Name: imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

De auteurs willen Claudia Roderigo en Simone Durry bedanken voor hun deskundige technische assistentie. We danken Dr. Niklas J. Gerkau en M.Sc. Joel Nelson voor hulp bij de voorbereiding van de organotypische segment culturen. Het onderzoek in het laboratorium van de auteur werd gefinancierd door de Duitse Onderzoeksvereniging (DFG; VOOR 2795: ro 2327/13-1 en SPP 1757: ro 2327/8-2 naar CRR; en SPP 1757: jonge glia start-up financiering voor RL).

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen. De auteurs ontvingen financiële steun om Open Access te publiceren door Nikon Microscoop Solutions, Düsseldorf, Duitsland, die instrumenten produceert die gebruikt worden in het video artikel. Het bedrijf was niet betrokken bij het ontwerpen van de hier gepresenteerde experimenten, noch in de uitvoering ervan, noch in de verwerking van gegevens, noch in het schrijven van het manuscript.

Hier tonen we een procedure voor de Cell-Type specifieke uitdrukking van ATeam 1.03Yemk, een op fret gebaseerde, genetisch gecodeerde nano sensor14, voor het meten van veranderingen in de ATP-niveaus in astrocyten of neuronen in organotypische weefselsegment culturen van de muis hersenen15. In voorbeeldige opnames tonen we aan dat een toename van de extracellulaire kaliumconcentratie niet resulteert in een verandering in de ATP concentraties in neuronen, terwijl astrocytische ATP niveaus stijgen in reactie op deze manipulatie. Bovendien, onze resultaten tonen aan dat bij remming van cellulaire metabolisme, ATeam 1.03Yemk fret ratio snel daalt in beide celtypen, wat duidt op een snelle afname van de INTRACELLULAIRE ATP.
Uitdrukking van ATeam 1.03Yemk in organotypische segment culturen vereist onderhoud van het weefsel in cultuur onder gecontroleerde omstandigheden gedurende ten minste 7-10 dagen. Als alternatief kan ateam 1.03yemk ook worden gebruikt voor het meten van ATP in acuut geïsoleerde hersenweefsel plakjes en in optische zenuwen van muizen13,15. Metingen in acuut geïsoleerd weefsel vereisen echter de aanmaak van transgene dieren of een stereotactische toepassing van virale vectoren in de hersenen, waarbij dierproeven en strikte dierenzorg protocollen worden betrokken. In dit opzicht vertegenwoordigt ateam 1.03yemk expressie in organotypische weefselsegment culturen een nuttig en waardevol alternatief22,23. Voor vele jaren, organotypic weefsel segment culturen dienen als een gevestigde modelsysteem om neurale eigenschappen te bestuderen, connectiviteit en ontwikkeling24,25,26. Ze onderhouden niet alleen de algemene weefsel architectuur en laminatie (Figuur 1), maar hosten ook de preferentiële eigenschappen van celculturen zoals superieure toegankelijkheid en directe controle van experimentele omstandigheden. Organotypische weefselsegment culturen worden ook routinematig gebruikt om vreemde genen uit te drukken met behulp van virale vectoren27. Er zijn verschillende soorten virale vectoren gemeld om transgenen te leveren in hersenweefsel16,28. Adenovirale vectoren induceren hoge expressie in gliacellen, maar niet hippocampal neuronen16, en zou kunnen genereren gliacellen reactiviteit17. Adeno-geassocieerde virale vectoren zoals hier gebruikt ontstaan als een goed alternatief15, en hun effectiviteit is ook aangetoond in vivo29.
Terwijl voornamelijk wordt gebruikt voor de studie van neuronale eigenschappen, recente studies hebben vastgesteld dat organotypic weefsel segment culturen kunnen ook worden toegepast voor de analyse van astrocyten. Gekweekte plakjes worden meestal bedekt met een laag reactieve astrocyten19,30 (Figuur 5), maar astrocyten vertonen een meer inheemse, niet-reactieve morfologie en cytoarchitectuur in diepere lagen19,30 (Figuur 5). In de huidige studie beschrijven we een procedure voor het mechanisch verwijderen van het buitenste gliale litteken, wat resulteert in een betere experimentele en optische toegankelijkheid van inheemse astrocyten binnen de juiste organotypische weefsellagen. Bovendien, de verwijdering ervan verbetert de expressie werkzaamheid in diepere lagen van de organotypische plakjes; Als het gliale litteken niet wordt verwijderd, kan de transductie door AAVs de neiging hebben om beperkt te zijn tot de oppervlakkige cellagen.
