklung eines kostengünstigen und translationalen präklinischen Modells zur Untersuchung von I/R-Verletzungen in der rekonstruktiven Mikrochirurgie kann dazu beitragen, die Untersuchung verschiedener Verbindungen zu leiten, um diesem pathophysiologischen Prozess entgegenzuwirken.
Im beschriebenen Tiermodell wurden nach dem Aufstellen der Gefäßligaturen und dem Aufstellen der freien Klappe keine Rückdlimb-Blutfluss-Kompromisse festgestellt, weder Schmerzen noch Schlaflose. Wie Kochi et al.10 beschrieben, hinterließ unser Modell auch drei Nebenwege durch intramuskuläre Netzwerke.
Die Überwachung freier Klappen ist von großer Bedeutung11, da die Bergung umgekehrt mit der Dauer zwischen Demischämiebeginn und ihrer klinischen Anerkennung zusammenhängt. Zu diesem Zweck sollten freie Klappen intra- und postoperativ untersucht werden.
Intraoperativ ermöglichen der weit verbreitete Leer- und Nachfülltest oder der akustische Doppler die Identifizierung, aber nicht die Quantifizierung von Strömungspräsenz oder Abwesenheit durch eine Anastomose12. Aus diesem Grund haben wir Transit-Zeit-Ultraschall-Technologie verwendet, eine neuartige Methode, die es Chirurgen ermöglicht, den Blutfluss von mikrochirurgischen Anastomosen zu quantifizieren13. In unserer Studie waren alle mikrochirurgischen Anastomosen nach 8 h ischämischer Beleidigung sowie am Ende der Studie patentiert. Unmittelbar nach der Entstehung der mikrochirurgischen Anastomosen stellten wir höhere Durchblutungsmengen fest als die in der Literatur empfohlenen Mindestwerte8. Dies sagte eine gute Pedikusperfusion am Ende der Studie voraus, was zeigt, dass die Ergebnisse nicht durch die mikrochirurgische Technik beeinflusst wurden, sondern durch die I/R-Verletzungskaskade von Ereignissen. Diese Technik ist jedoch nicht frei von Einschränkungen. Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, müssen die mikrochirurgischen Sonden neutral gegenüber der Ebene des Gefäßes gehalten werden, ohne es zu ziehen oder eine Spannung zu erzeugen. Eine gute akustische Kopplung ist erforderlich, um ein richtiges Signal zu erhalten, das mit Ultraschallgel oder Saline erreicht werden kann. Ein hochwertiges Kupplungssignal, das von der Anlage bereitgestellt wird, ist ein wichtiger Parameter, der bei den Messungen berücksichtigt werden muss.
Wir haben LASCA, auch bekannt als Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung oder Laser-Speckle-Imaging, postoperativ14verwendet. Diese Technologie stellt eine wertvolle Technik für die semiquantitative Echtzeit-Mapping des Flusses innerhalb freier Klappen dar, wie hier überprüft. Eine der Einschränkungen besteht darin, dass die Ergebnisse in beliebigen Einheiten bereitgestellt werden und nicht direkt mit tatsächlichen Durchflusswerten zusammenhängen. In diesem Sinne ist weitere Forschung erforderlich, um diese Korrelation zu validieren. Laser-Doppler-Flowmetrie wird häufiger verwendet, aber durch die Tatsache begrenzt, dass sie nur die Perfusion in einem einzigen Punkt in der Klappe misst, während LASCA die Erkennung regionaler Veränderungen der Hautperfusion innerhalb der Klappe15ermöglicht. Darüber hinaus hat eine aktuelle Studie16 gezeigt, dass LASCA die Regionen mit einem hohen Risiko einer postoperativen Klappennekrose perioperativ vorhersagen kann. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass LASCA eine vielversprechende Technik zur peri- und postoperativen Überwachung freier Klappen ist.

