Name: imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Claudia Roderigo og Simone Durry for teknisk ekspertbistand. Vi takker Dr. Niklas J. Gerkau og M.Sc. Joel Nelson for hjælp til forberedelsen af de organotypiske skive kulturer. Forskningen i forfatterens laboratorium blev finansieret af den tyske forsknings sammenslutning (DFG; FOR 2795: ro 2327/13-1 og SPP 1757: ro 2327/8-2 til CRR; og SPP 1757: unge glia-opstarts midler til RL).

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser. Forfatterne har modtaget økonomisk støtte, der muliggør åben adgang publikation fra Nikon Micro Scope Solutions, Düsseldorf, Tyskland, som producerer instrumenter, der anvendes i videoen artiklen. Virksomheden var hverken involveret i udformningen af de eksperimenter, der blev præsenteret her, eller i deres udførelse, heller ikke i datahåndteringen, eller i manuskriptet skriftligt.

Her demonstrerer vi en procedure for celle typen specifikt udtryk for ATeam 1.03Yemk, en fret-baseret, genetisk kodet Nanosensor14, til måling af ændringer i ATP-niveauer i astrocytter eller neuroner i organotypiske vævs skive kulturer i muse hjernen15. I eksemplariske optagelser viser vi, at en stigning i den ekstracellulære kaliumkoncentration ikke resulterer i en ændring i ATP-koncentrationerne i neuroner, mens astrocytiske ATP-niveauer stiger som reaktion på denne manipulation. Desuden, vores resultater viser, at ved hæmning af cellulære metabolisme, ATeam 1,03Yemk fret forholdet hurtigt falder i begge celletyper, indikerer en hurtig nedgang i intracellulære ATP.
Udtryk for ATeam 1,03Yemk i organisk skive kulturer kræver vedligeholdelse af vævet i kulturen under kontrollerede forhold i mindst 7-10 dage. Alternativt kan ateam 1.03yemk også anvendes til måling af ATP i akut isolerede hjernevæv skiver og i optiske nerver af mus13,15. Målinger i akut isoleret væv, dog nødvendiggør generering af transgene dyr eller en Stereotaktisk anvendelse af virale vektorer i hjernen, der involverer dyreforsøg og strenge dyrepleje protokoller. I denne henseende er ateam 1,03yemk udtryk i organiske typiske vævs skive kulturer et nyttigt og værdifuldt alternativ22,23. I mange år nu, organotypic vævs skive kulturer tjene som en etableret model system til at studere neurale egenskaber, konnektivitet og udvikling24,25,26. De bevarer ikke kun den generelle vævs arkitektur og laminering (figur 1), men er også vært for de præference egenskaber af cellekulturer såsom overlegen tilgængelighed og direkte kontrol af eksperimentelle forhold. Organotypic vævs skive kulturer er også rutinemæssigt ansat til at udtrykke fremmede gener ved hjælp af virale vektorer27. Flere typer af virale vektorer er blevet rapporteret til at levere transgener i hjernevæv16,28. Adenoviral vektorer inducerer høj ekspression i gliaceller celler, men ikke hippocampus neuroner16, og kan generere gliaceller reaktivitet17. Adeno-associerede virale vektorer som anvendes her fremstå som et godt alternativ15, og deres effektivitet er også blevet vist i vivo29.
Mens der hovedsagelig anvendes til undersøgelse af neuronal egenskaber, nylige undersøgelser har fastslået, at organotypic vævs skive kulturer kan også anvendes til analyse af astrocytter. Kultiverede skiver er normalt dækket af et lag af reaktive astrocytter19,30 (figur 5), men astrocytter udviser en mere indfødt, ikke-reaktiv morfologi og cytoarkitektur i dybere lag19,30 (figur 5). I nærværende undersøgelse beskriver vi en procedure for mekanisk fjernelse af det ydre gliaceller ar, hvilket resulterer i en bedre eksperimentel og optisk tilgængelighed af indfødte astrocytter inden for de rette organotypiske vævs lag. Desuden, dens fjernelse forbedrer ekspression effekt i dybere lag af organotypiske skiver; Hvis det gliale ar ikke fjernes, kan transduktion af AAVs have tendens til at være begrænset til de overfladiske cellelag.
Flere eksterne mekaniske faktorer skal tages i betragtning, når der udføres eksperimenter i vævs skiver. En variation i badet perfusion hastighed kan inducere bevægelser af hele præparatet og/eller inducere ændringer i fokus, hvilket resulterer i kunstige forbigående ændringer af sensorsignalet. Desuden, både astrocytter og neuroner er blevet rapporteret til at reagere på mekanisk deformation såsom pålagt af høje perfusion satser32,33. I vores hænder, ved hjælp af en pålidelig peristaltisk pumpe, sammen med at opretholde små og stabile mængder af saltvand mellem vævet og målet (meniscus) resulterer i en stabil FRET-signal under baseline betingelser ved perfusion hastighed anvendes her (1,5-2,5 mL/min; Figur 8).