Verschillende externe mechanische factoren moeten worden overwogen bij het uitvoeren van experimenten in weefsel segmenten. Een variatie in Bath perfusie Velocity kan bewegingen van het hele preparaat induceren en/of veranderingen in focus induceren, wat resulteert in kunstmatige voorbijgaande veranderingen van het sensorsignaal. Bovendien zijn zowel astrocyten als neuronen gemeld om te reageren op mechanische vervorming zoals opgelegd door hoge perfusie snelheden32,33. In onze handen, met behulp van een betrouwbare peristaltische pomp, samen met het handhaven van kleine en stabiele volumes van zoutoplossing tussen het weefsel en de doelstelling (meniscus) resulteert in een stabiele FRET-signaal onder Baseline voorwaarden bij de perfusie snelheid gebruikt hier (1.5-2.5 mL/min; Figuur 8).
In de huidige studie tonen we ook aan dat op FRET gebaseerde beeldvorming met ATeam 1.03Yemk kan worden gebruikt om de ATP-niveaus in neuronen en astrocyten te bewaken. Een alternatieve manier eerder geïntroduceerd voor meting van cellulaire ATP is de zogenaamde luciferin-Luciferase assay34,35,36,37. Deze benadering is echter gebaseerd op beeldvorming van bioluminescentie en biedt slechts een tamelijk lage temporale en ruimtelijke resolutie, deels door een hoog achtergrondgeluid. Een andere methode die in de afgelopen jaren routinematig werd gebruikt, was de beeldvorming van veranderingen in de intracellulaire magnesiumconcentratie met behulp van de iongevoelige de magnesium Green38,39,40. Deze benadering heeft betrekking op de constatering dat een consumptie van ATP resulteert in de afgifte van haar co-factor magnesium. Beeldvorming met magnesium groen zorgt daardoor alleen voor een secundaire schatting van de veranderingen in de ATP-niveaus. Bovendien, magnesium groen is ook gevoelig voor veranderingen in intracellulaire calcium, het introduceren van een andere moeilijkheid bij het interpreteren van de resultaten verkregen met deze methode.
De recente ontwikkeling van genetisch gecodeerde nano sensoren voor directe beeldvorming van cellulaire metabolieten betekende daarom een grote stap voorwaarts11,12. Verschillende sensoren werden gegenereerd die kunnen worden gebruikt voor de meting van intracellulaire ATP36,41,42,43. Onder deze zijn de ratiometrische fluorescerende ATP indicator "Koningin"41 evenals PercevalHR, die DETECTEERT de ATP: ADP ratio42. Terwijl de laatste sonde een waardevol instrument is voor de studie van de energiestatus van cellen, vereist het gelijktijdige meting van veranderingen in pH42.
ATeam is een nano-sensor waarvan verschillende varianten bestaan, die – onder andere – verschillen in hun bindingsaffiniteit voor ATP14. In vitro, ATeam 1.03Yemk vertoont een Kd van 1,2 mm bij 37 ° c, die dicht bij cellulaire ATP niveaus bepaald in verschillende neuronale celtypen, variërend van de hypothalamus en cerebellum34 tot hippocampus37,44,45. Bij kuvette metingen resulteerde de verlaging van de temperatuur met 10 °C in een significante afname van de bindingsaffiniteit van ATeam 1.03Yemk naar ATP, wat suggereert dat het mogelijk niet ideaal is voor cellulaire beeldvorming bij kamertemperatuur14. Onze eerdere studie15, echter, toonde aan dat het gedrag en de reactie van ateam 1.03yemk uitgedrukt in neuronen en astrocyten aan verschillende manipulaties is vergelijkbaar in de buurt van fysiologische en op kamertemperatuur, wat aangeeft dat de sensor kan betrouwbare bepaling van intracellulaire ATP niveaus onder beide omstandigheden. Daarnaast hebben onze vorige experimenten de pH-gevoeligheid van ATeam 1.03Yemk , uitgedrukt in cellen15, behandeld, waaruit blijkt dat het ongevoelig is voor veranderingen in intracellulaire pH met ongeveer 0,1-0,2 pH-eenheden. Als de Kd in de lage mm bereik is een probleem, alternatieve ateam varianten kunnen worden gebruikt14, onder hen rood verplaatste varianten van ATEAM ("go-ateam")43.
Onze experimenten met ATeam 1.03yemk tonen aan dat een toename van de extracellulaire kaliumconcentratie met slechts enkele mm (van 3 tot 8 mm) resulteert in een voorbijgaande toename van de Ateam 1.03yemk ratio in astrocyten in de organotypische segment cultuur. Deze observatie bevestigt eerdere studies15,46 en geeft duidelijk aan dat astrocyten reageren op het vrijkomen van kalium door actieve neuronen met een toename van hun ATP-productie, meestal waarschijnlijk als gevolg van een stimulatie van de na+/k+-ATPase en de na+/HCO3- cotransporter, respectievelijk47,48. In tegenstelling tot deze, neuronen niet tonen een reactie, die in lijn is met eerdere werk ook15. Beide celtypen, echter, snel en sterk gereageerd op remming van cellulaire glycolyse en mitochondriale ademhaling zoals aangegeven vóór15. Onder de voorwaarden van chemische ischemie, ATeam FRET ratio's daalde naar een nieuw stabiel niveau, wat duidt op een nominale uitputting van cellulaire ATP. Het laatste resultaat suggereert dat zowel neuronen als astrocyten vertonen een relevante consumptie van ATP ook onder steady-state omstandigheden zonder extra stimulatie door synaptische activering of toepassing van neurotransmitters. Samen, concluderen we dat FRET-based Imaging met genetisch gecodeerde nano sensoren, onder hen ATeam 1.03Yemk, een waardevolle benadering zal bieden om de cellulaire processen te verhelderend die verantwoordelijk zijn voor veranderingen in INTRACELLULAIRE ATP-niveaus en cellulaire ATP-verbruik onder verschillende omstandigheden.

