Name: imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Die Autoren bedanken sich bei Claudia Roderigo und Simone Durry für die fachkundige technische Unterstützung. Wir danken Dr. Niklas J. Gerkau und M.Sc. Joel Nelson für die Unterstützung bei der Vorbereitung der organotypischen Scheibenkulturen. Die Forschung im Autorenlabor wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; FÜR 2795: Ro 2327/13-1 und SPP 1757: Ro 2327/8-2 zu CRR; und SPP 1757: Young Glia Start-Up-Förderung an RL).

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen. Die Autoren erhielten finanzielle Unterstützung für die Open-Access-Publikation von Nikon Microscope Solutions, Düsseldorf, Deutschland, die Instrumente produziert, die im Videoartikel verwendet werden. Das Unternehmen war weder an der Gestaltung der hier vorgestellten Experimente, noch an deren Ausführung, an der Datenverarbeitung, noch an der Manuskriptschrift beteiligt.

Hier zeigen wir ein Verfahren zur zelltypspezifischen Expression von ATeam1.03YEMK, einem FRET-basierten, genetisch kodierten Nanosensor14, zur Messung von Veränderungen der ATP-Spiegel in Astrozyten oder Neuronen in organotypischen Gewebescheibenkulturen des Maushirns15. In beispielhaften Aufnahmen zeigen wir, dass eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration nicht zu einer Veränderung der ATP-Konzentrationen in Neuronen führt, während die astrozytischen ATP-Spiegel als Reaktion auf diese Manipulation steigen. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass bei Hemmung des Zellstoffwechsels das ATeam1.03YEMK FRET-Verhältnis bei beiden Zelltypen rapide abnimmt, was auf eine schnelle Abnahme des intrazellulären ATP hindeutet.
Die Expression von ATeam1.03YEMK in organotypischen Scheibenkulturen erfordert die Erhaltung des Gewebes in der Kultur unter kontrollierten Bedingungen für mindestens 7-10 Tage. Alternativ kann ATeam1.03YEMK auch zur Messung von ATP in akut isolierten Hirngewebescheiben und in Sehnerven von Mäusen13,15eingesetzt werden. Messungen in akut isoliertem Gewebe erfordern jedoch die Erzeugung transgener Tiere oder eine stereotaktische Anwendung viraler Vektoren in das Gehirn, die Tierversuche und strenge Tierpflegeprotokolle beinhalten. In dieser Hinsicht stellt die ATeam1.03YEMK-Expression in organotypischen Gewebescheibenkulturen eine nützliche und wertvolle Alternative22,23dar. Seit vielen Jahren dienen organotypische Gewebescheibenkulturen als etabliertes Modellsystem zur Untersuchung neuronaler Eigenschaften, Konnektivität und Entwicklung24,25,26. Sie erhalten nicht nur die allgemeine Gewebearchitektur und Laminierung (Abbildung 1), sondern beherbergen auch die bevorzugten Eigenschaften von Zellkulturen wie überlegene Zugänglichkeit und direkte Kontrolle experimenteller Bedingungen. Organotypische Gewebescheibenkulturen werden auch routinemäßig verwendet, um fremde Gene mit viralen Vektoren auszudrücken27. Mehrere Arten von viralen Vektoren wurden berichtet, transgenes in Gehirngewebe zu liefern16,28. Adenovirale Vektoren induzieren eine hohe Expression in Gliazellen, aber nicht Hippocampus-Neuronen16, und könnte gliare Reaktivität erzeugen17. Adeno-assoziierte virale Vektoren, wie hier verwendet, erscheinen als eine gute Alternative15, und ihre Wirksamkeit wurde auch in vivo29gezeigt.
Während vor allem für die Untersuchung der neuronalen Eigenschaften verwendet, neuere Studien haben festgestellt, dass organotypische Gewebe-Scheibenkulturen auch für die Analyse von Astrozyten verwendet werden können. Kultivierte Scheiben werden in der Regel von einer Schicht reaktiver Astrozyten19,30 (Abbildung 5) abgedeckt, aber Astrozyten zeigen eine nativere, nicht-reaktive Morphologie und Zytoarchitektur in tieferen Schichten19,30 (Abbildung 5). In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Verfahren zur mechanischen Entfernung der äußeren Glianarbe, das zu einer besseren experimentellen und optischen Zugänglichkeit einheimischer Astrozyten innerhalb der richtigen organotypischen Gewebeschichten führt. Darüber hinaus verbessert seine Entfernung die Expression Wirksamkeit in tieferen Schichten der organotypischen Scheiben; Wenn die Glianarbe nicht entfernt wird, kann die Transduktion durch AAVs auf die oberflächlichen Zellschichten beschränkt sein.
Bei der Durchführung von Experimenten in Gewebescheiben müssen mehrere externe mechanische Faktoren berücksichtigt werden. Eine Variation der Durchblutungsgeschwindigkeit des Bades kann Bewegungen der gesamten Zubereitung auslösen und/oder Fokusänderungen auslösen, was zu künstlichen transienten Veränderungen des Sensorsignals führt. Darüber hinaus wurden sowohl Astrozyten als auch Neuronen berichtet, um auf mechanische Verformungen zu reagieren, wie durch hohe Perfusionsratenauferlegt 32,33. In unseren Händen führt die Verwendung einer zuverlässigen Peristaltikpumpe zusammen mit der Aufrechterhaltung kleiner und stabiler Mengen an Saline zwischen Gewebe und Ziel (Meniskus) zu einem stabilen FRET-Signal unter Ausgangsbedingungen bei der hier verwendeten Perfusionsgeschwindigkeit (1,5-2,5 ml/min; Abbildung 8).