I denne undersøgelse viser vi også, at FRET-baseret billeddannelse med ATeam 1.03Yemk kan anvendes til at overvåge ATP-niveauer i neuroner og astrocytter. Et alternativt middel introduceret tidligere til måling af cellulære ATP er den såkaldte luciferin-luciferase assay34,35,36,37. Denne fremgangsmåde er imidlertid baseret på billeddannelse af bioluminescens og giver kun en forholdsvis lav tidsmæssig og rumlig opløsning til dels på grund af høje baggrundsstøj niveauer. En anden metode rutinemæssigt anvendt i de seneste år var billeddannelse af ændringer i den intracellulære magnesium koncentration ved hjælp af ion-følsomme fluoroforet magnesium grøn38,39,40. Denne fremgangsmåde vedrører den konstatering, at et forbrug af ATP resulterer i frigivelsen af dets co-faktor magnesium. Billeddannelse med magnesium grøn giver således kun et sekundært skøn over ændringer i ATP-niveauerne. Desuden er magnesium Green også følsom over for ændringer i intracellulær calcium, hvilket introducerer en anden vanskelighed ved tolkning af resultater opnået med denne metode.
Den seneste udvikling af genetisk kodede nanosensorer til direkte billeddannelse af cellulære metabolitter, derfor repræsenterede et stort skridt fremad11,12. Flere forskellige sensorer blev genereret, der kan anvendes til måling af intracellulære ATP36,41,42,43. Blandt disse er den ratiometriske-fluorescerende ATP-indikator "QUEEN"41 samt PercevalHR, som sanser ATP: ADP ratio42. Mens sidstnævnte sonde er et værdifuldt værktøj til undersøgelse af cellernes energi status, kræver det samtidig måling af ændringer i pH42.
ATeam er en Nanosensor, som der findes flere varianter af, som — blandt andre — adskiller sig fra hinanden i deres bindingsaffinitet for ATP14. In vitro udviser ATeam 1,03yemk en Kd på 1,2 mm ved 37 °c, hvilket er tæt på cellulære ATP-niveauer bestemt i forskellige neuronal celletyper, der spænder fra hypothalamus og cerebellum34 til hippocampus37,44,45. Ved kuvette målinger resulterede sænkning af temperaturen med 10 °C i et signifikant fald i ATeam 1.03Yemens bindingsaffinitet til ATP, hvilket tyder på, at det måske ikke er ideelt til cellulær billeddannelse ved stuetemperatur14. Vores tidligere undersøgelse15, dog, viste, at adfærd og respons af ateam 1,03yemk udtrykt i neuroner og astrocytter til forskellige manipulationer er ens på nær fysiologiske og ved stuetemperatur, hvilket indikerer, at sensoren giver pålidelig bestemmelse af intracellulære ATP niveauer under begge betingelser. Derudover behandlede vores tidligere eksperimenter pH-følsomheden af ATeam 1,03Yemk udtrykt i cellerne15, hvilket viser, at det er ufølsomt over for ændringer i intracellulær pH med ca. 0,1-0,2 pH-enheder. Hvis Kd i den lave mm rækkevidde er en bekymring, alternative ateam varianter kan anvendes14, blandt dem rød-skiftede varianter af ATEAM ("Go-ateam")43.
Vores eksperimenter med ATeam 1,03yemk viser, at en stigning i den ekstracellulære kaliumkoncentration med nogle få mm kun (fra 3 til 8 mm) resulterer i en forbigående stigning i Ateam 1,03yemk ratio i astrocytter i organotypiske skive kultur. Denne observation bekræfter tidligere undersøgelser15,46 og tydeligt indikerer, at astrocytter reagerer på frigivelsen af kalium af aktive neuroner med en stigning i deres ATP-produktion, for det meste sandsynligvis som følge af en stimulering af na+/k+-ATPase ogna +/HCO3- cotrans Porter, henholdsvis47,48. I modsætning til dette viste neuroner ikke et svar, hvilket er i tråd med tidligere arbejde samt15. Begge celletyper reagerede dog hurtigt og stærkt på hæmning af cellulær glycolyse og mitokondrie respiration som vist før15. Under betingelser af kemisk iskæmi, ATeam FRET nøgletal faldt til et nyt stabilt niveau, hvilket indikerer en nominel udtømning af cellulære ATP. Sidstnævnte resultat tyder på, at både neuroner samt astrocytter udviser et relevant forbrug af ATP også under Steady-State betingelser uden yderligere stimulation ved synaptisk aktivering eller anvendelse af neurotransmittere. Tilsammen konkluderer vi, at FRET-baseret billeddannelse med genetisk kodede nanosensorer, blandt dem ATeam 1,03Yemk, vil give en værdifuld tilgang til at belyse de cellulære processer, der er ansvarlige for ændringer i intracellulære ATP-niveauer og cellulære ATP-forbrug under forskellige forhold.