Excitatory elektrische activiteit van neuronen is grotendeels gebaseerd op de flux van kationen zoals natrium (na+) en kalium (K+) over hun plasma membranen. Het onderhoud van de elektrochemische gradiënten van deze twee ionen is dus vereist voor signalering. Dit wordt bereikt door de cellulaire na+/k+-ATPASE (NKA), een alomtegenwoordige elektrogene transmembraan pomp, die 3 na+ uit de cel uitextrudeert in ruil voor 2 K+ uit de extracellulaire ruimte, waarbij het verbruik van één molecuul ATP per transport cyclus1vereist is. Naast de NKA, er zijn verschillende andere ATP-consumeren Ion transporters met inbegrip van het plasma membraan CA2 +-ATPase, die is van vitaal belang voor intracellulaire CA2 + homeostase en de uitvoer volgende activiteit-geïnduceerde toestroom2. In presynaptische blaasjes creëert een vacuolar-type H+-ATPase (v-ATPase) de Proton gradiënt die nodig is voor de opname van de neurotransmitter in dit compartiment3.
Terwijl de activiteit van neuronen dus vereist een aanzienlijke hoeveelheid ATP4, ze vertonen geen significante capaciteit voor de opslag van energie. In plaats daarvan lijken ze te vertrouwen op metabole interacties met naburige astrocyten, de belangrijkste glycogeen winkels in de hersenen5. Er is gesuggereerd dat astrocytische glycogeen inderdaad een belangrijke rol speelt bij de ondersteuning van neuronale energiebehoeften; en een belangrijk fenomeen in deze voorgestelde neuro-metabole koppeling tussen de twee celtypen is de capaciteit van astrocyten om hun ATP-productie te verhogen in reactie op Neuronale activiteit6,7,8. Deze hypothese, bekend als de astrocyten-neuron lactaat shuttle (anls), wordt nog steeds in debat gebracht, omdat ander werk bewijs heeft geleverd dat neuronen ook hun eigen tarief van glycolyse kunnen verhogen in reactie op stimulatie9,10, wat de noodzaak van verdere methoden en benaderingen voor het bestuderen van de neuro-glia-interactie weerspiegelt.
Onderzoek van cellulaire energiemetabolisme en ATP niveaus in neuronen en astrocyten tot opheldering neuro-glia metabole interacties is al lang belemmerd door het ontbreken van geschikte sondes voor de opsporing van veranderingen in de metaboliet concentraties in levende cellen in hersenweefsel. Het laatste decennium, echter, heeft een toename van de ontwikkeling van nieuwe instrumenten en nieuwe genetisch gecodeerde fluorescentie sondes voor verschillende metabolieten, met inbegrip van sensoren voor ATP, lactaat, pyruvaat en anderen11,12. Met behulp van deze hulpmiddelen, het is nu mogelijk om direct adres vragen met betrekking tot cellulaire ATP consumptie en veranderingen in cellulaire energie niveaus op het niveau van de enkele cel en in een cel-type specifieke manier in intact hersenweefsel13.