In der vorliegenden Studie zeigen wir auch, dass FRET-basierte Bildgebung mit ATeam1.03YEMK zur Überwachung des ATP-Spiegels in Neuronen und Astrozyten eingesetzt werden kann. Ein alternatives Mittel, das früher für die Messung der zellulären ATP eingeführt wurde, ist der sogenannte Luziferin-Luziferase-Assay34,35,36,37. Dieser Ansatz basiert jedoch auf der Abbildung der Biolumineszenz und bietet nur eine eher geringe zeitliche und räumliche Auflösung, teilweise aufgrund hoher Hintergrundgeräusche. Eine weitere Methode, die in den letzten Jahren routinemäßig angewandt wurde, war die Abbildung von Veränderungen der intrazellulären Magnesiumkonzentration mit dem ionenempfindlichen Fluorophor Magnesium grün38,39,40. Dieser Ansatz bezieht sich auf die Beobachtung, dass ein ATP-Verbrauch zur Freisetzung seines Co-Faktors Magnesium führt. Die Bildgebung mit Magnesiumgrün liefert dabei nur eine sekundäre Schätzung der Veränderungen der ATP-Werte. Darüber hinaus ist Magnesiumgrün auch empfindlich gegenüber Veränderungen des intrazellulären Kalziums, was eine weitere Schwierigkeit bei der Interpretation der mit dieser Methode erzielten Ergebnisse einführt.
Die jüngste Entwicklung von genetisch kodierten Nanosensoren zur direkten Bildgebung zellulärer Metaboliten stellte daher einen großen Schritt nach vorn dar11,12. Es wurden verschiedene Sensoren erzeugt, die zur Messung von intrazellulären ATP36,41,42,43eingesetzt werden können. Dazu gehören der ratiometrische fluoreszierende ATP-Indikator "QUEEN"41 sowie PercevalHR, der das ATP:ADP-Verhältnis42erkennt. Die letztgenannte Sonde ist zwar ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung des Energiestatus von Zellen, erfordert aber eine gleichzeitige Messung von Veränderungen des pH42.
ATeam ist ein Nanosensor, von dem es mehrere Varianten gibt, die sich unter anderem in ihrer Bindungsaffinität zu ATP14unterscheiden. In vitro weist ATeam1.03YEMK ein Kd von 1,2 mM bei 37 °C auf, das in der Nähe von zellulären ATP-Spiegeln liegt, die in verschiedenen neuronalen Zelltypen bestimmt sind und von Hypothalamus und Kleinhirn34 bis Hippocampus37,44,45. Bei Küvettenmessungen führte die Senkung der Temperatur um 10 °C zu einer signifikanten Abnahme der Bindungsaffinität von ATeam1.03YEMK zu ATP, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise nicht ideal für die zelluläre Bildgebung bei Raumtemperatur14ist. Unsere frühere Studie15zeigte jedoch, dass das Verhalten und die Reaktion von ATeam1.03YEMK, ausgedrückt in Neuronen und Astrozyten, bei verschiedenen Manipulationen bei nahezu physiologischen und Raumtemperatur ähnlich ist, was darauf hindeutet, dass der Sensor eine zuverlässige Bestimmung der intrazellulären ATP-Spiegel unter beiden Bedingungen ermöglicht. Darüber hinaus befassten sich unsere früheren Experimente mit der pH-Empfindlichkeit von ATeam1.03YEMK in Zellen15, was zeigte, dass es unempfindlich gegen Veränderungen der intrazellulären pH-Einheiten um etwa 0,1-0,2 pH-Einheiten ist. Wenn das Kd im niedrigen mM-Bereich ein Problem ist, könnten alternative ATeam-Varianten14verwendet werden, darunter rot verschobene Varianten von ATeam ("GO-ATeam")43.
Unsere Experimente mit ATeam1.03YEMK zeigen, dass eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration nur um wenige mM (von 3 auf 8 mM) zu einer vorübergehenden Erhöhung des ATeam1.03YEMK-Verhältnisses in Astrozyten in der organotypischen Scheibenkultur führt. Diese Beobachtung bestätigt frühere Studien15,46 und zeigt deutlich, dass Astrozyten auf die Freisetzung von Kalium durch aktive Neuronen mit einer Erhöhung ihrer ATP-Produktion reagieren, meist wahrscheinlich als Folge einer Stimulation der Na+/K+-ATPase und der Na+/HCO3- Cotransporter, bzw.47,48. Im Gegensatz dazu zeigten Neuronen keine Antwort, die auch mit früheren Arbeiten im Einklang steht15. Beide Zelltypen reagierten jedoch schnell und stark auf die Hemmung der zellulären Glykolyse und der mitochondrialen Atmung, wie vor15gezeigt. Unter den Bedingungen der chemischen Ischämie fielen die ATeam FRET-Verhältnisse auf ein neues stabiles Niveau, was auf eine nominale Erschöpfung des zellulären ATP hindeutet. Das letztgenannte Ergebnis legt nahe, dass sowohl Neuronen als auch Astrozyten einen relevanten ATP-Verbrauch auch unter stationären Bedingungen ohne zusätzliche Stimulation durch synaptische Aktivierung oder Anwendung von Neurotransmittern aufweisen. Zusammengenommen kommen wir zu dem Schluss, dass FRET-basierte Bildgebung mit genetisch kodierten Nanosensoren, darunter ATeam1.03YEMK, einen wertvollen Ansatz bieten wird, um die zellulären Prozesse aufzuklären, die für Veränderungen der intrazellulären ATP-Spiegel und den zellulären ATP-Verbrauch unter verschiedenen Bedingungen verantwortlich sind.