Die Mikrochirurgie ist zu einer gängigen chirurgischen Rekonstruktionstechnik geworden, die Eingriffe (z. B. Freigewebetransfers) zur Wiederherstellung komplexer Gewebedefekte, Replantation von amputierten Gliedmaßen und sogar zusammengesetzte Gewebeallotransplantationen ermöglicht.
Mikrochirurgische Rekonstruktionen sind ideal für eine Vielzahl von Defekten, die durch traumatische Verletzungen, Verbrennungen oder onkologische Resektionen verursacht werden. Es gibt jedoch einen geringen Prozentsatz des freien Klappenversagens, unter denen Ischämie-Reperfusion (I/R) Verletzung ist einer der Hauptverantwortlichen. Alle mikrochirurgisch übertragenen Gewebe ertragen eine obligatorische Phase der Ischämie, gefolgt von der Reperfusion. Diese Periode der primären Ischämie ist in der Regel gut verträglich; Somit übersteigt die Erfolgsrate mikrochirurgischer Eingriffe 90%1,2. Allerdings können nur 63,7% der Klappen, die eine chirurgische Revision erfordern, vollständig eingespart werden3. Darüber hinaus liegt die Erfolgsquote bei einer Replantation von Fingeravulsionsverletzungen bei 66%4; und in Fällen von kompositer Gewebe-Allotransplantation leiden I/R-Verletzung, Ablehnung Prozentsätze erhöht, da die I/R-Verletzung aktiviert angeborene Immunität5,6.
Daher ist die Untersuchung dieses pathophysiologischen Phänomens von Interesse. Tiermodelle sind für die Untersuchung physiologischer Mechanismen und die Bewertung neuartiger Therapien unerlässlich, bevor sie auf den Menschen angewendet werden können7. Die Gefäßanatomie und die physiologischen Ähnlichkeiten zwischen Ratten und Menschen machen Ratten zu einem idealen Modell für die Untersuchung biologischer Prozesse wie I/R-Verletzungen.
Hier stellen wir ihnen ein detailliertes Protokoll zur Erstellung eines rattenfreien Hautklappenmodells mit I/R-Verletzung sowie verschiedene Möglichkeiten für intra- und postoperative Beurteilungen vor. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein nützliches präklinisches Modell zur Untersuchung von I/R-Verletzungen und möglichen Behandlungen zur Verringerung der damit verbundenen Schäden zu beschreiben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:681px;" width="681">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">AureFlo Unit</td>
			<td style="width:121px;">Transonic (Ithaca, USA)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Transit-time ultrasound flowmeter equipment</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle)</td>
			<td style="width:121px;">S&#38;T AG (Neuhausen, Switzerland)</td>
			<td style="width:161px;">RHR-SET. Art.No.00795</td>
			<td>Set of microsurgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">FLOW-i</td>
			<td style="width:121px;">Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Anesthesia Delivery System</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Micro clamps ABB-1</td>
			<td style="width:121px;">S&#38;T AG (Neuhausen, Switzerland)</td>
			<td style="width:161px;">00408V</td>
			<td>Double microvascular clamp with frame</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Micro clamps ABB-11</td>
			<td style="width:121px;">S&#38;T AG (Neuhausen, Switzerland)</td>
			<td style="width:161px;">00414V</td>
			<td>Double microvascular clamp without frame</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Micro clamps B-1</td>
			<td style="width:121px;">S&#38;T AG (Neuhausen, Switzerland)</td>
			<td style="width:161px;">00396V</td>
			<td>Sigle microvascular clamp</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:232px;">Nylon suture 10/0</td>
			<td style="width:121px;">Laboratorio Arag&#243; (Barcelona, Spain)</td>
			<td style="width:161px;">19921</td>
			<td>Microsurgical suture</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">OPMI Pentero 800</td>
			<td style="width:121px;">Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Surgical microscope</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">PeriCam PSI System</td>
			<td style="width:121px;">Perimed AB (J&#228;rf&#228;lla, Sweden)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Laser speckle contrast analysis equipment</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:232px;">Philips Intellivue MX450</td>
			<td style="width:121px;">Philips Medizin Systeme (B&#246;blingen, Germany)</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Monitoring system</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:232px;">Protector posoperatorio para roedores</td>
			<td style="width:121px;">Fundaci&#243;n Centro de Cirug&#237;a de M&#237;nima Invasi&#243;n Jes&#250;s Us&#243;n (C&#225;ceres, Spain)</td>
			<td style="width:161px;">P201400272</td>
			<td>Postoperative protector for rodents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pre-clinical rat model for the study of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery

Ischämie-Reperfusionsverletzungen sind die Hauptursache für Klappenversagen in der rekonstruktiven Mikrochirurgie. Die Ratte ist aufgrund ihrer Wirtschaftlichkeit und ihrer Übersetzung auf den Menschen das bevorzugte präklinische Tiermodell in vielen Bereichen der biomedizinischen Forschung. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erstellung eines präklinischen freien Hautklappenmodells bei Ratten mit Ischämie-Reperfusionsverletzung. Das beschriebene 3 cm x 6 cm rattenfreie Hautklappenmodell ist nach der Platzierung mehrerer Gefäßligaturen und des Abschnitts des Gefäßpedikles leicht zu erhalten. Dann, 8 h nach der ischämischen Beleidigung und Abschluss der mikrochirurgischen Anastomose, entwickelt die freie Hautklappe die Gewebeschädigung. Diese Schädigungsschäden im Zusammenhang mit Deriämie-Reperfusion können in diesem Modell untersucht werden, was es zu einem geeigneten Modell für die Bewertung von therapeutischen Wirkstoffen macht, um diesen pathophysiologischen Prozess anzugehen. Darüber hinaus werden im Protokoll zur Bewertung dieses Tiermodells zwei Hauptüberwachungstechniken beschrieben: Transit-Zeit-Ultraschalltechnologie und Laser-Speckle-Kontrastanalyse.