In het huidige werk beschrijven we een procedure om de cytosolische ATP-dynamiek op neuronen en astrocyten van gekweekte organotypische hersen segmenten te visualiseren. We laten zien hoe te gebruiken adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV) voor cel-type specifieke uitdrukking van de genetisch gecodeerde ATP-nano sensor ATeam 1.03Yemk (14) in neuronen en astrocyten van plakjes muis hersenen die kunnen worden gehandhaafd in celcultuur voor enkele weken15. Een procedure voor het verwijderen van het gliacellen litteken dat de gekweekte weefsel plakjes bedekt, wordt beschreven, die de optische toegankelijkheid en beeldvorming van cellen in de organotypic weefsellagen eronder verbetert. Tot slot laten we zien hoe ATeam 1.03Yemk kan worden gebruikt om op fret gebaseerde beeldvorming van veranderingen in cellulaire ATP-niveaus in deze voorbereiding uit te voeren. Deze methode herbergt de grote voordelen die het vereist geen chirurgische hersen procedures, biedt hoge niveaus van expressie van de sensor en celtype specificiteit in gekweekte hersen plakjes, het verminderen van invasiviteit of stress in de cellen in vergelijking met andere methoden, zoals transfectie door elektroporation of transductie met andere virale vectoren10,16,17. Daarnaast kan dit protocol worden toegepast op andere op FRET gebaseerde nano sensoren, waaronder varianten van ATeam 1.03 die een lagere bindingsaffiniteit bieden voor ATP14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxyglucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L07338</td>
			<td>Non-metabolizable glucose analog</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-IMA-410-019 Argon laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>488 nm wavelength argon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3525.1</td>
			<td>Antioxidant, Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 483/32</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 542/27</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 455 LP</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 505 LPXR</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scannig microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit)</td>
			<td>OriginLab corporation</td>
			<td></td>
			<td>Scientific graphing and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Caelo</td>
			<td>2580-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td>Perfusion chamber for live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394</td>
			<td>With Phenol Red for pH monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator HERAcell &#174; 150 with decontamination routine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAsafe KS/KSP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>26050088</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td>SVI Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.52i</td>
			<td>Wayne Rasban national Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software available in the public domain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP serie peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>High-precisionmulti-channel pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout software, Illustrator CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 16</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software for basic data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture insert</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7278</td>
			<td>Synthetic cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator Polychrome V</td>
			<td>Thermo Scientific/FEI</td>
			<td></td>
			<td>Ultra fast switching monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3 (Sodium Azide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &#8734;/0 WD 2.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Water Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements 4.50 advanced Research</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software. Upgraded version for FRET imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Pro Liquid GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS 6 Version 13.0</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v244</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v307</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WVIEW GEMINI optic system</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Emission Image Splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk

Neuronale activiteit in het centrale zenuwstelsel (CNS) roept een hoge vraag op cellulaire energie geleverd door de afbraak van adenosinetrifosfaat (ATP). Een groot deel van de ATP is nodig voor het opnieuw installeren van ionen gradiënten over plasma membranen aangetast door elektrische signalering van neuronen. Er is bewijs dat astrocyten-terwijl het niet genereren van snelle elektrische signalen zelf-verhoogde productie van ATP in reactie op Neuronale activiteit ondergaan en ondersteunen van actieve neuronen door het verstrekken van energie metabolieten aan hen. De recente ontwikkeling van genetisch gecodeerde sensoren voor verschillende metabolieten maakt nu de studie van dergelijke metabole interacties tussen neuronen en astrocyten mogelijk. Hier beschrijven we een protocol voor cel-type specifieke uitdrukking van de ATP-gevoelige fluorescentie resonantie energie overdracht-(FRET-) sensor ATeam 1.03Yemk in organotypische weefsel segment culturen van de muis Hippocampus en cortex met behulp van adeno-geassocieerde virale vectoren (Aav). Bovendien, we demonstreren hoe deze sensor kan worden gebruikt voor dynamische meting van veranderingen in cellulaire ATP niveaus in neuronen en astrocyten bij verhogingen van extracellulaire kalium en na inductie van chemische ischemie (dat wil zeggen, een remming van cellulaire energie metabolisme).

