Name: imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا كلوديا رودرغو وسيمون دورري علي المساعدة التقنية الخبيرة. نشكر الدكتور Niklas j. Gerkau والM.Sc جويل نيلسون للحصول علي المساعدة في اعداد الثقافات شريحة الشكل العضوي. ومولت البحوث التي أجريت في مختبر صاحبه البلاغ رابطه البحوث المانيه (DFG ؛ ل 2795: Ro 2327/13-1 و SPP 1757: Ro 2327/8-2 إلى CRR; و SPP 1757: الشباب الناشئة التمويل البدء إلى RL).

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح. وتلقي المؤلفون دعما ماليا يتيح نشر الوصول المفتوح من قبل نيكون المجهر حلول, دوسلدورف, ألمانيا, التي تنتج الاداات المستخدمة في المادة الفيديو. ولم تشارك الشركة في تصميم التجارب المعروضة هنا ، ولا في تنفيذها ، ولا في معالجه البيانات ، ولا في كتابه المخطوطة.

هنا ، ونحن نظهر اجراء للتعبير الخلية من نوع محدد من ateam 1.03يمك، والقائم علي الحنق ، والمشفرة وراثيا النانويه14، لقياس التغيرات في مستويات ATP في استروسيتيس أو الخلايا العصبية في الثقافات شريحة النسيج العضوي من الدماغ الماوس15. في التسجيلات النموذجية ، ونحن نظهر ان زيادة في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية لا يؤدي إلى تغيير في تركيزات atp في الخلايا العصبية ، في حين ترتفع مستويات atp والنجميه استجابه لهذا التلاعب. وعلاوة علي ذلك ، تظهر نتائجنا انه عند تثبيط الأيض الخلوي ، فان نسبه التاكل من ATeam 1.03يمك تنخفض بسرعة في كل من أنواع الخلايا ، مما يشير إلى انخفاض سريع في ATP داخل الخلايا.
التعبير عن ATeam 1.03يمك في الثقافات شريحة الشكل العضوي يتطلب الحفاظ علي الانسجه في الثقافة في ظل ظروف خاضعه للرقابة لمده لا تقل عن 7-10 يوما. وبدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام ateam 1.03يمك لقياس ATP في شرائح انسجه المخ المعزولة بشكل حاد وفي الأعصاب البصرية للفئران13،15. ومع ذلك ، فان القياسات في الانسجه المعزولة بشكل حاد تستلزم توليد الكائنات المحورة وراثيا أو التطبيق المجسم لنواقل فيروسية في المخ ، بما في ذلك التجارب الحيوانية والبروتوكولات الصارمة لرعاية الماشية. وفي هذا الصدد ، تمثلالتعبيرات المتعلقة بشريحة الانسجه العضوية في النسيج العضوي ، البديل المفيد والقيم22،23. لسنوات عديده الآن ، والنسيج العضوي شريحة الثقافات بمثابه نظام نموذجي الثابتة لدراسة الخصائص العصبية ، والاتصال والتنمية24،25،26. انها ليست فقط الحفاظ علي الهندسة المعمارية الانسجه العامة والتصفيح (الشكل 1) ، ولكن أيضا استضافه الخصائص التفضيلية للثقافات الخلية مثل الوصول المتفوق والتحكم المباشر في الظروف التجريبية. كما تستخدم الثقافات شريحة النسيج العضوي بشكل روتيني للتعبير عن الجينات الاجنبيه باستخدام ناقلات الفيروسية27. تم الإبلاغ عن عده أنواع من النواقل الفيروسية لتوصيل الجينات المتحولة إلى انسجه المخ16,28. النواقل الفيروسية للحث علي التعبير العالي في الخلايا الددميه ، ولكن ليس هيبوكامبال العصبية16، ويمكن ان تولد التفاعل الدالي17. النواقل الفيروسية المرتبطة ب adeno كما هي مستخدمه هنا تظهر كبديل جيد15، وقد أظهرت فعاليتها أيضا في الجسم المجري29.
في حين تستخدم أساسا لدراسة خصائص الخلايا العصبية, وقد وضعت الدراسات الاخيره ان الانسجه النسيجية شريحة الثقافات يمكن أيضا ان تستخدم لتحليل astrocytes. وعاده ما تغطي شرائح مثقف من قبل طبقه من استروسيتيس رد الفعل19،30 (الشكل 5) ، ولكن استروسيتيس يحمل أكثر الأصلي ، والمورفولوجية غير التفاعلية والعمارة الخلوية في طبقات أعمق19،30 (الشكل 5). في هذه الدراسة ، ونحن وصف اجراء للازاله الميكانيكية للندبة الداليه الخارجي ، والذي يؤدي إلى الحصول علي أفضل التجريبية والبصرية من استروسيتيس الاصليه داخل طبقات النسيج العضوي السليم. وعلاوة علي ذلك ، فان ازالته يحسن فعاليه التعبير في طبقات أعمق من شرائح الشكل العضوي ؛ إذا لم تتم أزاله الندبة الطائرة ، فقد تميل المحولات بدون طيار إلى الاقتصار علي طبقات الخلايا السطحية.
هناك العديد من العوامل الميكانيكية الخارجية التي يجب مراعاتها عند اجراء التجارب في شرائح الانسجه. ويمكن للتغير في سرعه الاستحمام بالانصهار ان يحفز حركات الاعداد بأكمله و/أو يحفز التغييرات في التركيز ، مما يؤدي إلى تغييرات عابره اصطناعية لاشاره المستشعر. وعلاوة علي ذلك ، تم الإبلاغ عن كل من استروسيتيس والخلايا العصبية للرد علي تشوه الميكانيكية مثل التي فرضتها معدلات ترويه عاليه32،33. في ايدينا ، وذلك باستخدام مضخة التمعجيه موثوق بها ، مع الحفاظ علي كميات صغيره ومستقره من المحلول الملحي بين الانسجه والهدف (الغضروف المفصلي) نتائج في مستقره الحنق اشاره تحت ظروف خط الأساس في سرعه ترويه المستخدمة هنا (1.5-2.5 mL/min; الشكل 8).