Unmittelbar nach der Schaffung der mikrochirurgischen Anastomosen, erhielten wir höhere Durchflussmengen als die minimalen Ströme in der Literatur empfohlen8; somit waren alle mikrochirurgischen Anastomosen 1 Woche nach der Operation patentiert (Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60292/60292fig1.jpg"> Abbildung 1: Transit-Zeit-Ultraschall-Blutfluss-Bewertung. (A) Position der mikrochirurgischen Durchflusssonde zur Beurteilung des Blutflusses. (B) Blutflussmuster und Quantifizierung der anastomosed Gefäße des Klappenpedikes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60292/60292fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Beobachtung der mikrozirkulären Entbehrung des Blutflusses während der ischämischen Beleidigung war mit der LASCA-Technik möglich, einschließlich der sofortigen Hyperperfusion während der Klappenreperfusion, und, perioperativ, den verschiedenen Bereichen mit weniger Perfusion und einem höheren Risiko für postoperative Klappennekrose, die in der Tat 7 Tage nach dem Ende der Studie nekrotisiert wurden (Abbildung 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60292/60292fig2.jpg"> Abbildung 2: Laserspeck-Kontrastanalysetechnologie. (A) Visualisierung der Mikrozirkulatorische Blutdurchblutung im physiologischen Zustand. (B) Visualisierung der Mikrozirkulatorische Blutperfusion während der Ischämie. (C) Visualisierung der Mikrozirkulatorische Blutperfusion unmittelbar nach der Reperfusion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60292/60292fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Der Überlebensbereich der Klappe nach 8 h Ischämie und der anschließenden Reperfusion betrug etwa 40%. Zuvor veröffentlichte Ergebnisse9 zeigten statistisch signifikante Unterschiede, wenn dieses Modell mit Klappen verglichen wurde, bei denen keine ischämische Beleidigung zugefügt wurde.

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A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Hier beschreiben wir ein präklinisches Tiermodell zur Untersuchung der Pathophysiologie der Ischämie-Reperfusionsverletzung in der rekonstruktiven Mikrochirurgie. Dieses freie Hautklappenmodell, das auf den oberflächlichen kaudalen epigastrischen Gefäßen in der Ratte basiert, kann auch die Bewertung verschiedener Therapien und Verbindungen ermöglichen, um Verletzungsschäden durch Ischämie-Reperfusion entgegenzuwirken.

Ein präklinisches Rattenmodell zur Untersuchung von Ischämie-Reperfusionsverletzungen in der rekonstruktiven Mikrochirurgie