AAV-vectoren zijn een betrouwbaar hulpmiddel om vreemde genen in cellen binnen levend weefsel selectief uit te drukken16. Directe toepassing van AAVs met de sequentie cassette van ATeam 1.03Yemk en een specifieke promotor resulteert in een hoge expressie van de sensor in het gekozen celtype. Bij DIV 14 (~ 10 dagen na een transductie) worden neuronen die ATeam uitdrukken onder de humane synapsin promotor gevonden bij hoge dichtheid in de neocortex van gekweekte weefsel plakjes op diepten tot 50 μm onder het segment oppervlak (Figuur 5a). Vergelijkbare resultaten kunnen worden behaald in de Hippocampus (Figuur 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg"> Figuur 5: visualisatie van neuronen die ATeam 1.03Yemk uitdrukken in gekweekte parasagitale organotypische hersen schijfjes. Afbeeldingen links corresponderen met uitgebreide focus projecties van 43 optische secties (1,05 μm elk) van corticale weefsel (A) en (B) van 70 optische secties (0,6 μm per stuk) van hippocampal weefsel. Afbeeldingen aan de rechterkant vertegenwoordigen de volume weergave van dezelfde projectie. Cellen zijn kleurgecodeerd op basis van hun diepte ten opzichte van het segment oppervlak, zoals aangegeven door de kleur schaal aan de rechterkant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Voor de meting van de ATP-niveaus in astrocyten, wordt ATeam 1.03Yemk uitgedrukt onder de controle van de promotor van het humaan gliacellen fibrillair zure eiwit (GFAP). Dit resulteert in een efficiënte transductie van cellen in zowel neocortex en Hippocampus van gekweekte weefsel segmenten (Figuur 6). Met name kunnen twee verschillende morfologische fenotypes worden onderscheiden, afhankelijk van de diepte ten opzichte van het oppervlak van segment preparaten. In de eerste, oppervlakkige laag, cellen worden gekenmerkt door dikke primaire processen die overwegend parallel aan het oppervlak zijn gerangschikt. Deze cellen vertonen sterk overlappende domeinen, waardoor een dicht gevlochten van ogenschijnlijk reactieve astrocyten ontstaat (Figuur 6). In diepere lagen (30-60 μm van het oppervlak) vertonen getransduceerde astrocyten fijne cellulaire processen die grotendeels sferische domeinen vormen en hun morfologie lijkt op die van astrocyten in situ zoals gerapporteerd eerder19,20,21 (Figuur 6). Om een betere transductie van diepere-Layer astrocyten en een betere optische toegang tot deze diepere lagen te verkrijgen, kan het gliacellen littekenweefsel worden verwijderd zoals beschreven in stap 4.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg"> Figuur 6: visualisatie van astrocyten die ATeam 1.03Yemk uitdrukken in gekweekte parasagitale organotypische hersen schijfjes. De afbeelding links correspondeert met een uitgebreide focus projectie van 191 optische secties (0,45 μm per stuk). Ter illustratie werd het gliacellen litteken uitgesloten van de projectie van astrocyten. Afbeeldingen rechts vertegenwoordigen de volume weergave van dezelfde projectie voor en na verwijdering van het gliale litteken. Cellen zijn kleurgecodeerd op basis van hun diepte ten opzichte van het segment oppervlak, zoals aangegeven door de kleurschalen aan de rechterkant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Succesvolle uitdrukking van ATeam 1.03Yemk maakt de dynamische meting van veranderingen in de ATP-niveaus in neuronen of astrocyten mogelijk, afhankelijk van de gebruikte promotor (zie hierboven). Experimenten werden uitgevoerd in een experimenteel Bad voortdurend geperfundeerd met E-acsf (bubbled met 95% O2/5% Co2). In organotypische plakjes uitdrukken ATeam 1.03Yemk in hippocampal neuronen, regio's van belang (Rois) werden geselecteerd voor het starten van de opname, die de somata van piramidale cellen (Figuur 7A). Bovendien werd een regio voor achtergrond aftrekken gekozen (Figuur 7a). De emissie van Venus en eCFP fluorescentie werd vervolgens voor elk van deze ROIs afzonderlijk verzameld en in de loop van de tijd als fluorescentie-emissieniveau afgebeeld (Figuur 7B). Na het opnemen van fluorescentie onder controle omstandigheden gedurende enkele minuten om een stabiele Baseline te waarborgen, werd het cellulaire metabolisme geremd door de voorbereiding van het segment bloot te stellen aan een glucose-vrije zoutoplossing, waaraan 5 mM natrium natriumazide (NaN3) voor één minuut werd toegevoegd (Figuur 7B). Deze manipulatie veroorzaakte tegengestelde veranderingen in de emissie-intensiteit van het FRET paar (Figuur 7B, linker panelen), met een afname van Venus (527 nm) en een toename van de ecfp (475 nm) emissie. Het berekenen van de FRET ratio door het delen van de fluorescentie emissie van Venus door die van eCFP (FVenus/fecfp) resulteerde in signalen die de relatieve veranderingen in de intracellulaire ATP-niveaus weerspiegelen, de zogenaamde "ateam fret ratio" (Figuur 7B, rechter paneel). In alle opgenomen neuronen (n = 70 cellen in N = 5 plakjes) veroorzaakte NaN3 een omkeerbare afname van de ATEAM fret ratio, wat duidt op een omkeerbare afname van INTRACELLULAIRE ATP niveaus bij remming van cellulair metabolisme.