في هذه الدراسة ، ونحن أيضا إثبات ان التصوير القائم علي الحنق مع ATeam 1.03يمك يمكن استخدامها لرصد مستويات ATP في الخلايا العصبية والفلكية. وسيله بديله أدخلت في وقت سابق لقياس ATP الخلوية هو ما يسمي luciferin-luciferin مقايسة34،35،36،37. ومع ذلك ، فان هذا النهج يقوم علي تصوير التلالؤ الإحيائي ولا يوفر سوي دقه منخفضه زمنيا ومكانيا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى ارتفاع مستويات الضجيج في الخلفية. طريقه أخرى تستخدم بشكل روتيني في السنوات الاخيره كان التصوير من التغيرات في تركيز المغنيسيوم داخل الخلايا باستخدام الأيونات الحساسة الفلوروكوفيري المغنيسيوم الأخضر38،39،40. ويتصل هذا النهج بالملاحظة التي مفادها ان استهلاك ATP يؤدي إلى الإفراج عن المغنيسيوم في العامل المشترك. التصوير مع المغنيسيوم الأخضر التالي يوفر فقط تقديرا ثانويا للتغيرات في مستويات ATP. وعلاوة علي ذلك ، المغنيسيوم الأخضر هو أيضا حساسة للتغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا ، وإدخال صعوبة أخرى عند تفسير النتائج التي تم الحصول عليها مع هذه الطريقة.
التالي ، فان التطور الأخير لل نانوسينسيرس المرمزة وراثيا للتصويرالمباشر لنواتج الأيض الخلوية ، يمثل خطوه كبيره إلىالامام 11 ،12. تم إنشاء العديد من أجهزه الاستشعار المختلفة التي يمكن استخدامها لقياس ATP داخل الخلايا36،41،42،43. ومن بين تلك المؤشرات الفلورسنت الفلورية "كوين"41 وكذلك بيركيفالهر ، الذي يستشعر ATP: ADP نسبه42. في حين ان المسبار الأخير هو أداه قيمه لدراسة حاله الطاقة من الخلايا ، فانه يتطلب قياس متزامن للتغيرات فيال42الهيدروجيني.
ATeam هو نانوناناو العديد من المتغيرات الموجودة ، والتي-من بين أمور أخرى-تختلف في تقارب ملزمه ل ATP14. في المختبر, ATeam 1.03يمك يسلك كد من 1.2 mM في 37 °c, الذي هو علي مقربه من مستويات ATP الخلوية المحددة في أنواع مختلفه من الخلايا العصبية, تتراوح بين المهاد والمخيخ34 إلى الحصين37,44,45. في قياسات كوفيت ، ادي خفض درجه الحرارة بنسبه 10 درجه مئوية إلى انخفاض كبير في التقارب الملزم من ateam 1.03يمك إلى ATP ، مما يوحي بأنه قد لا يكون مثاليا للتصوير الخلوي في درجه حرارة الغرفة14. لدينا دراسة سابقه15، ومع ذلك ، أظهرت ان السلوك والاستجابة من ateam 1.03يمك المعرب عنها في الخلايا العصبية و استروسيتيس للتلاعب مختلفه مماثله في الفسيولوجية القريبة ودرجه حرارة الغرفة ، مما يدل علي ان الاستشعار يسمح تحديد موثوق بها مستويات ATP داخل الخلايا في كلا الحالتين. الاضافه إلى ذلك ، تناولت تجاربنا السابقة حساسية الأس الهيدروجيني من ATeam 1.03يمك المعرب عنها داخل الخلايا15، والتي تبين انه غير حساس للتغيرات في الأس الهيدروجيني في الخلايا من قبل حوالي 0.1-0.2 وحدات الحموضة. إذا كان كد في نطاق منخفض مم هو مصدر قلق ، يمكن استخدام المتغيرات ateam البديل14، من بينها المتغيرات الحمراء تحولت من ATEAM ("الذهاب ateam")43.
تجاربنا باستخدام ateam 1.03يمك تثبت ان زيادة في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية من قبل بضعة ملم فقط (من 3 إلى 8 ملم) يؤدي إلى زيادة عابره في نسبهاليمني 1.03 يمك في استروسيتيس في ثقافة شريحة الشكل العضوي. هذه الملاحظة تؤكد الدراسات السابقة15,46 ويشير بوضوح إلى ان استروسيتيس الاستجابة للإفراج عن البوتاسيوم من قبل الخلايا العصبية النشطة مع زيادة في إنتاج ATP, في الغالب علي الأرجح نتيجة لتحفيزna +/K +-atpase وna +/hco3- cotransporter, علي التوالي47,48. وعلي النقيض من ذلك ، لم تظهر الخلايا العصبية استجابه ، وهو ما يتماشى مع العمل السابق وكذلك15. كلا أنواع الخلايا ، ومع ذلك ، بسرعة وبقوة رد فعل لتثبيط تحلل الخلوية والتنفس الميتوكوندريا كما هو مبين قبل15. في ظل ظروف نقص التروية الكيميائية ، انخفضت نسب ATeam الحنق إلى مستوي مستقر جديد ، مما يدل علي استنزاف الاسمية ATP الخلوية. وتشير النتيجة الاخيره إلى ان كلا من الخلايا العصبية وكذلك استروسيتيس يحمل الاستهلاك ذات الصلة من ATP أيضا تحت ظروف ثابته الدولة دون تحفيز إضافي من قبل تنشيط متشابك أو تطبيق الناقلات العصبية. معا ، نستنتج ان التصوير القائم علي التاكل مع النانو المشفرة وراثيا ، من بينها ATeam 1.03يمك، سيوفر نهجا قيما لتوضيح العمليات الخلوية التي هي المسؤولة عن التغييرات في مستويات atp داخل الخلايا واستهلاك atp الخلوية في ظل ظروف مختلفه.