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Ischämie-Reperfusionsverletzungen sind die Hauptursache für Klappenversagen in der rekonstruktiven Mikrochirurgie. Dieses Video beschreibt ein präklinisches Tiermodell für die Untersuchung dieser Pathophysiologie. Dieses freie Hautklappenmodell, das auf den oberflächlichen kaudalen epigastrischen Gefäßen in der Ratte basiert, kann die Bewertung verschiedener Therapien und Verbindungen ermöglichen, um Schädigungsschäden durch Ischämie-Reperfusion entgegenzuwirken.Mikrochirurgische Rekonstruktionen sind ideal für eine Vielzahl von Defekten. Diese Verfahren gewährleisten jedoch eine obligatorische Zeit der Ischämie, gefolgt von der Reperfusion. Dieser Zeitraum ist in der Regel gut verträglich, und die Erfolgsrate der mikrochirurgischen Verfahren übersteigt 90%Allerdings können nur 73,7% der Klappen, die eine chirurgische Revision erfordern, absolut sicher sein.Darüber hinaus liegt die Erfolgsrate bei einer Replantation von Fingeravulsionsverletzungen bei etwa 60 % und bei einer Erneuttransplantation von Verbundgewebe, wo die Projektionsprozentsätze für Ischämie-Reperfusionsverletzungen erhöht werden, da die Verletzung die angeborene Immunität aktiviert. Daher ist die Untersuchung dieses pathophysiologischen Phänomens von Interesse. Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie einen chirurgischen Marker, um eine drei Zentimeter mal sechs Zentimeter lange Klappe zu zeichnen, um sicherzustellen, dass eine der sechs Zentimeter langen Seiten mit der Mittellinie des Bauches übereinstimmt.Als nächstes machen Sie einen sechs Zentimeter großen Hautschnitt an der Mittellinie des Bauches, zwei senkrechte Drei-Zentimeter-Einschnitte sowie einen von sechs Zentimetern parallel zum ersten Schnitt. Um mit der Sezieren der dafür vorgesehenen Hautklappe zu beginnen, verwenden Sie Scheren und Adson-Zangen, um die Klappe zu heben. Ziehen Sie die Klappe vorsichtig aus dem Schädelbereich in Richtung des kaudalen Bereichs.Sezieren Sie den Klappen-Pedikle, ohne ihn zu berühren oder indem Sie die Adventitia so wenig wie möglich erfassen, um eine Beschädigung der Gefäßwand zu vermeiden. Verwenden Sie 8-0 Nylonnähte, um durch Ligaturen die saphenous Gefäße, seitliche Zirkumflex-Femoralgefäße und die proximalen kaudalen Femoralgefäße zu verschließen. Klemmen Sie den vaskulären Pedikeln und schneiden Sie ihn dann, um die achtstündige Ischämieperiode zu beginnen.Verwenden Sie heparinisierte Saline-Lösung, um die Klappe zu durchdringen, dann entfernen Sie das stagnierende Blut aus der Mikrozirkulation. Verwenden Sie 10-0 Nylon Nähte, um die mikrochirurgischen Anastomosen durchzuführen. Nach acht Stunden Ischämie, reperfuse die Klappe durch Entfernen der mikrovaskulären Klemmen, und überprüfen Sie die vaskuläre Durchgängigkeit.Bewerten Sie zunächst den Blutfluss mit einem Transit-Ultraschall-Durchflussmesser und mikrochirurgischen Sonden. Platzieren Sie das Zielgefäß im Ultraschall-Sensorfenster der Durchflusssonde, um das Durchflussvolumen zu quantifizieren. Wenn eine gute Kopplung erreicht ist und das Gefäß ohne Spannung in das akustische Fenster gelegt wird, klicken Sie auf die Aufnahmetaste auf dem Display, um die Daten zu speichern.Danach verwenden Sie 4-0 resorbierbare Nähte, um die Haut zu schließen. Um die Mikrozirkulation der Klappe zu bewerten, verwenden Sie die Laserspeck-Kontrastanalyse. Machen Sie eine neue Aufnahme für jedes Sample und für jede Folgestudie, indem Sie auf Datei, neue Aufzeichnung klicken.Es wird ein neues Fenster geöffnet, in dem das Setup-Bedienfeld angezeigt wird. Bearbeiten Sie hier die Informationen für den Projektnamen, den Betreff, den Operator und den Aufzeichnungsnamen. Passen Sie den Arbeitsabstand an, indem Sie den Laser in Relation zum Gewebe bewegen.Zoomen Sie den Laserkopf in das Gewebe von Interesse. Standardisieren Sie im Bildaufbau den Messbereich, indem Sie die gewünschte Breite und Höhe eingeben. Legen Sie die Punktdichte auf hoch.Wählen Sie bei der Bildaufnahmeeinrichtung die Bildrate und die Dauer für die Aufnahme aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Aufnahme", um mit der Aufnahme zu beginnen. Das Setup-Panel wird durch das Aufnahmepanel ersetzt und die Daten werden automatisch gespeichert.Erstellen Sie während des Verfahrens Momentaufnahmen, um einen weiteren Vergleich zu ermöglichen. Danach verwenden Sie die ImageJ-Software, um die Überlebens- und Nekrosebereiche zu messen, indem Sie zuerst ein Lineal an der Stelle der Klappe platzieren und Kontrollbilder für makroskopische Messungen machen. Wählen Sie in der ImageJ-Toolbox eine gerade Linie aus, und zeichnen Sie eine Linie über einen Zentimeter des Lineals.Klicken Sie auf Analysieren, Legen Sie Maßstab fest, und geben Sie im Textfeld für bekannte Entfernungen den Wert von einem Zentimeter ein. Klicken Sie auf das Polygonauswahlwerkzeug und zeichnen Sie die Polygonlinien über die Klappe, um die lebensfähige Fläche zu berechnen. Klicken Sie auf Analysieren, um den Flächenwert zu erhalten.Legen Sie dann eine postoperative Kleidung auf das Tier vor dem Gehäuse, um Selbstverstümmelung zu verhindern. Sieben Tage nach der Operation fotografieren Sie den Operationsbereich, um makroskopische Messungen der Klappenüberlebens- und Nekrosebereiche zu ermöglichen. Visualisieren und quantifizieren Sie Perfusionsunterschiede mithilfe der zuvor beschriebenen Laserspeck-Kontrastanalysetechnik, um die Mikrozirkulation der Klappe zu bewerten.Nach der makroskopischen Analyse entfernen Sie die 4-0 Nähte, heben Sie die Klappe an, und verwenden Sie Transit-Zeit-Ultraschall, um den vaskulären Pedikon-Blutfluss neu zu bewerten. Führen Sie Gewebeproben durch Längsteilung der Klappe in zwei Teile durch, die 1,5 mal sechs Zentimeter messen. Unmittelbar nach der Entstehung der mikrochirurgischen Anastomosen erhielten wir höhere Durchblutungswerte als die in der Literatur empfohlenen Mindestströme.So wurden alle mikrochirurgischen Anastomosen eine Woche nach der Operation patentiert. Die Beobachtung der mikrozirkulaorischen Verderbation des Blutflusses während der ischämischen Beleidigung war mit der Laser-Speckle-Kontrastanalyse-Technik möglich. Dazu gehört die sofortige Hyperperfusion während der Klappenreperfusion und perioperativ hatten die verschiedenen Bereiche mit weniger Perfusion ein höheres Risiko für postoperative Klappennekrose, die tatsächlich sieben Tage nach Ende der Studie nekrotisiert wurden.Der Klappenüberlebensbereich nach acht Stunden Ischämie und seine anschließende Reperfusion betrug etwa 40%Bisher veröffentlichte Ergebnisse zeigen statistisch signifikante Unterschiede, wenn dieses Modell mit Klappen verglichen wird, bei denen keine ischämische Beleidigung zugefügt wird. Denken Sie daran, die Klappe Pedikeln zu sezieren, ohne sie zu berühren oder indem Sie die Adventitie so wenig wie möglich greifen, um eine Beschädigung der Gefäßwand zu vermeiden, sowie die Durchführung der richtigen mikrochirurgischen Anastomosen, um Komplikationen aufgrund der chirurgischen Technik zu vermeiden. Intraoperativ ermöglicht uns die Transitzeit-Ultraschalltechnologie, den Blutfluss von mikrochirurgischen Anastomosen zu quantifizieren und so die Flapperfusion vorherzusagen.Postoperativ ermöglicht die Laserspeck-Kontrastanalyse eine Halbkontinuität der Echtzeit-Mapping des Flusses innerhalb freier Klappen. Es ist eine vielversprechende Technik, aber weitere Forschung ist notwendig. Dieses Video hat das Protokoll eines geeigneten Modells zur Bewertung von therapeutischen Wirkstoffen beschrieben, um Ischämie-Reperfusionsverletzungen im Bereich der rekonstruktiven Mikrochirurgie entgegenzuwirken.