Excitatoriske elektriske aktivitet af neuroner er i vid udstrækning baseret på flux af kationer såsom natrium (na+) og kalium (K+) på tværs af deres plasma membraner. Vedligeholdelse af de elektrokemiske gradienter af disse to ioner er således påkrævet for signalering. Dette opnås ved cellulær na+/k+-ATPase (nka), en allestedsnærværende udtrykt elektro gen transmembran pumpe, som ekstrudere 3 na+ ud af cellen i bytte for 2 K+ fra det ekstracellulære rum, der kræver forbrug af et molekyle af ATP pr. transport cyklus1. Ud over NKA er der flere andre ATP-forbrugende iontransportører, herunder plasma membranen ca2 +-ATPase, hvilket er afgørende for intracellulær ca2 + homøostase og dets eksport efter aktivitets induceret tilstrømning2. I præsynaptiske vesikler skaber en vacuolar-type H+-ATPase (v-ATPase) den protongradient, der er nødvendig for neurotransmitter optagelsen i dette rum3.
Mens aktiviteten af neuroner derfor kræver en betydelig mængde ATP4, de ikke udviser en betydelig kapacitet til oplagring af energi. I stedet, de synes at stole på metaboliske interaktioner med tilstødende astrocytter, de store glykogen butikker i hjernen5. Det er blevet antydet, at astrocytisk glykogen faktisk spiller en vigtig rolle i at støtte neuronal energibehov; og et centralt fænomen i denne foreslåede Neuro-metaboliske kobling mellem de to celletyper er astrocyternes kapacitet til at øge deres ATP-produktion som reaktion på neuronal aktivitet6,7,8. Denne hypotese, kendt som astrocyte-neuron laktat shuttle (anls), er stadig under debat, fordi andet arbejde har givet bevis for, at neuroner også kan øge deres egen sats af glycolyse som reaktion på stimulation9,10, afspejler nødvendigheden af yderligere metoder og tilgange til at studere Neuro-glia interaktion.
Undersøgelse af cellulære energimetabolisme og ATP niveauer i neuroner og astrocytter til at belyse Neuro-glia metaboliske interaktioner har længe været hæmmet af manglen på egnede sonder til påvisning af ændringer i metabolit koncentrationer i levende celler i hjernevæv. Det sidste årti har imidlertid givet en kraftig stigning i udviklingen af nye værktøjer og nye genetisk kodede fluorescerende sonder for forskellige metabolitter, herunder sensorer til ATP, lactat, pyruvat og andre11,12. Ved hjælp af disse værktøjer, er det nu muligt at direkte behandle spørgsmål relateret til cellulære ATP forbrug og ændringer i cellulære energi niveauer på enkelt celleniveau og i en celle-type specifik måde i intakt hjernevæv13.