Die exzitatorische elektrische Aktivität von Neuronen basiert weitgehend auf dem Fluss von Kationen wie Natrium (Na+) und Kalium (K+) über ihre Plasmamembranen. Die Aufrechterhaltung der elektrochemischen Gradienten dieser beiden Ionen ist daher für die Signalisierung erforderlich. Dies wird durch die zelluläre Na+/K+-ATPase (NKA) erreicht, eine allgegenwärtig exprimierte elektrogene Transmembranpumpe, die 3 Na+ aus der Zelle im Austausch für 2 K+ aus dem extrazellulären Raum extrudiert, was den Verbrauch eines Moleküls ATP pro Transportzyklus1erfordert. Neben dem NKA gibt es noch einige weitere ATP-verbrauchende Ionentransporter, darunter die Plasmamembran Ca2+-ATPase, die für die intrazelluläre Ca2+ Homöostase und deren Export nach aktivitätsinduziertem Zustrom2von entscheidender Bedeutung ist. In präsynaptischen Vesikeln erzeugt ein Vakuolar-Typ H+-ATPase (v-ATPase) den Protonengradienten, der für die Aufnahme des Neurotransmitters in dieses Fach erforderlich ist3.
Während die Aktivität von Neuronen daher eine erhebliche Menge an ATP4erfordert, weisen sie keine signifikante Kapazität für die Speicherung von Energie auf. Stattdessen scheinen sie auf metabolische Wechselwirkungen mit benachbarten Astrozyten zu verlassen, die wichtigsten Glykogenspeicher im Gehirn5. Es wurde vorgeschlagen, dass astrozytisches Glykogen in der Tat eine wichtige Rolle bei der Unterstützung des neuronalen Energiebedarfs spielt; und ein Schlüsselphänomen in dieser vorgeschlagenen neurometabolischen Kopplung zwischen den beiden Zelltypen ist die Fähigkeit der Astrozyten, ihre ATP-Produktion als Reaktion auf neuronale Aktivität zu erhöhen6,7,8. Diese Hypothese, bekannt als Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttle (ANLS), ist immer noch in der Debatte, weil andere Arbeiten Beweise dafür geliefert haben, dass Neuronen auch ihre eigene Rate der Glykolyse als Reaktion auf Stimulation9,10erhöhen können, was die Notwendigkeit weiterer Methoden und Ansätze zur Untersuchung der Neuro-Glia-Interaktion widerspiegelt.
Die Untersuchung des zellulären Energiestoffwechsels und des ATP-Spiegels in Neuronen und Astrozyten zur Aufklärung neuro-gliametabolischer Wechselwirkungen wird seit langem durch das Fehlen geeigneter Sonden zum Nachweis von Veränderungen der Metabolitenkonzentrationen in lebenden Zellen im Hirngewebe behindert. Das letzte Jahrzehnt hat jedoch einen Schub in der Entwicklung neuer Werkzeuge und neuer genetisch kodierter Fluoreszenzsonden für verschiedene Metaboliten, einschließlich Sensoren für ATP, Laktat, Pyruvat und andere11,12. Mit diesen Werkzeugen ist es nun möglich, Fragen im Zusammenhang mit dem zellulären ATP-Verbrauch und Veränderungen der zellulären Energieniveaus auf Einzelzellebene und zelltypspezifisch in intaktem Hirngewebe direkt zu behandeln13.
