Name: imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לקלאודיה רודריגו וסימון דוררי לסיוע טכני מומחה. אנו מודים לד ר ניקלאס ג' גרקאו ולM.Sc יואל נלסון לסיוע בהכנת תרביות הפרוסה האורגאולית. מחקר במעבדה של המחבר מומן על ידי האגודה הגרמנית למחקר (DFG; עבור 2795: Ro 2327/13-1 ו SPP 1757: Ro 2327/8-2 ל-CRR; ו-SPP 1757: מימון הסטארט-Up הצעיר של גליה ל RL).

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים. המחברים קיבלו תמיכה פיננסית המאפשרת פרסום גישה פתוחה על ידי מיקרוסקופ ניקון פתרונות, דיסלדורף, גרמניה, אשר מייצרת מכשירים המשמשים במאמר וידאו. החברה לא הייתה מעורבת בעיצוב הניסויים שהוצגו כאן, וגם לא בביצוע, ולא בטיפול בנתונים, ולא בכתב היד.

כאן, אנו להדגים הליך עבור הביטוי הספציפי התא של ATeam 1.03ימק, מבוסס על מבוססי מגנטית, ננוחיישן מקודד גנטי14, עבור מדידה של שינויים ברמות ATP ב אסטרוציטים או נוירונים בתרבויות הפרוסה של רקמת העכבר של המוח העכברים15. בהקלטות למופת, אנו מראים כי עלייה בריכוז אשלגן מתוך החילוץ אינו גורם לשינוי ריכוזי ATP בנוירונים, בעוד רמות ATP astrocytic לעלות בתגובה למניפולציה זו. יתר על כן, התוצאות שלנו להפגין כי על עיכוב של מטבוליזם הסלולר, ATeam 1.03ימק היחס הנכון טיפות במהירות בשני סוגי התא, המציין ירידה מהירה ב-ATP תאיים.
ביטוי של ATeam 1.03ימק בתרבויות הפרוסה האורגאולית מחייב תחזוקה של הרקמה בתרבות תחת תנאים מבוקרים לפחות 7-10 ימים. לחילופין, ateam 1.03ימק יכול גם להיות מועסק עבור מדידה של ATP ב מבודד ביותר פרוסות רקמת המוח בעצבים אופטיים של עכברים13,15. עם זאת, מדידות ברקמה מבודדת בחריפות, מצריכות את הדור של בעלי חיים טרנסגניים או יישום סטריאוטקטיקה של וקטורים ויראליים למוח, הכוללים ניסויים בבעלי חיים ופרוטוקולי טיפול קפדניים בבעלי חיים. בהקשר זה, הביטוי ateam 1.03ימק בתרבויות הפרוסות של רקמות הרקמה האורגאולית מייצג חלופה שימושית ובעלת ערך22,23. במשך שנים רבות, תרבויות אורגאוטימית של רקמה משמשות כמערכת מודל מבוססת לחקר תכונות עצביות, קישוריות ופיתוח24,25,26. הם לא רק לשמור על ארכיטקטורת רקמות כלליות למינציה (איור 1), אלא גם לארח את התכונות העליונות של תרביות תאים כגון נגישות מעולה ושליטה ישירה של התנאים הניסיוניים. הרקמות הפרוסות של הרקמה האורגנותית גם הן מועסקים באופן שגרתי כדי לבטא גנים זרים באמצעות וקטורים ויראליות27. מספר סוגים של וקטורים ויראליות דווחו לספק טרנסגנים לרקמת מוח16,28. וקטורים אדנונגיליים לגרום ביטוי גבוה בתאי גליה, אבל לא היפוקמאל נוירונים16, ועשוי ליצור תגובתיות פעילות מחודשת17. Adeno-וקטורים ויראליות הקשורים כפי שנעשה בשימוש כאן להגיח כחלופה טובה15, ואת האפקטיביות שלהם הוצגה גם ב vivo29.
בעוד בעיקר בשימוש למחקר של תכונות עצבי, מחקרים שנעשו לאחרונה הקימו כי הרקמות האורגאואליות הרקמה פרוסה יכול גם להיות מועסק לניתוח של אסטרוציטים. פרוסות מתרבות מכוסים בדרך כלל על ידי שכבה של אסטרוציטים התגובתית19,30 (איור 5), אבל אסטרוציטים מוצג יליד יותר, מורפולוגיה לא תגובתי ו ציטואדריכלות בשכבות עמוקות יותר19,30 (איור 5). במחקר הנוכחי, אנו מתארים הליך ההסרה המכנית של הצלקת גליה החיצוני, אשר מביא לנגישות ניסיוני ואופטי טוב יותר של האסטרוציטים יליד בתוך שכבות רקמות אורגאוטימית נכונה. כמו-כן, הסרתו משפרת את יעילות הביטוי ברבדים עמוקים יותר של הפרוסות האורגאואיות; אם הצלקת גליה לא יוסר, התמרה על ידי aavs עשוי להיות מוגבל לשכבות התא השטחית.