I det nuværende arbejde, beskriver vi en procedure for at visualisere cytosolisk ATP dynamik på neuroner og astrocytter af dyrkede organotypiske hjernen skiver. Vi viser, hvordan man ansætter adeno-associerede virale vektorer (AAV) for celle-type specifikt udtryk for den genetisk kodede ATP-Nanosensor ATeam 1.03Yemk (14) i neuroner og astrocytter af skiver af muse hjernen, der kan opretholdes i cellekultur i flere uger15. En procedure for, hvordan man fjerner det gliale ar, der dækker dyrkede vævs skiver, er beskrevet, hvilket forbedrer optisk tilgængelighed og billeddannelse af celler i de organotypiske vævs lag nedenunder. Endelig viser vi, hvordan ATeam 1.03Yemk kan bruges til at udføre fret-baseret billeddannelse af ændringer i cellulære ATP-niveauer i denne forberedelse. Denne metode er vært for de store fordele, at det ikke kræver kirurgiske hjerne procedurer, giver høje niveauer af ekspression af sensoren og celletype specificitet i dyrkede hjerne skiver, reducere invasivitet eller stress i cellerne sammenlignet med andre metoder, ligesom transfektering ved elektro poration eller transduktion med andre virale vektorer10,16,17. Desuden kan denne protokol anvendes på andre FRET-baserede nanosensorer, blandt dem varianter af ATeam 1.03, der giver lavere bindingsaffinitet for ATP14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxyglucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L07338</td>
			<td>Non-metabolizable glucose analog</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-IMA-410-019 Argon laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>488 nm wavelength argon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3525.1</td>
			<td>Antioxidant, Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 483/32</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 542/27</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 455 LP</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 505 LPXR</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scannig microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit)</td>
			<td>OriginLab corporation</td>
			<td></td>
			<td>Scientific graphing and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Caelo</td>
			<td>2580-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td>Perfusion chamber for live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394</td>
			<td>With Phenol Red for pH monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator HERAcell &#174; 150 with decontamination routine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAsafe KS/KSP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>26050088</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td>SVI Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.52i</td>
			<td>Wayne Rasban national Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software available in the public domain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP serie peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>High-precisionmulti-channel pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout software, Illustrator CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 16</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software for basic data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture insert</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7278</td>
			<td>Synthetic cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator Polychrome V</td>
			<td>Thermo Scientific/FEI</td>
			<td></td>
			<td>Ultra fast switching monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3 (Sodium Azide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &#8734;/0 WD 2.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Water Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements 4.50 advanced Research</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software. Upgraded version for FRET imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Pro Liquid GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS 6 Version 13.0</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v244</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v307</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WVIEW GEMINI optic system</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Emission Image Splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk

Neuronal aktivitet i centralnervesystemet (CNS) fremkalder en stor efterspørgsel på cellulære energi, der leveres af nedbrydningen af adenosin trifosfat (ATP). En stor del af ATP er nødvendig for at re-installere ion gradienter på tværs af plasma membraner forringet af elektrisk signalering af neuroner. Der er tegn på, at astrocytter-selv om det ikke genererer hurtige elektriske signaler selv-undergår øget produktion af ATP som reaktion på neuronal aktivitet og støtte aktive neuroner ved at give energi metabolitter til dem. Den seneste udvikling af genetisk kodede sensorer til forskellige metabolitter gør det nu muligt at studere sådanne metaboliske interaktioner mellem neuroner og astrocytter. Her beskriver vi en protokol for celletype specifikt udtryk for ATP-følsom fluorescens resonans energioverførsel-(FRET-) sensor ATeam 1,03Yemk i organotypic vævs skive kulturer af musen hippocampus og cortex ved hjælp af adeno-associerede virale vektorer (AAV). Desuden viser vi, hvordan denne sensor kan anvendes til dynamisk måling af ændringer i cellulære ATP-niveauer i neuroner og astrocytter efter stigninger i ekstracellulært kalium og efter induktion af kemisk iskæmi (dvs. en hæmning af cellulære energimetabolisme).