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung der zytosolischen ATP-Dynamik auf Neuronen und Astrozyten kultivierter organotypischer Gehirnscheiben. Wir zeigen, wie adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) für die zelltypspezifische Expression des genetisch kodierten ATP-Nanosensors ATeam1.03YEMK (14) in Neuronen und Astrozyten von Scheiben des Maushirns verwendet werden, die in der Zellkultur für mehrere Wochen gehalten werden können15. Es wird ein Verfahren beschrieben, wie die Glianarbe entfernt wird, die kultivierte Gewebescheiben bedeckt, was die optische Zugänglichkeit und Bildgebung von Zellen in den darunter liegenden organotypischen Gewebeschichten verbessert. Schließlich zeigen wir, wie ATeam1.03YEMK verwendet werden kann, um FRET-basierte Abbildungvonen von Veränderungen in zellulären ATP-Spiegeln in dieser Zubereitung durchzuführen. Diese Methode hostet die wichtigsten Vorteile, dass es keine chirurgischen Gehirnverfahren erfordert, bietet hohe Expression der Sensor- und Zelltyp-Spezifität in kultivierten Gehirnscheiben, Verringerung der Invasivität oder Stress in den Zellen im Vergleich zu anderen Methoden, wie Transfektion durch Elektroporation oder Transduktion mit anderen viralen Vektoren10,16,17. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf andere FRET-basierte Nanosensoren angewendet werden, darunter Varianten von ATeam1.03, die eine geringere Bindungsaffinität für ATP14bieten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxyglucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L07338</td>
			<td>Non-metabolizable glucose analog</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-IMA-410-019 Argon laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>488 nm wavelength argon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3525.1</td>
			<td>Antioxidant, Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 483/32</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 542/27</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 455 LP</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 505 LPXR</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scannig microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit)</td>
			<td>OriginLab corporation</td>
			<td></td>
			<td>Scientific graphing and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Caelo</td>
			<td>2580-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td>Perfusion chamber for live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394</td>
			<td>With Phenol Red for pH monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator HERAcell &#174; 150 with decontamination routine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAsafe KS/KSP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>26050088</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td>SVI Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.52i</td>
			<td>Wayne Rasban national Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software available in the public domain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP serie peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>High-precisionmulti-channel pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout software, Illustrator CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 16</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software for basic data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture insert</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7278</td>
			<td>Synthetic cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator Polychrome V</td>
			<td>Thermo Scientific/FEI</td>
			<td></td>
			<td>Ultra fast switching monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3 (Sodium Azide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &#8734;/0 WD 2.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Water Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements 4.50 advanced Research</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software. Upgraded version for FRET imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Pro Liquid GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS 6 Version 13.0</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v244</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v307</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WVIEW GEMINI optic system</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Emission Image Splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk

Die neuronale Aktivität im Zentralnervensystem (ZNS) weckt eine hohe Nachfrage nach zellulärer Energie, die durch den Abbau von Adenosintriphosphat (ATP) entsproche. Ein großer Teil von ATP wird benötigt, um Ionengradienten über Plasmamembranen, die durch elektrische Signalisierung von Neuronen abgebaut werden, neu zu installieren. Es gibt Hinweise darauf, dass Astrozyten - während sie selbst keine schnellen elektrischen Signale erzeugen - eine erhöhte Produktion von ATP als Reaktion auf neuronale Aktivität durchlaufen und aktive Neuronen unterstützen, indem sie ihnen Energiemetaboliten zur Verfügung stellen. Die jüngste Entwicklung genetisch kodierter Sensoren für verschiedene Metaboliten ermöglicht nun die Untersuchung solcher metabolischen Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Astrozyten. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur zelltypspezifischen Expression des ATP-empfindlichen Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragungssensors (FRET-) Sensor ATeam1.03YEMK in organotypischen Gewebescheibenkulturen des Maus-Hippocampus und des Kortex mit adeno-assoziierten viralen Vektoren (AAV). Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Sensor zur dynamischen Messung von Veränderungen der zellulären ATP-Spiegel in Neuronen und Astrozyten bei Zunahmen des extrazellulären Kaliums und nach Induktion chemischer Ischämie (d. h. einer Hemmung des zellulären Energiestoffwechsels) eingesetzt werden kann.