النشاط الكهربائي المثير من الخلايا العصبية يستند إلى حد كبير علي تدفق الشحنات مثل الصوديوم (Na +) والبوتاسيوم (K +) عبر اغشيه البلازما الخاصة بهم. التالي فان صيانة التدرجات الكهروكيميائية لهذين الأيونين مطلوبه للاشاره. ويتحقق هذا من قبل Na الخلوية +/ك +-atpase (nka) ، وأعرب بشكل مطلق مضخة الغشاء الكهربائي ، التي البثق 3Na + من الخلية في مقابل 2K + من الفضاء خارج الخلية ، والتي تتطلب استهلاك جزيء واحد من ATP لكل دوره النقل1. بالاضافه إلى NKA ، وهناك العديد من الناقلات الأيونات الأخرى المستهلكة ATP بما في ذلك غشاء البلازما Ca2 +-atpase ، وهو أمر حيوي لل ca داخل الخلايا2 + التوازن وتصديرها بعد النشاط الناجم عن تدفق2. في الحويصلات بريسينابتيك ، فاكولار-نوعH +-atpase (v-atpase) يخلق التدرج البروتون اللازمة لامتصاص النواقل العصبية في هذا المقصورة3.
في حين ان نشاط الخلايا العصبية التالي يتطلب كميه كبيره من ATP4, انها لا تظهر قدره كبيره لتخزين الطاقة. بدلا من, يبدو انها تعتمد علي التفاعلات الايضيه مع astrocytes المجاورة, مخازن الجليكوجين الرئيسية في الدماغ5. وقد اقترح ان الجليكوجين والنجميه يلعب في الواقع دورا هاما في دعم احتياجات الطاقة العصبية; وظاهره رئيسيه في هذا الاقتراح اقتران العصبية الايضيه بين نوعي الخلية هو قدره استروسيتيس لزيادة إنتاجها ATP استجابه للنشاط العصبية6,7,8. هذه الفرضية, المعروفة باسم المكوك اللاكتات العصبية astrocyte (anls), لا يزال قيد المناقشة, لان العمل الأخرى قدمت أدله علي ان الخلايا العصبية قد أيضا زيادة معدل الخاصة بهم من تحلل الجلوكوز استجابه لتحفيز9,10, تعكس ضرورة المزيد من الطرق والنهج لدراسة التفاعل العصبية-
التحقيق في التمثيل الغذائي للطاقة الخلوية ومستويات ATP في الخلايا العصبية و استروسيتيس لتوضيح التفاعلات الايضيه العصبية الدبقيه قد أعيقت منذ فتره طويلة بسبب عدم وجود تحقيقات مناسبه للكشف عن التغيرات في تركيزات المستقلب في الخلايا الحية في انسجه المخ. ومع ذلك ، فقد وفر العقد الأخير طفرة في تطوير أدوات جديده وتحقيقات فلورية جديده مرمزه وراثيا لنواتج الأيض المختلفة ، بما في ذلك أجهزه الاستشعار لل ATP ، اللاكتات ، بيروفات وغيرها11،12. باستخدام هذه الاداات ، أصبح من الممكن الآن مباشره معالجه الاسئله المتعلقة باستهلاك ATP الخلوي والتغيرات في مستويات الطاقة الخلوية علي مستوي الخلية الواحدة وبطريقه محدده من نوع الخلية في انسجه المخ السليمة13.
في العمل الحالي ، ونحن وصف اجراء لتصور ديناميات ATP عصاري خلوي علي الخلايا العصبية و استروسيتيس من شرائح الدماغ المجسم المثقف. نعرض كيفيه استخدام النواقل الفيروسية المرتبطة بالموجات العالية (aav) للتعبير المحدد من نوع الخلية عن الترميز الوراثي ATP-نانوسيتور ateam 1.03يمك (14) في الخلايا العصبية و استروسيتيس من شرائح الدماغ الماوس التي يمكن الاحتفاظ بها في ثقافة الخلية لعده أسابيع15. يتم وصف اجراء لكيفيه أزاله الندبة الداليه التي تغطي شرائح الانسجه المستزرعة ، مما يحسن امكانيه الوصول البصري وتصوير الخلايا في طبقات النسيج العضوي تحت. وأخيرا ، ونحن نظهر كيف ATeam 1.03يمك يمكن استخدامها لأداء التصوير القائم علي الحنق من التغييرات في مستويات ATP الخلوية في هذا الاعداد. هذا الأسلوب يستضيف المزايا الرئيسية التي لا تتطلب إجراءات الدماغ الجراحية ، ويوفر مستويات عاليه من التعبير عن الاستشعار ونوعيه الخلية في شرائح الدماغ مثقف ، والحد من غزو أو الإجهاد في الخلايا بالمقارنة مع غيرها من الطرق ، مثل التحويل عن طريق الكهرباء أو نقل مع ناقلات الفيروسيةالأخرى10،16، بالاضافه إلى ذلك ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول علي الأخرى التي تستند إلى التاكل النانويه ، من بينها المتغيرات من 1.03 ATeam التي توفر تقارب ربط اقل ل ATP14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxyglucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L07338</td>
			<td>Non-metabolizable glucose analog</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-IMA-410-019 Argon laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>488 nm wavelength argon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3525.1</td>
			<td>Antioxidant, Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 483/32</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 542/27</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 455 LP</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 505 LPXR</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scannig microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit)</td>
			<td>OriginLab corporation</td>
			<td></td>
			<td>Scientific graphing and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Caelo</td>
			<td>2580-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td>Perfusion chamber for live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394</td>
			<td>With Phenol Red for pH monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator HERAcell &#174; 150 with decontamination routine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAsafe KS/KSP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>26050088</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td>SVI Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.52i</td>
			<td>Wayne Rasban national Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software available in the public domain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP serie peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>High-precisionmulti-channel pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout software, Illustrator CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 16</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software for basic data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture insert</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7278</td>
			<td>Synthetic cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator Polychrome V</td>
			<td>Thermo Scientific/FEI</td>
			<td></td>
			<td>Ultra fast switching monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3 (Sodium Azide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &#8734;/0 WD 2.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Water Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements 4.50 advanced Research</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software. Upgraded version for FRET imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Pro Liquid GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS 6 Version 13.0</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v244</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v307</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WVIEW GEMINI optic system</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Emission Image Splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk

النشاط العصبي في الجهاز العصبي المركزي (CNS) يستدعي ارتفاع الطلب علي الطاقة الخلوية التي يوفرها انهيار الفوسفات الثلاثي (ATP). هناك حاجه إلى حصة كبيره من ATP لأعاده تثبيت التدرجات أيون عبر اغشيه البلازما المتدهورة بواسطة الإشارات الكهربائية من الخلايا العصبية. هناك أدله علي ان استروسيتيس-في حين لا توليد الإشارات الكهربائية السريعة أنفسهم-الخضوع لزيادة إنتاج ATP استجابه للنشاط العصبي ودعم الخلايا العصبية النشطة من خلال توفير نواتج الأيض الطاقة لهم. التطور الأخير لأجهزه الاستشعار المشفرة وراثيا لنواتج الأيض مختلفه تمكن الآن دراسة مثل هذه التفاعلات الايضيه بين الخلايا العصبية و astrocytes. هنا ، ونحن وصف بروتوكول للتعبير عن نوع الخلية محدده من ATP الحساسة الفلورية الرنين نقل الطاقة-(الحنق-) الاستشعار ATeam 1.03يمك في الانسجه العضوية شريحة الثقافات من الحصين الماوس والقشرة باستخدام النواقل الفيروسية المرتبطة ADENO (aav). وعلاوة علي ذلك ، فاننا نثبت كيف يمكن استخدام هذا المستشعر للقياس الديناميكي للتغيرات في مستويات ATP الخلوية في الخلايا العصبية والأسطرلابات عند الزيادات في البوتاسيوم خارج الخلية والحث التالي لنقص التروية الكيميائية (اي تثبيط استقلاب الطاقة الخلوية).