AAV vektorer er et pålideligt værktøj til selektivt at udtrykke udenlandske gener i celler i levende væv16. Direkte anvendelse af AAVs, der indeholder sekvens kassetten af ATeam 1,03Yemk , og en specifik promotor resulterer i et højt ekspression af sensoren i den valgte celletype. På DIV 14 (~ 10 dage efter en transduktion), neuroner udtrykker ATeam under den menneskelige synapsin promotor findes ved høj densitet i neocortex af dyrkede væv skiver i dybder på op til 50 μm under udsnitsfladen (figur 5a). Sammenlignelige resultater kan opnås i hippocampus (figur 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg"> Figur 5: visualisering af neuroner udtrykker ATeam 1,03Yemk i kulturperler parasagittal organotypiske hjerne skiver. Billeder til venstre svarer til udvidede fokus projektioner af 43 optiske sektioner (1,05 μm hver) af kortikale væv (A) og (B) af 70 optiske sektioner (0,6 μm hver) af hippocampus væv. Billeder til højre repræsenterer volumen visningen af den samme projektion. Celler er farvekodede i henhold til deres dybde i forhold til udsnitsoverfladen som angivet af farve skalaen til højre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Til måling af ATP-niveauer i astrocytter udtrykkes ateam 1,03yemk under kontrol af den humane gliale fibrillary sure protein (GFAP)-promotor. Dette resulterer i effektiv transduktion af celler i både neocortex og hippocampus af dyrkede vævs skiver (figur 6). Især kan der skelnes mellem to forskellige morfologiske fænotyper, afhængigt af dybden i forhold til overfladen af skive præparater. I den første, overfladiske lag, celler er karakteriseret ved tykke primære processer, der er overvejende arrangeret parallelt med overfladen. Disse celler udviser stærkt overlappende domæner, hvilket skaber et tæt meshwork af tilsyneladende reaktive astrocytter (figur 6). I dybere lag (30-60 μm fra overfladen), transducerede astrocytter udviser fine cellulære processer, der udgør stort set sfæriske domæner og deres morfologi ligner astrocytter in situ som rapporteret tidligere19,20,21 (figur 6). For at opnå bedre transduktion af astrocytter i dybere lag samt bedre optisk adgang til disse dybere lag kan gliaceller arvæv fjernes som beskrevet i trin 4.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg"> Figur 6: visualisering af astrocytter udtrykker ATeam 1,03yemk i kulturperler parasagittal organotypiske hjernen skiver. Billedet til venstre svarer til en udvidet fokus projektion af 191 optiske sektioner (0,45 μm hver). Til illustration formål blev gliaceller ar udelukket fra projektion af astrocytter. Billeder til højre repræsenterer volumen visningen af den samme projektion før og efter fjernelse af gliaceller ar. Cellerne er farvekodede i henhold til deres dybde i forhold til udsnitsoverfladen som angivet af farveskalaerne til højre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Vellykket udtryk for ATeam 1.03Yemk giver mulighed for dynamisk måling af ændringer i ATP niveauer i neuroner eller astrocytter, afhængigt af arrangøren anvendes (se ovenfor). Eksperimenter blev udført i et eksperimentelt bad, der konstant perfektanes med E-ACSF (bukkede med 95% O2/5% Co2). I organotypiske skiver, der udtrykker ATeam 1,03Yemk i hippocampus neuroner, blev regioner af interesse (Rois) valgt før optagelsen, der repræsenterer somata af pyramidale celler (figur 7A). Desuden blev der valgt en region for baggrunds subtraktion (figur 7a). Emission af Venus og eCFP fluorescens blev derefter indsamlet for hver af disse ROIs separat og afbildet som fluorescens emissionsniveau over tid (figur 7B). Efter optagelse af fluorescens under kontrolforhold i flere minutter for at sikre en stabil baselineblev cellulær metabolisme hæmmet ved at udsætte udsnitspræparatet for et glucosefri saltvand, hvortil der blev tilsat 5 mM natrium-Azid (NaN3) i et minut (figur 7B). Denne manipulation inducerede modsatte ændringer i den emissionsintensitet af FRET pair (figur 7B, venstre paneler), med et fald på Venus (527 nm) og en stigning i ecfp (475 nm) emission. Beregning af FRET ratio ved at dividere den fluorescens emission af Venus med eCFP (FVenus/fecfp) resulterede i signaler, der afspejler de relative ændringer i de intracellulære ATP-niveauer, den såkaldte "ateam fret ratio" (figur 7B, højre panel). I alle indspillede neuroner (n = 70 celler i N = 5 skiver) forårsagede NaN3 et reversibelt fald i ATEAM fret ratio, hvilket indikerer et reversibelt fald i intracellulære ATP-niveauer ved hæmning af cellulær metabolisme.