AAV-Vektoren sind ein zuverlässiges Werkzeug, um fremde Gene in Zellen innerhalb lebenden Gewebes selektiv auszudrücken16. Die direkte Anwendung von AAVs, die die Sequenzkassette von ATeam1.03YEMK und einen bestimmten Promotor enthalten, führt zu einem hohen Ausdruck des Sensors im gewählten Zelltyp. Bei DIV 14 (ca. 10 Tage nach einer Transduktion) werden Neuronen, die ATeam unter dem menschlichen Synapsinpromotor exzessiieren, mit hoher Dichte im Neocortex kultivierter Gewebescheiben in Tiefen von bis zu 50 m unter der Schnittoberfläche gefunden (Abbildung 5A). Vergleichbare Ergebnisse können im Hippocampus erzielt werden (Abbildung 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg"> Abbildung 5: Visualisierung von Neuronen, die ATeam1.03YEMK in kultivierten parasagittalen organotypischen Gehirnscheiben exdrücken. Die Bilder auf der linken Seite entsprechen erweiterten Fokusprojektionen von 43 optischen Abschnitten (je 1,05 m) kortikalen Gewebes (A) und (B) von 70 optischen Abschnitten (je 0,6 m) Hippocampusgewebe. Bilder auf der rechten Seite stellen die Lautstärkeansicht derselben Projektion dar. Zellen werden entsprechend ihrer Tiefe relativ zur Schnittfläche farbcodiert, wie durch die Farbskala auf der rechten Seite angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Für die Messung des ATP-Spiegels in Astrozyten wird ATeam1.03YEMK unter der Kontrolle des humanen glialfibrillären sauren Proteins (GFAP) promotorisiert. Dies führt zu einer effizienten Transduktion von Zellen in Neocortex und Hippocampus von kultivierten Gewebescheiben (Abbildung 6). Insbesondere können je nach Tiefe der Scheibenpräparate zwei verschiedene morphologische Phänotypen unterschieden werden. In der ersten, oberflächlichen Schicht zeichnen sich Zellen durch dicke Primärprozesse aus, die überwiegend parallel zur Oberfläche angeordnet sind. Diese Zellen weisen stark überlappende Domänen auf, wodurch ein dichtes Netz scheinbar reaktiver Astrozyten entsteht (Abbildung 6). In tieferen Schichten (30-60 m von der Oberfläche) zeigen transduzierte Astrozyten feine zelluläre Prozesse, die weitgehend sphärische Domänen bilden, und ihre Morphologie ähnelt der von Astrozyten in situ, wie zuvor berichtet19,20,21 ( Abbildung6). Um eine bessere Transduktion von tieferen Astrozyten sowie einen besseren optischen Zugang zu diesen tieferen Schichten zu erhalten, kann das gliale Narbengewebe entfernt werden, wie in Schritt 4 beschrieben.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg"> Abbildung 6: Visualisierung von Astrozyten, die ATeam1.03YEMK in kultivierten parasagittalen organotypischen Gehirnscheiben exdrücken. Das Bild auf der linken Seite entspricht einer erweiterten Fokusprojektion von 191 optischen Abschnitten (je 0,45 m). Zur Veranschaulichung wurde die Glianarbe von der Projektion von Astrozyten ausgeschlossen. Bilder auf der rechten Seite stellen die Lautstärkeansicht derselben Projektion vor und nach dem Entfernen der Glianarbe dar. Zellen werden entsprechend ihrer Tiefe relativ zur Schnittfläche farbcodiert, wie durch die Farbskalen auf der rechten Seite angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die erfolgreiche Expression von ATeam1.03YEMK ermöglicht die dynamische Messung von Veränderungen der ATP-Spiegel in Neuronen oder Astrozyten, abhängig vom verwendeten Promotor (siehe oben). Experimente wurden in einem Versuchsbad durchgeführt, das ständig mit E-ACSF durchdrungen ist (mit 95% O2/5%CO2). In organotypischen Scheiben, die ATeam1.03YEMK in Hippocampus-Neuronen exdrücken, wurden vor Beginn der Aufnahme Interessensgebiete (ROIs) ausgewählt, die die Somata von Pyramidenzellen darstellen (Abbildung 7A). Darüber hinaus wurde eine Region für Hintergrundsubtraktion ausgewählt (Abbildung 7A). Die Emission von Venus sowie eCFP-Fluoreszenz wurde dann für jeden dieser ROIs separat erhoben und im Laufe der Zeit als Fluoreszenzemissionsniveau dargestellt (Abbildung 7B). Nach der Aufzeichnung der Fluoreszenz unter Kontrollbedingungen für mehrere Minuten, um eine stabile Ausgangsbasis zu gewährleisten, wurde der Zellstoffwechsel durch die Exposition der Scheibenzubereitung einer glukosefreien Kochsaline gehemmt, der 5 mM Natriumazid (NaN3) für eine Minute zugesetzt wurde (Abbildung 7B). Diese Manipulation führte zu gegenteiligen Veränderungen der Emissionsintensität des FRET-Paares(Abbildung 7B, linke Paneele), mit einer Abnahme der Venus (527 nm) und einer Erhöhung der eCFP-Emission (475 nm). Die Berechnung des FRET-Verhältnisses durch Division der Fluoreszenzemission der Venus durch die von eCFP (FVenus/FeCFP) führte zu Signalen, die die relativen Veränderungen der intrazellulären ATP-Werte widerspiegeln, das sogenannte "ATeam FRET-Verhältnis"(Abbildung 7B, rechtes Panel). In allen aufgezeichneten Neuronen (n = 70 Zellen in N = 5 Scheiben) verursachte NaN3 eine reversible Abnahme des ATeam FRET-Verhältnisses, was auf eine reversible Abnahme der intrazellulären ATP-Spiegel bei Hemmung des Zellstoffwechsels hindeutet.