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg"> Afbeelding 7: demonstratie van time lapse ATeam fret ratio Imaging. (A) linksboven: breed-veld fluorescentie beeld van de piramidale laag en stratum radiatum van de Ca1-regio van een gekweekte organotypic hippocampal segment dat ateam 1.03yemk in neuronen uitdrukt. Rechtsboven: vergrote weergave van boxed sectie zoals aangegeven aan de linkerkant. Witte lijnen afbakenen gebieden van belang (ROIs) 1-3 vertegenwoordigen van cellichamen van CA1 piramidale neuronen gekozen voor analyse in (B). BG vertegenwoordigt de ROI die is gekozen voor achtergrondcorrectie. Bodem: pseudo-gekleurde beelden die de fluorescentie-emissie van Venus (groen), eCFP (paars) en de verhouding van Venus/eCFP vertegenwoordigen. B) timelapse-opname in rois 1-3, die neuronale cellichamen vertegenwoordigt (Zie A). Sporen op de linker Toon genormaliseerde fluorescentie emissie van Venus (groen) en eCFP (magenta). Sporen aan de rechterkant tonen de corresponderende ATeam FRET ratio. Merk op dat perfusie met 5 mM NaN3 bij afwezigheid van extracellulaire glucose gedurende 1 minuut (grijze balk) een omkeerbare afname van de ATEAM fret ratio induceert, wat duidt op een afname van de INTRACELLULAIRE ATP-concentratie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Om de stabiliteit van het preparaat en de sensor onder lange termijn experiment omstandigheden te waarborgen, werden plakjes die ATeam in neuronen of astrocyten uitdrukken voortdurend geperfectiongebruikt met ACSF gedurende langere perioden (> 50 min; n = 12 cellen elk, N = 3 Otc's uit 3 hersenen). Onder deze omstandigheden is de ATeam FRET ratio niet veranderd (Figuur 8). Blootstelling van de preparaten aan CIS met metabole remmers ("chemische ischemie", Zie tabel 1), in tegenstelling tot, resulteerde weer in de verwachte daling van de ATEAM fret ratio zoals hierboven waargenomen.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg"> Figuur 8: basis experimenten met ATeam. Long-term ATeam FRET ratio imaging in 14 verschillende cellen onder Baseline condities in neuronen (boven) en astrocyten (onder). Gegevens werden onder vergelijkbare omstandigheden genomen als andere experimentele gegevens. Aan het einde van elke meting werd chemische ischemie opgewekt door perfusie met CIS zoals aangegeven door de pijl. Opmerking: Baseline ATeam FRET ratio's zijn stabiel in de tijd onder Baseline condities. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Vervolgens analyseerden we de reacties van neuronen en astrocyten die ATeam 1.03Yemk uitdrukken in een toename van de extracellulaire kaliumconcentratie. Na het vaststellen van een stabiele Baseline werden neuronen geperfectiongebruikt met een zoutoplossing waarbij de kaliumconcentratie gedurende 3 minuten werd verhoogd van 3 naar 8 mM (Figuur 9a). Deze manipulatie leidt echter niet tot een detecteerbare verandering in de ATeam FRET ratio (n = 56 cellen in N = 5 segmenten). Om ervoor te zorgen dat de sensor reageerde op een verandering in de ATP-niveaus, werden de segmenten vervolgens weer blootgesteld aan een aanhoudende periode van chemische ischemie die werd opgewekt door E-ACSF door CIS te vervangen. Chemische ischemie resulteerde in een snelle afname van de ATeam FRET ratio naar een nieuw, stabiel niveau, wat duidt op de nominale uitputting van ATP na 2-3 min (Figuur 9a).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg"> Figuur 9: representatieve experimenten ter illustratie van veranderingen in de ATP-niveaus in neuronen en astrocyten. (A,B): afbeeldingen op de linker Toon ateam fluorescentie van neuronen en astrocyten gelegen in de hippocampal Ca1 regio van organotypic plakjes. Sporen aan de rechterkant vertegenwoordigen timelapse-opnames van de ATeam FRET ratio verkregen uit een ROI gepositioneerd over een enkel cellichaam. In beide experimenten werden plakjes voor het eerst blootgesteld aan een toename van de extracellulaire kaliumconcentratie gedurende 3 minuten (Zie bar), gevolgd door een uiteindelijke blootstelling aan chemische ischemie. Merk op dat terwijl neuronen niet reageren op de verhoging van extracellulair kalium (A), astrocyten reageren met een toename in ATP (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Hetzelfde experimentele protocol werd uitgevoerd met plakjes, waarin ATeam 1.03Yemk werd uitgedrukt in astrocyten. In tegenstelling tot wat in neuronen werd waargenomen, reageerden astrocyten op de toename van het extracellulaire kalium door een omkeerbare toename van de ATeam-FRET ratio, wat duidt op een toename van de intracellulaire ATP-niveaus (n = 70 cellen in N = 5 segmenten) (Figuur 9B). De daaropvolgende blootstelling aan chemische ischemie resulteerde, zoals verwacht, in een grote daling van de ATeam FRET ratio, indicatief voor de nominale depletie van intracellulaire ATP (Figuur 9B).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

We beschrijven een protocol voor cel-type specifieke uitdrukking van de genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde sensor ATeam 1.03Yemk in organotypische segment culturen van de muis forebrain. Bovendien, we laten zien hoe deze sensor gebruiken voor dynamische beeldvorming van cellulaire ATP niveaus in neuronen en astrocyten.