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg"> Figur 7: demonstration af tidsforskudt ATeam fret ratio Imaging. A) øverst til venstre: fluorescens i bred felts billede af det pyramideformede lag og stratum radiatum i området med en kultiveret organotypisk hippocampus-skive, der udtrykker ateam 1,03yemk i neuroner. Øverst til højre: forstørret visning af boxed sektion som angivet til venstre. Hvide linjer afgrænse regioner af interesse (Rois) 1-3 repræsenterer celle kroppe af Carnot pyramide neuroner valgt til analyse i (B). BG repræsenterer det ROI, som er valgt til baggrundskorrektion. Bund: pseudo-farvede billeder, der repræsenterer fluorescens emission af Venus (grøn), eCFP (lilla) og forholdet mellem Venus og eCFP. B) tidsforskudt optagelse i rois 1-3, der repræsenterer neuronale celle organer (Se A). Spor til venstre viser normaliseret fluorescens emission af Venus (grøn) og eCFP (magenta). Traces til højre viser det tilsvarende ATeam FRET-forhold. Bemærk, at perfusion med 5 mM NaN3 i fravær af ekstracellulært glucose i 1 minut (grå bjælke) inducerer et reversibelt fald i ATEAM fret ratio, hvilket indikerer et fald i INTRACELLULÆR ATP-koncentration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
For at sikre stabiliteten af præparatet og sensoren under langvarige eksperiment forhold, blev skiver, der udtrykker ATeam i neuroner eller astrocytter, konstant perfektioneres med ACSF i længere perioder (> 50 min; n = 12 celler hver, N = 3 OTC'er fra 3 hjerner). Under disse omstændigheder ændrede ATeam FRET-forholdet sig ikke (figur 8). At udsætte forberedelserne til CIS, der indeholder metaboliske hæmmere ("kemisk iskæmi", se tabel 1), resulterede derimod igen i det forventede fald i ATEAM fret-forholdet som observeret ovenfor.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg"> Figur 8: grundlæggende eksperimenter med ATeam. Langsigtet ATeam FRET ratio Imaging i 14 forskellige celler under baseline forhold i neuroner (top) og astrocytter (nederst). Data blev taget på sammenlignelige betingelser som andre eksperimentelle data. Ved afslutningen af hver måling blev kemisk iskæmi fremkaldt ved perfusion med CIS som angivet af pilen. Bemærk: baseline ATeam FRET ratio er stabile over tid under baseline forhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Dernæst analyserede vi svarene fra neuroner og astrocytter, som udtrykker ATeam 1,03Yemk til en stigning i den ekstracellulære kaliumkoncentration. Efter etableringen af en stabil baselineblev neuroner perfektaret med et saltvand, hvor kaliumkoncentrationen blev forøget fra 3 til 8 mM i 3 minutter (figur 9a). Denne manipulation resulterede dog ikke i en detekterbar ændring i ATeam FRET ratio (n = 56 celler i N = 5 skiver). For at sikre, at sensoren reagerede på en ændring i ATP-niveauerne, blev skiver igen udsat for en vedvarende periode med kemisk iskæmi fremkaldt ved at erstatte E-ACSF med CIS. Kemisk iskæmi resulterede i et hurtigt fald i ATeam FRET ratio til et nyt, stabilt niveau, hvilket indikerer nominel nedbrydning af ATP efter 2-3 min (figur 9a).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg"> Figur 9: repræsentative eksperimenter illustrerer ændringer i ATP niveauer i neuroner og astrocytter. (A,B): billeder til venstre viser ateam fluorescens fra neuroner og astrocytter placeret i hippocampus-området af organotypiske skiver. Traces til højre repræsenterer tidsforskudt optagelser af ATeam FRET ratio opnået fra et ROI placeret over en enkelt celle krop. I begge forsøg blev skiver først udsat for en stigning i den ekstracellulære kaliumkoncentration i 3 minutter (Se bar), efterfulgt af en endelig eksponering for kemisk iskæmi. Bemærk, at mens neuroner ikke reagerer på højden af ekstracellulære kalium (A), astrocytter reagerer med en stigning i ATP (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Den samme eksperimentelle protokol blev udført med skiver, hvor ATeam 1,03Yemk blev udtrykt i astrocytter. I modsætning til hvad der blev observeret i neuroner, reagerede astrocytter på stigningen i ekstracellulært kalium ved en reversibel stigning i ATeam FRET ratio, hvilket indikerer en stigning i intracellulære ATP-niveauer (n = 70 celler i N = 5 skiver) (figur 9B). Efterfølgende eksponering for kemisk iskæmi resulterede, som forventet, i et stort fald i ATeam FRET ratio, hvilket indikerer nominel nedbrydning af intracellulær ATP (figur 9B).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Vi beskriver en protokol for celle-typespecifikke udtryk for den genetisk kodede FRET-baseret sensor ATeam 1.03Yemk i organotypiske skive kulturer af musen forhjernen. Desuden viser vi hvordan man bruger denne sensor til dynamisk billeddannelse af cellulære ATP-niveauer i neuroner og astrocytter.

Imaging af intracellulære ATP i Organotypic væv skiver af muse hjernen ved hjælp af FRET-baseret sensor ATeam 1,03Yemk