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg"> Abbildung 7: Demonstration der Zeitraffer-ATeam FRET-Verhältnis-Bildgebung. (A) Oben links: Weitfeldfluoreszenzbild der Pyramidenschicht und des Stratum radiatum der CA1-Region einer kultivierten organotypischen Hippocampusscheibe, die ATeam1.03YEMK in Neuronen ausdrückt. Oben rechts: Vergrößerte Ansicht des Geschachtelten, wie auf der linken Seite angegeben. Weiße Linien umreißen Interessengebiete (ROIs) 1-3, die Zellkörper von CA1-Pyramidenneuronen darstellen, die für die Analyse in ausgewählt wurden (B). BG stellt den ROI dar, der für die Hintergrundkorrektur ausgewählt wurde. Unten: Pseudofarbene Bilder, die die Fluoreszenzemission von Venus (grün), eCFP (lila) und das Verhältnis von Venus/eCFP darstellen. (B) Zeitrafferaufzeichnung in ROIs 1-3, die neuronale Zellkörper darstellen (siehe A). Spuren auf der linken Seite zeigen eine normalisierte Fluoreszenzemission von Venus (grün) und eCFP (Magenta). Spuren auf der rechten Seite zeigen das entsprechende ATeam FRET Verhältnis. Beachten Sie, dass eine Perfusion mit 5 mM NaN3 in Abwesenheit von extrazellulärer Glukose für 1 Minute (grauer Balken) eine reversible Abnahme des ATeam FRET-Verhältnisses induziert, was auf eine Abnahme der intrazellulären ATP-Konzentration hindeutet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Um die Stabilität der Präparation und des Sensors unter langfristigen Versuchsbedingungen zu gewährleisten, wurden Scheiben, die ATeam in Neuronen oder Astrozyten exexzessiver exemitzen, über längere Zeiträume ständig mit ACSF durchdrungen (>50 min; n = 12 Zellen, N = 3 OTCs aus 3 Gehirnen). Unter diesen Bedingungen hat sich das ATeam FRET-Verhältnis nicht geändert (Abbildung 8). Die Exposition der Präparate gegenüber CIS, die metabolische Inhibitoren enthalten ("Chemische Ischämie", siehe Tabelle 1), führte dagegen erneut zu einem erwarteten Rückgang des ATeam-FRET-Verhältnisses, wie oben beobachtet.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg"> Abbildung 8: Basisexperimente mit ATeam. Langfristige ATeam FRET-Verhältnis-Bildgebung in 14 verschiedenen Zellen unter Ausgangsbedingungen in Neuronen (oben) und Astrozyten (unten). Die Daten wurden unter vergleichbaren Bedingungen wie andere experimentelle Daten entnommen. Am Ende jeder Messung wurde chemische Ischämie durch Perfusion mit GUS ausgelöst, wie durch den Pfeil angegeben. HINWEIS: Die Basis-ATeam-FRET-Verhältnisse sind unter Basisbedingungen im Zeitverlauf stabil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Als nächstes analysierten wir die Reaktionen von Neuronen und Astrozyten, die ATeam1.03YEMK auf eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration ausdrücken. Nach der Festlegung einer stabilen Ausgangsbasis wurden neuronen mit einer Saline durchdrungen, bei der die Kaliumkonzentration für 3 Minuten von 3 auf 8 mM erhöht wurde(Abbildung 9A). Diese Manipulation hat jedoch nicht zu einer nachweisbaren Änderung des ATeam FRET-Verhältnisses geführt (n = 56 Zellen in N = 5 Slices). Um sicherzustellen, dass der Sensor auf eine Änderung der ATP-Werte reagierte, wurden die Scheiben dann wieder einer anhaltenden Periode chemischer Ischämie ausgesetzt, die durch den Ersatz von E-ACSF durch CIS ausgelöst wurde. Chemische Ischämie führte zu einem schnellen Rückgang des ATeam FRET-Verhältnisses auf ein neues, stabiles Niveau, was auf eine nominale Erschöpfung des ATP nach 2-3 min hindeutet (Abbildung 9A).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg"> Abbildung 9: Repräsentative Experimente zur Veranschaulichung von Veränderungen des ATP-Spiegels in Neuronen und Astrozyten. (A,B): Bilder auf der linken Seite zeigen ATeam Fluoreszenz von Neuronen und Astrozyten im Hippocampus CA1 Region von organotypischen Scheiben. Spuren auf der rechten Seite stellen Zeitrafferaufzeichnungen des ATeam FRET-Verhältnisses dar, die aus einem ROI gewonnen werden, der über einem einzelnen Zellkörper positioniert ist. In beiden Experimenten wurden die Scheiben zunächst 3 Minuten lang einer Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration unterzogen (siehe Bar), gefolgt von einer endgültigen Exposition gegenüber chemischer Ischämie. Beachten Sie, dass, während Neuronen nicht auf die Erhöhung des extrazellulären Kaliums (A) reagieren, reagieren Astrozyten mit einer Erhöhung der ATP (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Das gleiche experimentelle Protokoll wurde mit Slices durchgeführt, in denen ATeam1.03YEMK in Astrozyten ausgedrückt wurde. Im Gegensatz zu dem, was in Neuronen beobachtet wurde, reagierten Astrozyten auf die Zunahme des extrazellulären Kaliums durch eine reversible Erhöhung des ATeam FRET-Verhältnisses, was auf einen Anstieg der intrazellulären ATP-Spiegel hindeutet (n = 70 Zellen in N = 5 Scheiben) (Abbildung 9B). Die anschließende Exposition gegenüber chemischer Ischämie führte erwartungsgemäß zu einem starken Rückgang des ATeam-FRET-Verhältnisses, was auf eine nominale Erschöpfung des intrazellulären ATP hindeutet (Abbildung 9B).

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Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Wir beschreiben ein Protokoll zur zelltypspezifischen Expression des genetisch codierten FRET-basierten Sensors ATeam1.03YEMK in organotypischen Scheibenkulturen des Mausvorhirns. Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Sensor für die dynamische Bildgebung von zellulären ATP-Spiegeln in Neuronen und Astrozyten verwendet wird.