מספר גורמים מכניים חיצוניים צריכים להיחשב בעת ביצוע ניסויים בפרוסות רקמה. וריאציה על מהירות זלוף אמבטיה יכול לגרום לתנועות של ההכנה כולה ו/או לגרום לשינויים בפוקוס, וכתוצאה מכך שינויים ארעי מלאכותי של אות החיישן. יתר על כן, הן אסטרוציטים ונוירונים דווחו להגיב לדפורמציה מכני כגון מוטלות על ידי שיעורי זלוף גבוה32,33. בידינו, באמצעות המשאבה הפריסטלטית אמין, יחד עם שמירה על כמויות קטנות ויציבות של תמיסת מלח בין הרקמה לבין המטרה (meniscus) התוצאות לשמור יציבה האות תחת תנאים בסיסיים במהירות זלוף בשימוש כאן (1.5-2.5 mL/min; איור 8).
במחקר הנוכחי, אנו גם להדגים כי מבוסס על הדמיה עם ATeam 1.03ימק יכול להיות מועסק כדי לפקח על רמות ATP בנוירונים ו astrocytes. אמצעי חלופי הציג מוקדם יותר עבור מדידה של ATP הסלולר הוא כביכול לluciferin-לוציפראז שיטת34,35,36,37. גישה זו, עם זאת, מבוססת על הדמיה של biלומינסנציה, רק מספק הזמן נמוך למדי רזולוציה מרחבית חלקית בשל רמות רעש ברקע גבוה. שיטה נוספת המועסקים באופן שגרתי בשנים האחרונות היה הדמיה של שינויים בריכוז מגנזיום תאיים באמצעות מגנזיום fluorophoreה38הרגיש של היונים ירוק,39,40. גישה זו מתייחסת להתבוננות שצריכה של ATP גורמת לשחרורו של מגנזיום שיתוף הגורמים. הדמיה עם ירוק מגנזיום ובכך רק מספק הערכה משנית של שינויים ברמות ATP. יתר על כן, ירוק מגנזיום רגיש גם לשינויים בסידן תאיים, החדרת קושי אחר בעת פענוח תוצאות שהתקבלו עם שיטה זו.
הפיתוח האחרון של ננו חיישנים מקודד גנטית עבור הדמיה ישירה של מטבוליטים סלולריים, ולכן, ייצג צעד גדול קדימה11,12. חיישנים שונים מספר נוצרו כי יכול להיות מועסק עבור מדידה של ATP תאיים36,41,42,43. בין היתר, מחוון ה-ATP האומטרי ("QUEEN")41 , כמו גם הפרסיבל, החושי ה-atp: יחס ADP42. בעוד בדיקה האחרון הוא כלי רב ערך לחקר מעמד האנרגיה של תאים, זה דורש מדידה בו של שינויים ב-pH42.
ATeam הוא ננו חיישן שבו קיימים מספר משתנים, אשר-בין היתר-שונים בזיקה המחייב שלהם ל-ATP14. בתוך מבחנה, ATeam 1.03ימק מציג Kd של 1.2 מ"מ ב 37 ° c, אשר קרוב לרמות ATP סלולריים שנקבעו סוגים שונים של תאים עצביים, החל ההיפותלמוס ואת המוח המאלף34 להיפוקמפוס37,44,45. במדידות קובט, הפחתת הטמפרטורה ב-10 ° c הביאה לירידה משמעותית בזיקה המחייב של ATeam 1.03ימק ל-ATP, ומרמזת כי ייתכן שהיא אינה אידיאלית לדימות סלולרי בטמפרטורת החדר14. המחקר הקודם שלנו15, עם זאת, הפגינו כי ההתנהגות והתגובה של ateam 1.03ימק הביע בנוירונים ו אסטרוציטים למניפולציות שונות דומה באופן פיזיולוגי בטמפרטורת החדר, המציין כי החיישן מאפשר קביעה אמינה של רמות ה-ATP תאיים בשני התנאים. בנוסף, הניסויים הקודמים שלנו התייחס ל-pH רגישות של ATeam 1.03ימק בתוך תאים15, מראה כי זה לא רגיש לשינויים ב-ph תאיים על ידי כ 0.1-0.2 יחידות pH. אם ה-K d בטווח הנמוך מ"מ הוא דאגה, משתני ateam חלופיים עשויים לשמש14, ביניהם אדום העביר גרסאות של ATEAM (" GO-ateam ")43.