ناقلات AAV هي أداه موثوق بها للتعبير بشكل انتقائي عن الجينات الاجنبيه في الخلايا داخل الانسجه الحية16. التطبيق المباشر لطائرات بالطائرات التي تحتوي علي الكاسيت التسلسلي ل ATeam 1.03يمك ومروج محدد ينتج عنه تعبير عالي عن المستشعر في نوع الخلية المختارة. في DIV 14 (~ 10 أيام بعد محول) ، والخلايا العصبية التعبير عن ATeam تحت المروج المشبك الإنسان وجدت في كثافة عاليه في النيوكورتكس من شرائح الانسجه المثقفة في أعماق تصل إلى 50 ميكرومتر تحت سطح الشريحة (الشكل 5ا). ويمكن تحقيق نتائج مماثله في الحصين (الشكل 5ب).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg"> الشكل 5: تصور الخلايا العصبية التي تعبر عن ATeam 1.03يمك في شرائح الدماغ المجسمة العضوية المثقفة. الصور علي اليسار تتوافق مع توقعات التركيز الموسعة من 43 المقاطع البصرية (1.05 μm كل) من الانسجه القشرية (ا) و (ب) من 70 المقاطع البصرية (0.6 μm كل) من الانسجه هيبوكامبال. تمثل الصور التي علي اليمين عرض وحده التخزين لنفس الإسقاط. الخلايا مرمزه وفقا لعمقها بالنسبة لسطح الشريحة كما هو مبين بمقياس اللون علي اليمين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
لقياس مستويات ATP في astrocytes ، يتم التعبير عن ATeam 1.03يمك تحت سيطرة المروج البشري الحمضي الليفي (gfap). وهذا يؤدي إلى الكفاءة في توصيل الخلايا في كل من نيوكورتكس والحصين من شرائح الانسجه المثقفة (الشكل 6). وعلي وجه الخصوص ، يمكن تمييز النمطين الظاهريين المورفولوجية المختلفة ، اعتمادا علي عمق نسبه إلى سطح الاستعدادات شريحة. في الطبقة السطحية الاولي ، تتميز الخلايا بالعمليات الاوليه السميكة التي يتم ترتيبها في الغالب بالتوازي مع السطح. هذه الخلايا تظهر المجالات متداخلة بشده ، وخلق العمل المكثف من استروسيتيس علي ما يبدو رد الفعل (الشكل 6). في طبقات أعمق (30-60 μm من السطح) ، والخلايا الفلكية المحولة تظهر العمليات الخلوية الجميلة التي تشكل مجالات كرويه إلى حد كبير وشكلها يشبه ان من استروسيتيس في الموقع كما ذكر في وقت سابق19،20،21 (الشكل 6). للحصول علي أفضل محوله من الطبقة الفلكية الأعمق ، فضلا عن تحسين الوصول البصري إلى هذه الطبقات الأعمق ، يمكن أزاله الانسجه الندبة الدصيه كما هو موضح في الخطوة 4.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg"> الشكل 6: تصور الأسطرلابات التي تعبر عن ATeam 1.03يمك في شرائح الدماغ المجسمة العضوية المستزرعة. الصورة علي اليسار يتوافق مع الإسقاط التركيز الموسعة من 191 المقاطع البصرية (0.45 μm لكل منهما). ولأغراض التوضيح ، استبعدت الندبة الدصيه من إسقاط الأسطرلاب. وتمثل الصور التي علي اليمين عرض الحجم لنفس الإسقاط قبل وبعد أزاله الندبة الددالي. الخلايا مرمزه بألوان وفقا لعمقها بالنسبة لسطح الشريحة كما هو مبين بمقاييس اللون علي اليمين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
يسمح التعبير الناجح ل ATeam 1.03يمك بالقياس الديناميكي للتغيرات في مستويات ATP في الخلايا العصبية أو astrocytes ، اعتمادا علي المروج المستخدم (انظر أعلاه). أجريت التجارب في حمام تجريبي باستمرار perfused مع E-ACSF (فقاعات مع 95 ٪ O2/5 ٪ CO2). في الشرائح العضوية التي تعبر عن ATeam 1.03يمك في الخلايا العصبية الهيبوكامباله ، تم اختيار مناطق الاهتمام (rois) قبل البدء في التسجيل ، والتي تمثل somata من الخلايا الهرمية (الشكل 7ا). وعلاوة علي ذلك ، اختيرت منطقه لطرح المعلومات الاساسيه (الشكل 7(ا)). ثم تم جمع انبعاثات الزهرة وكذلك الفلورية eCFP لكل من هذه ROIs بشكل منفصل ووصفها بأنها مستوي الانبعاثات مضان مع مرور الوقت (الشكل 7ب). بعد تسجيل الفلوري تحت ظروف السيطرة لعده دقائق لضمان خط أساس مستقر ، وتحولت الأيض الخلوية من خلال تعريض اعداد شريحة لمحلول ملحي خاليه من الجلوكوز ، والتي تم أضافه 5 مم الصوديوم أزيد (نان3) لمده دقيقه واحده (الشكل 7ب). هذا التلاعب الناجم عن التغييرات المعاكسة في كثافة الانبعاثات من زوج الحنق (الشكل 7ب، لوحات اليسار) ، مع انخفاض الزهرة (527 نانومتر) وزيادة ecfp (475 nm) الانبعاثات. حساب نسبه الحنق عن طريق تقسيم الانبعاثات الفلورية فينوس من قبل eCFP (Fفينوس/Fecfp) أسفرت عن الإشارات التي تعكس التغيرات النسبية في مستويات ATP داخل الخلايا ، ما يسمي "نسبه الحنق Ateam" (الشكل 7ب، اللوحة اليمني). في جميع الخلايا العصبية المسجلة (ن = 70 خليه في N = 5 شرائح) ، نان3 تسبب انخفاض عكسها في نسبه ATEAM الحنق ، مما يدل علي انخفاض عكسها في مستويات ATP داخل الخلايا عند تثبيط الأيض الخلوية.