Bildgebung von intrazellulärem ATP in organotypischen Gewebescheiben des Maushirns mit dem FRET-basierten Sensor ATeam1.03YEMK

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Hier zeigen wir, wie der ATP-empfindliche FRET-Sensor ATeam 1.03 YEMK für dynamische Messungen von Veränderungen des neuronalen und astrozytatischen ATP-Spiegels in organotypisch kultivierten Maus-Hippocampus-Scheiben verwendet wird. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass man den Energiestoffwechsel im lebenden Hirngewebe in einer kontrollierten Umgebung untersuchen kann, einer Umgebung mit hohen Sensorexpressionsniveaus. Diese Technik kann helfen, Einblicke in Pathomechanismen, zugrunde liegende Krankheiten oder Hirnschäden zu gewinnen, zum Beispiel durch Energieentzug, wie ischämischen Schlaganfall.Es kann im Prinzip verwendet werden, um ATP-Spiegel zu studieren, nicht nur im Gehirngewebe, sondern auch in anderen Organen. Um dieses Experiment erfolgreich durchzuführen, ist es wichtig, alle Schritte durchzuführen, die bei der Kultivierung des Gewebes extrem sorgfältig und steril itätserhalten sind. Darüber hinaus sind einige Kenntnisse der zellulären fluoreszierenden Bildgebung erforderlich.Die Gewebehandhabung in einem ausgefeiltesten Ansatz und einer Visualisierung ist entscheidend, um die richtigen Verfahren zu verstehen. Dasselbe gilt für bildgebende Experimente. Demonstriert wird das Verfahren von Rodrigo Lerchundi, einem Postdoc, und Na Huang, einem Master-Studenten aus dem Labor.In einer eiskalten Petrischale, gefüllt mit ACSF, legen Sie das Gehirn auf eine Filtermembran. Trennen Sie die Hemisphären und führen Sie einen parasagittalen Schnitt in einem Winkel von 45 Grad durch. Fixieren Sie eine Hemisphäre im Vibratome-Gewebestadium mit Superkleber und übertragen Sie den Gewebeblock sofort in das Vibratome-Bad, das eiskalte ACSF enthält, die mit 5% Kohlendioxid und 95% Sauerstoff sprudelt.Richten Sie das Gewebe im Vibratome-Bad aus. Halten Sie die zweite Hemisphäre in eiskaltem ACSF bis zum Schneiden. Passen Sie das Vibratome an, um Scheiben mit 250 bis 400 Mikrometern zu schneiden.Nach dem Schneiden der Scheibe, identifizieren Sie die Hippocampus-Bildung auf der Grundlage ihrer typischen morphologischen Aussehen und isolieren Sie es mit hypodermischen Nadeln, wobei der Teil der Großhirnrinde neben dem Hippocampus zu halten. Legen Sie die Scheibe auf ein Netz in ACSF, erwärmt auf 34 Grad Celsius und sprudeln mit 5% Kohlendioxid und 95% Sauerstoff, bis alle Scheiben gesammelt werden. Übertragen Sie die Scheiben in den laminaren Strömungsschrank, um unter sterilen Bedingungen fortzufahren.Mit einer invertierten, sterilen Pasteur-Pipette aus Glas die Scheiben aus dem ACSF vorsichtig in eine der vorgewärmten Petrischalen mit steriler Hanks'Salz-Lösung übertragen. Wechseln Sie die Pipette und übertragen Sie die Scheiben auf das zweite Kulturgericht. Wiederholen Sie den Vorgang insgesamt fünfmal.Übertragen Sie so wenig HBSS wie möglich auf die folgenden Kulturplatten. Mit einer Pipette eine Scheibe nach der anderen vorsichtig auf die Oberseite des Kultureinsatzes legen. Vermeiden Sie Turbulenzen in der Pipette und warten Sie, bis die Scheibe zur Spitze der Pasteur-Pipette absteigt.Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Slice. Legen Sie zwei Scheiben auf eine Membran. Entfernen Sie sorgfältig überschüssige Hank-Lösung von der Oberseite des Einsatzes mit einer feinen Spitze.Halten Sie die Kulturen in einem befeuchteten Inkubator bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius bis zum Tag des Experiments. Ersetzen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage. Ohne das Gewebe zu berühren, tragen Sie 0,5 Mikroliter des verdünnten Vektors direkt auf die Oberseite jeder Scheibe auf.Schließlich die Scheiben wieder in den Brutkasten legen und dort noch mindestens sechs Tage pflegen. Kurz vor Beginn eines Experiments einen Einsatz mit kultivierten Scheiben in die sterile Kapuze geben und in eine 30-Millimeter-Schale mit einem Milliliter organotypischen Scheibenkulturmedium oder minimalem essentiellen Medium legen. Legen Sie die Schale unter das Stereoskop und konzentrieren Sie sich auf die Oberfläche der Scheibe.Verwenden Sie zwei sterile hypodermische Nadeln, um einen kurzen Querschnitt direkt an den schmalen Rändern einer ausgewählten Scheibe und in der oberen Schicht zu machen, ohne das darunter liegende Gewebe zu beschädigen. Um die vorbereitete Scheibe aus dem Einsatz zu entfernen, halten Sie die Ränder der Membran mit einer Pinzette und verwenden Sie ein steriles Skalpell, um gerade, parallele Schnitte zur Membran zu machen, die ein Quadrat oder ein Dreieck mit der Scheibe in der Mitte bilden. Wenn der Einsatz zusätzliche Scheiben enthält, übertragen Sie ihn zurück auf die Originalplatte und in den Inkubator.Die Oberflächenspannung des Mediums verhindert, dass es auf die Oberfläche der Membran austritt. Bereiten Sie experimentelle ACSF vor und erhalten Sie einen pH-Wert von 7,4, indem Sie sie mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid durch einen eingelegten Schlauch, der mit der Carbogen-Versorgung verbunden ist, für mindestens dreißig Minuten sprudeln. Halten Sie die Saline während des gesamten Experiments blasen.Schalten Sie dann die Fluoreszenzlichtquelle des Monochrometers ein. Übertragen Sie die organotypische Scheibenkultur in die Versuchskammer. Legen Sie ein Gitter über die organotypische Schnittkultur mit