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Her demonstrerer vi, hvordan man anvender DEN ATP-følsomme FRET-sensor ATeam 1.03 YEMK til dynamiske målinger af ændringer i neuronale og astrocytiske ATP-niveauer i organoypisk dyrkede musehestecampale skiver. Den største fordel ved denne teknik er, at man kan studere energimetabolisme i levende hjernevæv i en kontrolleret indstilling, et miljø med høje sensorudtryksniveauer. Denne teknik kan hjælpe med at få indsigt i pathomechanisms, underliggende sygdomme, eller hjerneskade, for eksempel forårsaget af energi afsavn, ligesom iskæmisk slagtilfælde.Det kan i princippet bruges til at studere ATP niveauer, ikke kun i hjernevæv, men i andre organer samt. For at kunne køre dette eksperiment, er det vigtigt at udføre alle trin, der er involveret i dyrkning af væv yderst forsigtig og at opretholde sterilitet. Desuden er en vis viden om cellulære fluorescerende billeddannelse er påkrævet.Væv håndtering i mest sofistikerede tilgang og en visualisering er afgørende for at forstå de korrekte procedurer. Det samme gælder for billedforsøg. Demonstration af proceduren vil være Rodrigo Lerchundi, en postdoc, og Na Huang, en Master studerende fra laboratoriet.I en iskold petriskål fyldt med ACSF skal hjernen placeres på en filtermembran. Adskære halvkugler og udføre en parasagittal snit i en vinkel på 45 grader. Fix en halvkugle på Vibratome væv fase med superlim, og straks overføre væv blok til Vibratome badet indeholder iskold ACSF boblede med 5% kuldioxid og 95% ilt.Juster vævet i Vibratome badet. Hold den anden halvkugle i iskold ACSF, indtil udskæringen. Juster Vibratome til at skære skiver ved 250 til 400 mikrometer.Efter at skære skiven, identificere hippocampal dannelse baseret på dens typiske morfologiske udseende og isolere det ved hjælp af hypodermiske nåle, holde den del af hjernebarken støder op til hippocampus. Placer skiven på en maske i ACSF, opvarmet til 34 grader Celsius og boblede med 5% kuldioxid og 95% ilt, indtil alle skiver er indsamlet. Overfør skiverne til laminar-strømskabet for at fortsætte under sterile forhold.Med en omvendt, steril, glas Pasteur pipette, forsigtigt overføre skiver fra ACSF i en af de forvarte petriskåle fyldt med sterile Hanks'salt opløsning. Skift pipetten og overfør skiverne til den anden kulturskål. Gentag processen samlet set fem gange.Overfør så lidt HBSS som muligt til følgende kulturplader. Brug en pipette til forsigtigt at placere en skive ad gangen på toppen af kulturindsatsen. Undgå turbulens i pipetten, og vent, indtil skiven ned til spidsen af Pasteur pipetten.Gentag processen for hvert udsnit. Placer to skiver på en membran. Fjern forsigtigt overskydende Hank-opløsning fra toppen af indsatsen ved hjælp af en fin spids.Hold kulturerne i en befugtet inkubator ved 5% kuldioxid og 37 grader Celsius indtil dagen for forsøget. Udskift mediet hver anden til tredje dag. Uden at røre ved vævet påføres 0,5 mikroliter af den fortyndede vektor direkte til toppen af hver skive.Endelig placere skiver tilbage i rugemaskinen og vedligeholde dem der i mindst seks dage mere. Lige før du starter et eksperiment, overføre en indsats, der indeholder dyrkede skiver i den sterile hætte, og placere den i en 30 millimeter skål, der indeholder en milliliter organotypic skive kultur medium, eller minimal væsentlige medium. Placer skålen under stereoscope og fokuser på overfladen af skiven.Brug to sterile hypodermiske nåle til at lave en kort tværskåret højre på de smalle kanter af en valgt skive, og i det øverste lag uden at beskadige vævet nedenunder. For at fjerne den forberedte skive fra indsatsen, hold kanterne af membranen med pincet og bruge en steril skalpel til at gøre lige, parallelle nedskæringer til membranen, danner en firkant eller en trekant med skiven i midten. Hvis indsatsen er vært for yderligere udsnit, skal du overføre det tilbage til den oprindelige plade og ind i inkubatoren.Overfladen spænding af mediet vil forhindre dens lækage på overfladen af membranen. Forbered eksperimentelLE ACSF og få en pH-pH-pH ved at boble det med 95% ilt og 5% kuldioxid gennem en indsat slange forbundet til carbogen levering i mindst tredive minutter. Hold saltvandet boblet under hele eksperimentet.Tænd derefter for monokrometers lysstofkilde. Overfør organotypiske skivekulturen til forsøgskammeret. Placer et gitter oven på organotypic skive kultur med rammen ned, ikke rører kulturen, og trådene op, rører membranen.Placer kammeret på mikroskopet fase og forbinde den til perfusion system. Tænd for peristaltisk pumpe med en strømningshastighed på 1,5 til 2,5 milliliter i minuttet. Sørg for, at der ikke lækker perfusionssystemet.Ved hjælp af transmissionslys skal den kultiverede skive bringes i fokus, og det område, hvor der skal udføres forsøg. Før du starter billedforsøg, skal du vente mindst 15 minutter på at tillade skiver at tilpasse sig saltvandsforholdene og derefter tænde for kameraet og billedbehandlingssoftwaren. Lynde donorfluorescerende protein ved 435 nanometer.Indstil eksponeringstiden til mellem 40 og 90 millisekunder. Sæt derefter det dichroiske spejl og filtrene ind i strålesplitterenheden. Fluorescensemissionen opdeles