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg"> الشكل 7: بيان الفترة الزمنيه الفاصلة بين الصور والتصوير. (ا) اعلي اليسار: صوره فلورية واسعه النطاق للطبقة الهرمية والطبقة الشعاعية لمنطقه CA1 من شريحة هيبوكامباله من الطراز العضوي المثقف تعبر عن ateam 1.03يمك في الخلايا العصبية. اعلي اليمين: عرض الموسع للقسم محاصر كما هو مبين علي اليسار. خطوط بيضاء تحدد مناطق الاهتمام (ROIs) 1-3 تمثل الأجسام الخلية من الخلايا العصبية CA1 هرمي المختارة للتحليل في (ب). BG يمثل العائد علي الاستثمار الذي تم اختياره لتصحيح الخلفية. أسفل: الصور الزائفة الملونة التي تمثل الانبعاثات فلوري من الزهرة (الأخضر) ، eCFP (الأرجواني) ونسبه فينوس/eCFP. (ب) تسجيل الفاصل الزمني في rois 1-3 ، الذي يمثل أجسام الخلايا العصبية (انظر A). اثار علي اليسار عرض تطبيع الانبعاثات فلوري من الزهرة (الأخضر) و eCFP (أرجواني). تظهر الآثار علي اليمين نسبه ATeam الحنق المقابلة. لاحظ ان ترويه مع 5 مم نان3 في غياب الجلوكوز خارج الخلية لمده 1 دقيقه (شريط رمادي) يدفع انخفاض عكسها في نسبه ateam الحنق ، مما يدل علي انخفاض في تركيز ATP داخل الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
لضمان استقرار الاعداد والاستشعار تحت ظروف التجربة علي المدى الطويل ، والشرائح التعبير عن ateam في الخلايا العصبية أو استروسيتيس باستمرار perfused مع acsf لفترات طويلة (> 50 دقيقه ؛ ن = 12 خليه لكل منهما ، n = 3 otcs من 3 أدمغه). في ظل هذه الظروف ، لم تتغير نسبه ATeam الحنق (الشكل 8). تعريض الاستعدادات إلى رابطه الدول المستقلة التي تحتوي علي مثبطات الأيض ("نقص التروية الكيميائية" ، انظر الجدول 1) ، في المقابل ، ادي مره أخرى في انخفاض المتوقع في نسبه ATEAM الحنق كما لوحظ أعلاه.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg"> الشكل 8: التجارب الاساسيه التي تستخدم ATeam. علي المدى الطويل ateam التاكل نسبه التصوير في 14 خلايا مختلفه تحت ظروف خط الأساس في الخلايا العصبية (اعلي) و استروسيتيس (أسفل). وقد أخذت البيانات في ظروف مماثله بوصفها بيانات تجريبية أخرى. وفي نهاية كل قياس ، تم استخلاص الاسكيميه الكيميائية عن طريق الانصهار مع رابطه الدول المستقلة كما هو مبين في السهم. ملاحظه: نسب الاساسيه ATeam التاكل مستقره مع مرور الوقت ضمن شروط الأساس. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
بعد ذلك ، حللنا ردود الخلايا العصبية و استروسيتيس التعبير عن ateam 1.03يمك إلى زيادة في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية. بعد إنشاء خط أساس مستقر ، كانت الخلايا العصبية perfused مع المالحة التي تم فيها زيادة تركيز البوتاسيوم من 3 إلى 8 ملم لمده 3 دقائق (الشكل 9ا). لم يؤدي هذا التلاعب ، ومع ذلك ، إلى تغيير قابل للكشف في نسبه ATeam الحنق (ن = 56 الخلايا في N = 5 شرائح). ولضمان استجابه جهاز الاستشعار للتغير في مستويات ATP ، تعرضت الشرائح مره أخرى لفتره مستديمه من نقص التروية الكيميائية التي تم الحصول عليها عن طريق استبدال رابطه الدول المستقلة بالاجهزه الكترونيه. وادي نقص التروية الكيميائية إلى انخفاض سريع في نسبه ATeam الحنق إلى مستوي جديد ومستقر ، مما يشير إلى نضوب الاسمية ATP بعد 2-3 دقيقه (الشكل 9ا).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg"> الشكل 9: التجارب التمثيلية التي توضح التغيرات في مستويات ATP في الخلايا العصبية و astrocytes. (A،B): الصور علي اليسار المعرض ateam الفلورية من الخلايا العصبية والفلكية الموجودة في منطقه هيبوكامبال CA1 من شرائح الشكل العضوي. تمثل الآثار علي اليمين تسجيلات الفاصل الزمني لنسبه ATeam الحنق التي تم الحصول عليها من عائد الاستثمار المتمركز علي جسم خليه واحده. في كلا التجربتين ، تعرضت الشرائح أولا لزيادة في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية لمده 3 دقائق (انظر الشريط) ، تليها التعرض النهائي لنقص التروية الكيميائية. لاحظ انه في حين ان الخلايا العصبية لا تستجيب لارتفاع البوتاسيوم خارج الخلية (A) ، فان استروسيتيس تتفاعل مع زيادة في ATP (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
تم تنفيذ نفس البروتوكول التجريبي مع شرائح ، والتي تم التعبير عنها ATeam 1.03يمك في astrocytes. علي النقيض من ما لوحظ في الخلايا العصبية ، ورد فعل استروسيتيس للزيادة في البوتاسيوم خارج الخلية من خلال زيادة عكسها في نسبه ateam الحنق ، مما يدل علي زيادة في مستويات ATP داخل الخلايا (ن = 70 الخلايا في n = 5 شرائح) (الشكل 9ب). وأسفر التعرض اللاحق لنقص التروية الكيميائية ، كما هو متوقع ، في انخفاض كبير في نسبه ATeam الحنق ، مما يدل علي استنفاد الاسمية ATP داخل الخلايا (الشكل 9ب).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