Imaging van intracellulaire ATP in Organotypic weefsel segmenten van de muis hersenen met behulp van de FRET-gebaseerde sensor ATeam 1.03Yemk

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Hier laten we zien hoe we de ATP-gevoelige FRET-sensor ATeam 1.03 YEMK kunnen gebruiken voor dynamische metingen van veranderingen in neuronale en astrocytische ATP-niveaus in organotypisch gekweekte muis hippocampal plakjes. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men energiemetabolisme in levend hersenweefsel in een gecontroleerde omgeving kan bestuderen, een omgeving met hoge sensorexpressieniveaus. Deze techniek kan helpen bij het verkrijgen van inzichten in pathomechanisms, onderliggende ziekten, of hersenschade, bijvoorbeeld, veroorzaakt door energiedeprivatie, zoals ischemische beroerte.Het kan in principe worden gebruikt om ATP-niveaus te bestuderen, niet alleen in hersenweefsel, maar ook in andere organen. Om dit experiment succesvol uit te voeren, is het essentieel om alle stappen uit te voeren die betrokken zijn bij het kweken van het weefsel uiterst voorzichtig en om steriliteit te behouden. Bovendien is enige kennis van cellulaire fluorescerende beeldvorming vereist.Weefselbehandeling in de meest geavanceerde aanpak en een visualisatie is van vitaal belang om de juiste procedures te begrijpen. Hetzelfde geldt voor beeldvormende experimenten. Het aantonen van de procedure zal Rodrigo Lerchundi, een postdoc, en Na Huang, een master student van het laboratorium.In een ijskoud petrischaaltje gevuld met ACSF, plaats de hersenen op een filter membraan. Scheid de hemisferen en voer een parasagittale snede uit onder een hoek van 45 graden. Bevestig een halfrond in het vibratomeweefsel stadium met superlijm, en onmiddellijk de overdracht van het weefsel blok naar de Vibratome bad met ijskoude ACSF bubbelde met 5% kooldioxide en 95%zuurstof.Lijn het weefsel in het Vibratome bad uit. Houd het tweede halfrond in ijskoude ACSF tot het snijden. Pas de Vibratome aan om plakjes op 250 tot 400 micrometer te snijden.Na het snijden van de slice, identificeer de hippocampal formatie op basis van zijn typische morfologische verschijning en isoleren met behulp van hypodermische naalden, waardoor het deel van de hersenschors grenzend aan de hippocampus. Plaats de plak op een gaas in ACSF, opgewarmd tot 34 graden Celsius en bubbelde met 5% kooldioxide en 95% zuurstof totdat alle plakjes zijn verzameld. Breng de plakjes naar de laminaire stroomkast om verder te gaan onder steriele omstandigheden.Met een omgekeerde, steriele, glazen Pasteur pipet, breng je de plakjes van de ACSF voorzichtig over in een van de voorverwarmde petrischaaltjes gevuld met steriele Hanks'zoutoplossing. Verander de pipet en breng de plakjes naar de tweede cultuurschaal. Herhaal het proces vijf keer in totaal.Breng zo min mogelijk HBSS over naar de volgende kweekplaten. Met behulp van een pipet, voorzichtig plaats een plak per keer op de top van de cultuur insert. Vermijd turbulenties in de pipet en wacht tot het plakje afdaalt naar de punt van de Pasteur pipet.Herhaal het proces voor elk segment. Plaats twee plakjes op een membraan. Verwijder voorzichtig eventuele overtollige Hank-oplossing van de bovenkant van de wisselplaat met behulp van een fijne tip.Bewaar de culturen in een bevochtigde couveuse op 5% kooldioxide en 37 graden Celsius tot de dag van het experiment. Vervang het medium om de twee tot drie dagen. Zonder het weefsel aan te raken, breng 0,5 microliter van de verdunde vector rechtstreeks op de bovenkant van elk segment.Tot slot, plaats de plakjes terug in de couveuse en onderhoud ze daar nog minstens zes dagen. Net voor het starten van een experiment, breng een insert met gekweekte plakjes in de steriele kap, en plaats het in een 30 millimeter schotel met een milliliter organotypic slice cultuur medium, of minimale essentiële medium. Plaats de schotel onder de stereoscoop en focus op het oppervlak van de plak.Gebruik twee steriele injectienaalden om een korte dwarsdoorsnede te maken op de smalle randen van een gekozen plak, en in de bovenste laag zonder het weefsel eronder te beschadigen. Om het geprepareerde plaksel uit de wisselplaat te verwijderen, houdt u de randen van het membraan met een pincet vast en gebruikt u een steriele scalpel om rechte, parallelle sneden aan het membraan te maken, waarbij een vierkant of een driehoek met het segment in het midden wordt gevormd. Als de insert extra plakjes bevat, breng deze dan terug naar de originele plaat en in de couveuse.De oppervlaktespanning van het medium voorkomt lekkage op het oppervlak van het membraan. Bereid experimentele ACSF en verkrijg een pH van 7,4 door het te borrelen met 95% zuurstof en 5% kooldioxide door middel van een ingebrachte slang aangesloten op de carbogen levering gedurende ten minste dertig minuten. Houd de zoutoplossing borrelde tijdens het hele experiment.Schakel vervolgens de fluorescerende lichtbron van de monochrometer in. Breng de organotypic slice cultuur in de experimentele kamer. Plaats een raster op de top van de organotypic slice cultuur met het frame naar beneden, niet aanraken van de cultuur, en de draden omhoog, het aanraken van het membraan.Plaats de kamer op het microscoopstadium en sluit deze aan op het