Research

JoVE Journal

Medicine

Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Normothermen Herzstillstand und Herz-Lungen: Ein Maus-Modell der Ischämie-Reperfusionsschaden

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

Forschung

Medizin

In situ Transverse Rectus Abdominis Myocutaneous Flap: A Rat Model of Myocutaneous Ischemia Reperfusion Injury

In situ Transverse Rectus Abdominis Myocutaneous Flap: A Rat Model of Myocutaneous Ischemia Reperfusion Injury

In situ Quer Bauchmuskel myokutane Flap: Eine Ratte Modell myokutane Ischämie Reperfusion Injury

Free tissue transfer is the gold standard of reconstructive surgery to repair complex defects not amenable to local options or those requiring composite ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischämie-Reperfusion-Modell des akuten Nierenschädigung und nach der Verletzung Fibrose bei Mäusen

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Einem Mausmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion Injury durch Ligation des linken vorderen absteigenden Arterie

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induktion und Beurteilung der Ischämie-Reperfusion Injury in Langendorff-perfundierten Rattenherzen

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murine Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsschaden

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Ein Maus-Modell der Netzhautischämie-Reperfusionsschaden Durch Erhöhung des intraokularen Druck

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Induzierende Ischemia-Reperfusionsschaden in der Maus-Ohr-Haut für intravital Multiphotonenionisation Imaging von Immunantworten

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Bewertung des koronaren Flussreservats nach Myokard-Ischämie-Reperfusion bei Ratten

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Modifiziertes Heterotopisches Hindlimb Osteomyoskan Flap Model im Rat für translational Vasculariisierte Composite Allotransplantation Research

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...