نحن وصف بروتوكول للتعبير عن نوع الخلية محدده من المستشعر القائم علي التاكل المرمزة وراثيا ATeam 1.03يمك في الثقافات شريحة النمط العضوي من الدماغ الامامي الماوس. علاوة علي ذلك ، نعرض كيفيه استخدام هذا المستشعر للتصوير الديناميكي لمستويات ATP الخلوية في الخلايا العصبية و astrocytes.

التصوير من ATP داخل الخلايا في شرائح الانسجه العضوية من الدماغ الماوس باستخدام الاستشعار القائم علي التاكل ATeam 1.03يمك

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

هنا نُظهر كيفية استخدام مستشعر الـ ATP الحساس من طراز FRET ATeam 1.03 YEMK لقياسات ديناميكية للتغيرات في مستويات ATP العصبية والأسترالية في شرائح فرس النهر المزرعة عضوياً. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن المرء يمكن دراسة استقلاب الطاقة في أنسجة الدماغ الحية في بيئة تسيطر عليها، بيئة ذات مستويات عالية من التعبير الاستشعار. هذه التقنية قد تساعد في الحصول على رؤى في الميكانيكا pathomeisms، والأمراض الكامنة، أو تلف الدماغ، على سبيل المثال، الناجمة عن الحرمان من الطاقة، مثل السكتة الدماغية.يمكن، من حيث المبدأ، أن تستخدم لدراسة مستويات ATP، ليس فقط في أنسجة الدماغ، ولكن في الأجهزة الأخرى كذلك. لتشغيل هذه التجربة بنجاح، فمن الضروري لتنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على زراعة الأنسجة حذرا للغاية والحفاظ على العقم. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة إلى بعض المعرفة التصوير الفلورسنت الخلوي.معالجة الأنسجة في نهج الأكثر تطورا وتصور أمر حيوي لفهم الإجراءات المناسبة. وينطبق الشيء نفسه على تجارب التصوير. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون رودريغو ليرشوندي، وهو من الـ"ما بعد الأدُك"، و"نا هوانغ"، وهو طالب ماجستير من المختبر.في طبق بيتري بارد من الجليد مليء بـ ACSF ، ضع الدماغ على غشاء تصفية. فصل نصفي الكرة الأرضية وأداء قطع باراسيتتال بزاوية 45 درجة. إصلاح نصف الكرة الأرضية واحد في مرحلة النسيج هزاز مع superglue، ونقل على الفور كتلة الأنسجة إلى حمام هزاز يحتوي على الجليد الباردة ACSF فقاعة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ الأكسجين.محاذاة الأنسجة في حمام هزاز. الحفاظ على نصف الكرة الثاني في ACSF الجليد البارد حتى تقطيع. ضبط هزاز لقطع شرائح في 250 إلى 400 ميكرومتر.بعد قطع الشريحة، حدد تكوين قرن آمون استنادًا إلى مظهره المورفولوجي النموذجي وعزله باستخدام الإبر تحت الجلد، مع الحفاظ على جزء قشرة الدماغ المجاورة لقنا الحصين. ضع الشريحة على شبكة في ACSF ، وتدفأ إلى 34 درجة مئوية وفقاعات مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ من الأكسجين حتى يتم جمع جميع الشرائح. نقل شرائح إلى مجلس الوزراء تدفق لارينار على الاستمرار في ظل ظروف معقمة.مع ماصة باستور المقلوبة والمعقمة والزجاجية، قم بنقل الشرائح بلطف من ACSF إلى أحد أطباق بيتري الدافئة مسبقًا المليئة بمحلول Hanks'salt العقيم. تغيير الماصات ونقل شرائح إلى طبق الثقافة الثانية. كرر العملية خمس مرات بشكل عام.نقل أقل HBSS ممكن إلى لوحات الثقافة التالية. باستخدام ماصة، ضع شريحة واحدة بلطف في كل مرة على الجزء العلوي من إدراج الثقافة. تجنب الاضطرابات في الماصات، وانتظر حتى تنزل الشريحة إلى طرف ماصة باستور.كرر العملية لكل شريحة. ضع شريحتين على غشاء. قم بإزالة أي حل هانك الزائد من أعلى الإدراج باستخدام تلميح دقيق.الحفاظ على الثقافات في حاضنة مرطبة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية حتى يوم التجربة. استبدال الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام. دون لمس الأنسجة، وتطبيق 0.5 ميكرولترات من ناقلات المخفف مباشرة إلى الجزء العلوي من كل شريحة.وأخيرا، ضع شرائح مرة أخرى في الحاضنة والحفاظ عليها هناك لمدة ستة أيام أخرى على الأقل. قبل بدء التجربة، قم بنقل إدراج يحتوي على شرائح مثقفة في غطاء محرك السيارة العقيم، وضعه في طبق 30 ملليمتر يحتوي على ملليلتر واحد من متوسطة ثقافة شريحة الأعضاء، أو الحد الأدنى من الوسط الأساسي. ضع الطبق تحت المنظار المجسم وركز على سطح الشريحة.استخدام اثنين من الإبر تحت الجلد العقيمة لجعل قصيرة عبر قطع الحق على حواف ضيقة من شريحة مختارة، وفي الطبقة العليا دون إتلاف الأنسجة تحتها. لإزالة شريحة المعدة من إدراج، عقد حواف الغشاء مع ملاقط واستخدام مشرط عقيمة لجعل مستقيم، والتخفيضات المتوازية إلى الغشاء، وتشكيل مربع أو مثلث مع شريحة في المركز. إذا كان إدراج تستضيف شرائح إضافية، ونقلها مرة أخرى إلى لوحة الأصلي وإلى الحاضنة.سوف يمنع التوتر السطحي للوسيلة تسربه على سطح الغشاء. إعداد ACSF التجريبية والحصول على حى الهيدروجيني من 7.4 عن طريق محتدما مع 95٪ من الأوكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون من خلال أنابيب إدراجها متصلة إمدادات كاربوجين لمدة ثلاثين دقيقة على الأقل. الحفاظ على فقاعة المالحة خلال التجربة بأكملها.ثم قم بالتبديل على مصدر الضوء الفلورسنت لمقياس أحادي اللون. نقل ثقافة شريحة الأعضاء إلى غرفة التجريبية. وضع شبكة على رأس ثقافة شريحة organotypic مع الإطار إلى أسفل، وليس لمس الثقافة، والمواضيع حتى، لمس الغشاء.ضع الغرفة على مرحلة المجهر وتوصيلها بنظام الضخ. قم بتشغيل المضخة الم Peristaltic بمعدل تدفق 1.5 إلى 2.5 ملليلتر في الدقيقة. تأكد من عدم تسرب نظام التسريب.وباستخدام ضوء الإرسال، قم بتركيز الشريحة المستزرعة وحدد المجال الذي يجب أن تجري فيه التجارب. قبل بدء تجارب التصوير، انتظر 15 دقيقة على الأقل للسماح للشرائح بالتكيف مع الظروف المالحة، ثم قم بتشغيل الكاميرا وبرنامج التصوير. تثير البروتين الفلورسنت المانح في 435 نانومتر.