perfusiesysteem. Schakel de peristaltische pomp in met een stroomsnelheid van 1,5 tot 2,5 milliliter per minuut. Zorg ervoor dat het perfusiesysteem niet lekt.Breng met behulp van transmissielicht het gekweekte deel in beeld en identificeer het gebied waar experimenten moeten worden uitgevoerd. Voordat u begint met beeldvormingsexperimenten, wacht u minstens 15 minuten om de plakjes aan te passen aan de zoutomstandigheden en schakel u vervolgens de camera en de beeldsoftware in. Prikkel het donor fluorescerende eiwit op 435 nanometer.Stel de belichtingstijd in op 40 tot 90 milliseconden. Plaats vervolgens de dichroic spiegel en de filters in de bundel splitter unit. Splits de fluorescentie emissie op 500 nanometer met een emissie beeld splitter, en gebruik band pass filters op 482 plus of min 16 en 542 plus of min 13,5 nanometer om verder te isoleren donor en acceptoresfluorescentie.Selecteer een regio van belang blijkbaar verstoken van cellulaire fluorescentie voor achtergrond aftrekken. Cirkel enkele structuren van gelabeld weefsel in de afbeelding op het scherm om ROI's te maken. Stel de frequentie in van beeldverwerving en de totale opnametijd.Voor experimenten langer dan 30 minuten wordt een acquisitiefrequentie van 0,2 tot 0,5 Hertz aanbevolen om fototoxiciteit te voorkomen. Start vervolgens de opname. Als u veranderingen in intracellulaire ATP wilt veroorzaken, schakelt u de perfusiebuis van standaard ACSF over naar een zoutoplossing die metabole remmers bevat, bijvoorbeeld chemische ischemieoplossing.U ook een zoutoplossing met verhoogde kaliumconcentratie bij acht millimolar gebruiken om het vrijkomen van kaliumionen uit actieve neuronen na te bootsen. Direct na de opnames, uitwisseling van de experimentele ACSF met enorm veel gebufferde ACSF. Breng vervolgens de opnamekamer met de slicecultuur over naar de confocale laserscanmicroscoop.Neem Z-stackbeelden met de hoogst mogelijke Z-resolutie bij de gegeven optische configuratie. In dit protocol, tien dagen na een transductie, werden neuronen die ATeam 1.03 YEMK uitdrukken gevonden bij hoge dichtheid in de neocortex van gekweekte weefselschijven op diepten tot 50 micrometer onder het snijoppervlak. Vergelijkbare resultaten werden bereikt in de hippocampus.Voor astrocyten werd ATeam 1.03 YEMK uitgedrukt onder de controle van de menselijke glia-zuurzuurzuurproever, en organotypische plakjes die ATeam 1.03 YEMK uitdrukken in de hippocampal neuronen geselecteerde ROI's vertegenwoordigen de somata van piramidale cellen. Na het blootstellen van de slice tot 5 millimolar natrium azide bij afwezigheid van extracellulaire glucose gedurende een minuut, werden tegenovergestelde veranderingen veroorzaakt in de emissie-intensiteit van het FRET-paar. Ook werd een omkeerbare daling van de ATeam FRET-ratio waargenomen.Lange termijn ATeam FRET ratio in 14 verschillende cellen onder basislijnomstandigheden in neuronen en astrocyten tonen aan dat het ATeam een betrouwbare en stabiele sensor is. Houd er rekening mee dat de chemische ischemie resulteerde in de verwachte sterke daling van de ATeam-ratio in beide celtypen aan het einde van dit experiment. Een toename van de extracellulaire kaliumconcentratie van drie naar acht millimolar gedurende drie minuten heeft niet geleid tot een aantoonbare verandering in de neuronen die ATeam 1.03 YEMK uitdrukken.Astrocyten reageerden daarentegen op de toename van extracellulair kalium door een omkeerbare toename van de ATeam FRET-ratio, wat wijst op een toename van intracellulaire ATP-niveaus. Nogmaals, chemische ischemie veroorzaakte een onmiddellijke daling van de ATeam-ratio, waaruit blijkt dat de sensor veranderingen in ATP kan detecteren. Bij een poging tot fret-gebaseerde cellulaire beeldvorming zoals hier beschreven, is het belangrijk om in gedachten te houden dat de productie van hoogwaardige plakjes in organotypische culturen is een belangrijke stap.Bovendien zijn zorgvuldige verwijdering van het glialitteken en de beeldvorming op expertniveau vereist. Na deze procedure moet men ook in staat zijn om experiment uit te voeren waarin verschillende andere fret-gebaseerde nanosensor voor cellulaire metabolieten. Bijvoorbeeld die voor glucose of lactaat.Ten slotte, maar niet in de laatste plaats, moet worden benadrukt dat er altijd rekening moet worden gehouden met relevante handelingen ter bescherming van dieren. Dit geldt ook voor de effectieve wetgeving inzake de omgang met genetisch gemodificeerde organismen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse imaging van neuroblast migratie in Acute Schijfjes van de volwassen muis voorhersenen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselectieve Biolistische Targeting in Organotypische Brain Plakjes met een aangepaste Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Een grondige fysiologische analyse van Defined Cell Populaties in Acute Tissue Slices van de Muis Vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Twee-foton beeldvorming van Microglial processen attractie naar ATP of serotonine in Acute hersenen plakjes

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Etikettering en beeldvorming van amyloïde plaques in hersenweefsel met behulp van de natuurlijke Polyphenol curcumine

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...