ved 500 nanometer med en emissionsbilledessplitter, og der anvendes båndpasfiltre ved 482 plus eller minus 16 og 542 plus eller minus 13,5 nanometer for yderligere at isolere donor- og acceptorinorescens.Vælg en region af interesse tilsyneladende blottet for cellulære fluorescens for baggrunden subtraktion. Cirkel enkelte strukturer af mærket væv i billedet på skærmen for at skabe ROI'er. Angiv hyppigheden af billedopkøb og den samlede registreringstid.For forsøg på mere end 30 minutter anbefales en anskaffelsesfrekvens på 0,2 til 0,5 Hertz for at forhindre fototoksicitet. Start derefter optagelsen. For at fremkalde ændringer i intracellulær ATP skifte perfusionsrøret fra standard ACSF til en saltvand, der indeholder metaboliske hæmmere, for eksempel kemisk iskæmiopløsning.Alternativt, bruge en saltvand med forhøjet kalium koncentration på otte millimolar at efterligne frigivelse af kaliumion fra aktive neuroner. Direkte efter optagelserne skal du udskifte den eksperimentelle ACSF med dynger-buffered ACSF. Overfør derefter optagelseskammeret, der indeholder skivekulturen, til det konfokale laserscanningsmikroskop.Tag Z stack billeder på den højest mulige Z-opløsning ved den givne optiske konfiguration. I denne protokol, ti dage efter en transduktion, neuroner udtrykker ATeam 1.03 YEMK blev fundet ved høj tæthed i neocortex af dyrkede væv skiver på dybder på op til 50 mikrometer under skiven overflade. Der blev opnået sammenlignelige resultater i hippocampus.For astrocytter blev ATeam 1,03 YEMK udtrykt under kontrol af den humane glial fibrolary sure protein promotor, og organotypic skiver udtrykker ATeam 1,03 YEMK i hippocampal neuroner udvalgte RO'er repræsenterer somata af pyramideceller. Efter at have udsat skiven for 5 millimolarnatriumazid uden ekstracellulær glukose i et minut blev der induceret modsatte ændringer i FRET-parrets emissionsintensitet. Der blev også observeret et reversibelt fald i ATeam FRET-forholdet.Langsigtet ATeam FRET-forhold i 14 forskellige celler under baseline forhold i neuroner og astrocytter viser, at ATeam er en pålidelig og stabil sensor. Bemærk, at kemikaliet iskæmi resulterede i det forventede kraftige fald i ATeam-forholdet i begge celletyper ved afslutningen af dette eksperiment. En stigning i den ekstracellulære kaliumkoncentration fra tre til otte millimolar i tre minutter resulterede ikke i en påviselig ændring i neuronerne, der udtrykte ATeam 1,03 YEMK.I modsætning hertil reagerede astrocytter på stigningen i ekstracellulær kalium ved en reversibel stigning i ATeam FRET-forholdet, hvilket indikerer en stigning i intracellulære ATP-niveauer. Igen forårsagede kemisk iskæmi et øjeblikkeligt fald i ATeam-forholdet, hvilket viste, at sensoren kan registrere ændringer i ATP. Når du forsøger FRET-baserede cellulære billedbehandling som beskrevet her, er det vigtigt at huske på, at produktionen af skiver af høj kvalitet i organotypiske kulturer er et vigtigt skridt.Desuden er omhyggelig fjernelse af glia ar og ekspert-niveau billeddannelse er påkrævet. Efter denne procedure, man bør også være i stand til at udføre eksperiment indarbejde forskellige andre FRET-baserede nanosensor for cellulære metabolitter. For eksempel, dem for glukose eller laktat.Sidst, men ikke mindst, skal det understreges, at relevante handlinger til beskyttelse af dyr altid skal overholdes. Dette gælder også for de effektive love om håndtering af genetisk modificerede organismer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse Imaging af neuroblast Migration i Akutte Skiver af den voksne Mouse forhjerne

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Forbundne Helcelle optagelser i Organotypiske hippocampusskiver

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselektiv Biolistic Målretning i organotypisk Brain Skiver anvendelse af en modificeret genpistol

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fibers i Mouse Spinal Cord Brug af CLARITY / CUBIC Teknik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Dybdegående Fysiologisk Analyse af Definerede Cell populationer i Akut Tissue Skiver af Mouse vomeronasale organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse konfokal billeddannelse af migrerende neuroner i organotypisk skive kultur af embryonale mus hjernen ved hjælp af<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Optagelse synaptisk plasticitet i akut hippocampus skiver vedligeholdes i en lille-volumen genanvendelse - Perfusion- og neddykning-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering og Live Imaging af Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjerne skiver ved hjælp af Adeno-associeret Virus og konfokal mikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

To-foton billeddannelse af Microglial processer tiltrækning mod ATP eller Serotonin i akut hjernen skiver

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Mærkning og billeddannelse af amyloid plaques i hjernevæv ved hjælp af den naturlige polyphenol curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...