dem Rahmen nach unten, berühren Sie nicht die Kultur, und die Fäden nach oben, berühren Sie die Membran.Stellen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe und schließen Sie sie an das Perfusionssystem an. Schalten Sie die Peristaltikpumpe mit einer Durchflussrate von 1,5 bis 2,5 Milliliter pro Minute ein. Stellen Sie sicher, dass das Perfusionssystem nicht austritt.Mit Demontierungslicht die kultivierte Scheibe in den Fokus rücken und den Bereich identifizieren, in dem Experimente durchgeführt werden sollen. Bevor Sie mit Bildgebungsexperimenten beginnen, warten Sie mindestens 15 Minuten, damit sich die Scheiben an die salinebedingungen anpassen können, und schalten Sie dann die Kamera und die Bildverarbeitungssoftware ein. Erregen Sie den Spender fluoreszierendes Protein mit 435 Nanometern.Stellen Sie die Belichtungszeit auf 40 bis 90 Millisekunden ein. Legen Sie dann den dichroitischen Spiegel und die Filter in die Strahlsplittereinheit ein. Teilen Sie die Fluoreszenzemission mit einem Emissionsbildteiler auf 500 Nanometer und verwenden Sie Bandpassfilter bei 482 plus oder minus 16 und 542 plus oder minus 13,5 Nanometern, um die Fluoreszenz von Spendern und Akzeptoren weiter zu isolieren.Wählen Sie eine Region von Interesse scheinbar frei von zellulärer Fluoreszenz für Hintergrundsubtraktion. Kreisen Sie einzelne Strukturen von beschrifteten Geweben im Bild auf dem Bildschirm ein, um ROIs zu erstellen. Legen Sie die Häufigkeit der Bildaufnahme und die Gesamtaufnahmezeit fest.Für Experimente mit einer Zeit von mehr als 30 Minuten wird eine Erfassungshäufigkeit von 0,2 bis 0,5 Hertz empfohlen, um Phototoxizität zu verhindern. Starten Sie anschließend die Aufzeichnung. Um Veränderungen im intrazellulären ATP zu induzieren, schalten Sie das Perfusionsrohr von Standard-ACSF auf eine Saline mit metabolischen Inhibitoren, z. B. chemische Ischämielösung.Alternativ können Sie eine Saline mit erhöhter Kaliumkonzentration bei acht Millimolar verwenden, um die Freisetzung von Kaliumionen aus aktiven Neuronen nachzuahmen. Tauschen Sie direkt nach den Aufnahmen den experimentellen ACSF mit heaps-gepufferten ACSF aus. Übertragen Sie dann die Aufnahmekammer mit der Scheibenkultur auf das konfokale Laserscanmikroskop.Nehmen Sie Z-Stack-Bilder mit der höchsten Z-Auflösung bei der angegebenen optischen Konfiguration auf. In diesem Protokoll wurden zehn Tage nach einer Transduktion Neuronen, die ATeam 1.03 YEMK exdrücken, mit hoher Dichte im Neocortex kultivierter Gewebescheiben in Tiefen von bis zu 50 Mikrometern unter der Schnittfläche gefunden. Vergleichbare Ergebnisse wurden im Hippocampus erzielt.Für Astrozyten wurde ATeam 1.03 YEMK unter der Kontrolle des menschlichen glialen fibrolarigen sauren Proteinpromotors exprimiert, und organotypische Scheiben, die ATeam 1.03 YEMK in den Hippocampus-Neuronen exprimieren, stellen ausgewählte ROIs die Somata von Pyramidenzellen dar. Nachdem die Scheibe in Ermangelung von extrazellulärer Glukose für eine Minute 5 Millimolar-Natriumazid ausgelegt wurde, wurden entgegengesetzte Veränderungen in der Emissionsintensität des FRET-Paares induziert. Ein reversibler Rückgang des ATeam FRET-Verhältnisses wurde ebenfalls beobachtet.Das langfristige ATeam FRET-Verhältnis in 14 verschiedenen Zellen unter Basisbedingungen in Neuronen und Astrozyten zeigt, dass das ATeam ein zuverlässiger und stabiler Sensor ist. Bitte beachten Sie, dass die chemische Ischämie am Ende dieses Experiments zu einem erwarteten starken Rückgang des ATeam-Verhältnisses bei beiden Zelltypen geführt hat. Eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration von drei auf acht Millimolar für drei Minuten brachte keine nachweisbare Veränderung der Neuronen, die ATeam 1.03 YEMK exdrückten.Im Gegensatz dazu reagierten Die Astrozyten auf den Anstieg des extrazellulären Kaliums mit einem reversiblen Anstieg des ATeam FRET-Verhältnisses, was auf einen Anstieg der intrazellulären ATP-Spiegel hindeutet. Auch hier führte die chemische Ischämie zu einer sofortigen Abnahme des ATeam-Verhältnisses, was zeigt, dass der Sensor Veränderungen in ATP erkennen kann. Beim Versuch der FRET-basierten zellulären Bildgebung, wie hier beschrieben, ist es wichtig zu bedenken, dass die Herstellung von hochwertigen Scheiben in organotypischen Kulturen ein wichtiger Schritt ist.Darüber hinaus sind eine sorgfältige Entfernung der Glianarbe und eine Bildgebung auf Expertenebene erforderlich. Nach diesem Verfahren sollte man auch in der Lage sein, Experimente mit verschiedenen anderen FRET-basierten Nanosensoren für zelluläre Metaboliten durchzuführen. Zum Beispiel, diejenigen für Glukose oder Laktat.Nicht zuletzt muss betont werden, dass relevante Tierschutzmaßnahmen stets beachtet werden müssen. Dies gilt auch für die wirksamen Gesetze über den Umgang mit genetisch veränderten Organismen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Forschung

Neurowissenschaften

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselektive Biolistic Targeting in Organotypische Hirnschnitten mit modifizierter Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisierung und Live Imaging Oligodendrozyt Organellen in organotypischen Gehirnscheiben mit Adeno-assoziierten Virus und konfokale Mikroskopie

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Etikettierung und Bildgebung von Amyloid-Plaques im Gehirngewebe mit dem natürlichen Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...