تعيين وقت التعرض إلى ما بين 40 إلى 90 ميلي ثانية. ثم أدخل المرآة الديكروية والمرشحات في وحدة تقسيم شعاع. تقسيم الانبعاثات fluorescence في 500 نانومتر مع تقسيم صورة الانبعاثات، وتوظيف مرشحات تمرير الفرقة في 482 زائد أو ناقص 16 و 542 زائد أو ناقص 13.5 نانومتر لمزيد من عزل المانحة ومقبول fluorescence.حدد منطقة من الاهتمام على ما يبدو خالية من الفلورس الخلوية لطرح الخلفية. دائرة هياكل واحدة من الأنسجة المسمى في الصورة على الشاشة لإنشاء ROIs. تعيين تردد الحصول على الصورة ووقت التسجيل العام.بالنسبة للتجارب التي تزيد عن 30 دقيقة، يوصى بتردد شراء من 0.2 إلى 0.5 هيرتز لمنع السمية الضوئية. بعد ذلك، بدء التسجيل. لإحداث تغييرات في ATP داخل الخلايا، قم بتبديل أنبوب الضخ من ACSF القياسي إلى محلول ملحي يحتوي على مثبطات الأيض، على سبيل المثال، محلول نقص التروية الكيميائي.بدلا من ذلك، استخدم ملحا مع تركيز البوتاسيوم مرتفعة في ثمانية ملليمتر لتقليد الإفراج عن أيون البوتاسيوم من الخلايا العصبية النشطة. مباشرة بعد التسجيلات، وتبادل ACSF التجريبية مع ACSF أكوام المخزنة. ثم نقل غرفة التسجيل التي تحتوي على ثقافة شريحة إلى مجهر المسح الضوئي بالليزر confocal.التقاط صور مكدس Z في أعلى دقة Z ممكن في التكوين البصرية معين. في هذا البروتوكول، بعد عشرة أيام من عملية النقل، تم العثور على الخلايا العصبية التي تعبر عن ATeam 1.03 YEMK بكثافة عالية في القشرة الجديدة لشرائح الأنسجة المستزرعة في أعماق تصل إلى 50 ميكرومتر تحت سطح الشريحة. وقد تحققت نتائج مماثلة في قرن آمون.بالنسبة للستروبوتات الهوائية، تم التعبير عن ATeam 1.03 YEMK تحت سيطرة مروج البروتين الحمضي الليفي الليفي البشري، وشرائح organotypic التي تعبر عن ATeam 1.03 YEMK في الخلايا العصبية قرن آموس المختارة ROIs تمثل سوماتا من الخلايا الهرمية. بعد تعريض الشريحة إلى 5 ملليمولار الصوديوم أزيد في غياب الجلوكوز خارج الخلية لمدة دقيقة واحدة، تم إحداث تغييرات معاكسة في كثافة الانبعاثات من الزوج فريت. ولوحظ أيضا انخفاض قابل للعكس في نسبة الـ ATeam FRET.على المدى الطويل ATeam فريت نسبة في 14 خلايا مختلفة في ظل ظروف خط الأساس في الخلايا العصبية وstrocytes تبين أن ATeam هو جهاز استشعار موثوق ومستقر. يرجى ملاحظة أن نقص التروية الكيميائية أدى إلى الانخفاض القوي المتوقع في نسبة ATeam في كلا النوعين من الخلايا في نهاية هذه التجربة. لم ينتج عن زيادة في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية من ثلاثة إلى ثمانية ملليمترات لمدة ثلاث دقائق في تغيير يمكن اكتشافه في الخلايا العصبية التي تعبر عن ATeam 1.03 YEMK.في المقابل، تفاعلت الخلايا الفلكية مع الزيادة في البوتاسيوم خارج الخلية من خلال زيادة قابلة للعكس في نسبة ATeam FRET، مما يشير إلى زيادة في مستويات ATP داخل الخلايا. مرة أخرى، تسبب نقص التروية الكيميائية انخفاض فوري في نسبة ATeam، مما يدل على أن أجهزة الاستشعار يمكن الكشف عن التغيرات في ATP. عند محاولة التصوير الخلوي القائم على FRET كما هو موضح هنا ، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن إنتاج شرائح عالية الجودة في الثقافات العضوية هي خطوة رئيسية.وعلاوة على ذلك، مطلوب إزالة دقيقة من ندبة الدبقية والتصوير على مستوى الخبراء. بعد هذا الإجراء، ينبغي للمرء أيضا أن تكون قادرة على تنفيذ تجربة دمج مختلف nanosensor المستندة إلى فريت لالاستقلابات الخلوية. على سبيل المثال، تلك الجلوكوز أو اللاكتات.وأخيرا وليس آخرا، ينبغي التأكيد على وجوب مراعاة ما يتصل بذلك من أفعال لحماية الحيوانات. وهذا ينطبق أيضا على القوانين الفعالة التي تحكم التعامل مع الكائنات المحورة وراثيا.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية في شرائح الدماغ الأمامي الحاد للماوس الكبار

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselective Biolistic استهداف عضوي في الدماغ شرائح باستخدام بندقية الجينات المعدلة

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

التصوير ألياف هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس عن طريق وضوح / تقنية مكعب

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

في التحليل المتعمق الفسيولوجية لبالسكان خلية المعرفة في الحادة الأنسجة شرائح من الميكعي الجهاز ماوس

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر من الخلايا العصبية المهاجرة في شريحة عضوي نمط ثقافة الفأر الجنينية باستخدام الدماغ<em&gt; في أوتيرو</em&gt; إليكتروبوراتيون

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

تسجيل اللدونة متشابك في شرائح هيبوكامبال الحاد تحتفظ في صغيرة الحجم-إعادة التدوير، ونضح-، وغمر من نوع نظام الدائرة

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

والتصور وتصوير مباشر من العضيات أوليجوديندروسيتي في المخ أورجانوتيبيك الشرائح باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدد والفحص المجهري [كنفوكل]

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

اثنين-فوتون تصوير الجذب Microglial العمليات تجاه ATP أو السيروتونين في الدماغ الحادة شرائح

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

وضع العلامات والتصوير من لويحات اميلويد في انسجه المخ باستخدام الكركمين البوليفينول الطبيعية

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...