הניסויים שלנו באמצעות ateam 1.03ימק להדגים כי עלייה בריכוז היכולת המומנת של אשלגן על ידי כמה מ"מ בלבד (מ 3 עד 8 מ"מ) תוצאות עלייה ארעית ביחס ateam 1.03ימק ב אסטרוציטים בתרבות פרוסה של אורגנוסטימית. התבוננות זו מאשרת מחקרים מוקדמים יותר15,46 וברור מציין כי אסטרוציטים להגיב לשחרור של אשלגן על ידי הנוירונים פעילים עם עלייה בייצור ה-ATP שלהם, סביר להניח כתוצאה של גירוי של na+/k+-atpase ו Na+/hco3- coטרנספורטר, בהתאמה47,48. בניגוד לזה, נוירונים לא הראו תגובה, אשר בקנה אחד עם עבודה קודמת כמו גם15. שני התאים, עם זאת, במהירות ובחוזקה הגיבו לעיכוב של גליקוליזה הסלולר ונשימה מיטוכונדריאלי כפי שמוצג לפני15. בתנאים של איסכמיה כימית, יחסי ATeam היחס נפל לרמה יציבה חדשה, המציינת דלדול נומינלי של ATP הסלולר. התוצאה האחרונה עולה כי הן הנוירונים כמו גם אסטרוציטים התערוכה צריכה רלוונטית של ATP גם בתנאים יציבים ללא גירוי נוסף על ידי הפעלה סינפטית או יישום של נוירוטרנסמיטורים. יחד, אנו מסיקים כי הדמיה מבוססת על-ידי מבוסס-על-ידי שיטה מקודדת מבחינה גנטית, ביניהם ATeam 1.03ימק, תספק גישה בעלת ערך רב להסבר התהליכים הסלולריים האחראים לשינויים ברמות ה-atp התאיים ובצריכת ה-atp הסלולרית בתנאים שונים.

פעילות החשמל ההתרגשות של הנוירונים מבוססת בעיקר על שטף של הקטיונים כגון נתרן (Na+) ו אשלגן (K+) על פני קרום הפלזמה שלהם. כך נדרש לצורך איתות בתחזוקת מעברי הצבע האלקטרוכימי של שני יונים אלה. הדבר מבוצע על ידי Na הסלולר+/K+-ATPASE (nka), משאבת באופן אוביגניים הביע האלקטרו-ממברנות, אשר הבלטת משטח של 3 Na+ מתוך התא בתמורה עבור 2 K+ ממרחב החילוץ, המחייב צריכת מולקולה אחת של ATP לכל מחזור הובלה1. בנוסף ל-NKA, ישנם מספר מובילי היונים האחרים של ה-ATP הכוללים את קרום הפלזמה Ca2 +-atpase, שהוא חיוני עבור ca תאיים2 + הומאוסטזיס והיצוא שלה לאחר פעילות המושרה זרם2. ב שלפוחיות סינפטית מראש, מסוג H+-atpase (v-atpase) יוצר מעבר הצבע הפרוטונים הדרוש לספיגת נוירוטרנסמיטור לתוך תא זה3.
בעוד הפעילות של הנוירונים ובכך דורש כמות משמעותית של ATP4, הם אינם מהווים יכולת משמעותית לאחסון של אנרגיה. במקום, נראה שהם סומכים על אינטראקציות מטבולית עם אסטרוציטים השכנה, חנויות הגליקוגן הגדולות במוח5. יש כבר הציע כי הגליקוגן astrocytic אכן ממלא תפקיד חשוב בתמיכה האנרגיה העצבית צרכים; ותופעה מרכזית בתוספת זו מסוג נוירו-מטבולית המוצעת בין שני סוגי התא היא הקיבולת של אסטרוציטים להגדיל את ייצור ה-ATP שלהם בתגובה לפעילות עצבית6,7,8. השערה זו, המכונה astrocyte המעבורת לקטט (anls), הוא עדיין בדיון, כי עבודה אחרת סיפקה ראיות כי הנוירונים עשויים גם להגדיל את שיעור שלהם של גליקוליזיס בתגובה גירוי9,10, המשקף את הצורך של שיטות נוספות גישות ללמוד אינטראקציה נוירו-גליה.
החקירה של מטבוליזם האנרגיה התאית ורמות ATP בנוירונים ו אסטרוציטים כדי להבהיר את האינטראקציות נוירו-glia מטבולית כבר הושפע זמן רב על ידי חוסר בדיקות מתאימות לאיתור שינויים ריכוזי מטבוליזם בתאי החיים ברקמת המוח. העשור האחרון, עם זאת, סיפקה גל בפיתוח של כלים חדשים ובדיקה חדשה גנטית מקודד גנטי עבור מטבוליטים שונים, כולל חיישנים ל-ATP, לקטט, פירובט ואחרים11,12. באמצעות כלים אלה, ניתן כעת לטפל ישירות בשאלות הקשורות לצריכת ה-ATP הסלולרית ולשינויים ברמות האנרגיה התאית ברמת התא היחיד ובאופן ספציפי לסוג תא ברקמת מוח שלמה13.
בעבודה הנוכחית, אנו מתארים הליך להמחיש מסוג ATP הדינמיקה המוחית על נוירונים ו אסטרוציטים של פרוסות המוח אורגאוטימית תרבותית. אנו מראים כיצד להעסיק adeno-הקשורים וקטורים ויראליים (aav) עבור תא סוג ביטוי ספציפי של ATP מקודד גנטית-nanosensor ateam 1.03ימק (14) בנוירונים ו אסטרוציטים של פרוסות של מוח העכבר שניתן לשמור בתרבות התא במשך מספר שבועות15. הליך של איך להסיר את הצלקת גליה המכסה פרוסות רקמה תרבותית מתוארת, אשר משפר את הנגישות האופטית והדמיה של תאים בשכבות רקמה אורגנותמית מתחת. לבסוף, אנו מראים כיצד ATeam 1.03ימק ניתן להשתמש כדי לבצע הדמיה מבוססת-סריג של שינויים ברמות ה-ATP הסלולאריים בהכנה זו. שיטה זו מארחת את היתרונות העיקריים שהוא אינו דורש הליכים מוחית כירורגית, מספק רמות גבוהות של ביטוי של חיישן וסוג התא ספציפיות בפרוסות המוח התרבותי, הפחתת החלטיות או מתח בתאים לעומת שיטות אחרות, כמו העברה על ידי אלקטרופורציה או התמרה עם וקטורים נגיפי אחרים10,16,17. בנוסף, פרוטוקול זה ניתן להחיל על אחרים מבוסס הננו חיישנים, ביניהם גרסאות של ATeam 1.03 המספקים זיקה מחייבת נמוכה יותר עבור ATP14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxyglucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L07338</td>
			<td>Non-metabolizable glucose analog</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-IMA-410-019 Argon laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>488 nm wavelength argon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3525.1</td>
			<td>Antioxidant, Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 483/32</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 542/27</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 455 LP</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 505 LPXR</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scannig microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit)</td>
			<td>OriginLab corporation</td>
			<td></td>
			<td>Scientific graphing and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Caelo</td>
			<td>2580-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td>Perfusion chamber for live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394</td>
			<td>With Phenol Red for pH monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator HERAcell &#174; 150 with decontamination routine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAsafe KS/KSP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>26050088</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td>SVI Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.52i</td>
			<td>Wayne Rasban national Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software available in the public domain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP serie peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>High-precisionmulti-channel pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout software, Illustrator CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 16</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software for basic data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture insert</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7278</td>
			<td>Synthetic cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator Polychrome V</td>
			<td>Thermo Scientific/FEI</td>
			<td></td>
			<td>Ultra fast switching monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3 (Sodium Azide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &#8734;/0 WD 2.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Water Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements 4.50 advanced Research</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software. Upgraded version for FRET imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Pro Liquid GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS 6 Version 13.0</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v244</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v307</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WVIEW GEMINI optic system</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Emission Image Splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk

פעילות עצבית במערכת העצבים המרכזית (CN) מעוררת ביקוש גבוה לאנרגיה תאית המסופקת על-ידי פירוק של אדנוזין טריפוספט (ATP). נתח גדול של ATP צריך להתקין מחדש מעברי יונים על פני קרום פלזמה מושפל על ידי איתות חשמלי של נוירונים. יש הוכחות כי אסטרוציטים-בעוד לא לייצר אותות חשמליים מהירה עצמם-לעבור ייצור מוגבר של ATP בתגובה לפעילות עצבית ותמיכה נוירונים פעילים על ידי מתן אנרגיה מטבוליטים להם. ההתפתחות האחרונה של חיישנים מקודד גנטית עבור מטבוליטים שונים כעת מאפשר את המחקר של אינטראקציות מטבולית כגון בין נוירונים ו astrocytes. כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור ביטוי ספציפי לסוג תא של העברת האנרגיה הפלואורסצנטית הרגיש של ATP-(סריג-) חיישן ATeam 1.03ימק בתרבויות הפרוסות של רקמת העכבר של ההיפוקמפוס והקליפה באמצעות וקטורים הקשורים adeno ויראלי (aav). יתר על כן, אנו מדגימים כיצד חיישן זה יכול להיות מועסק עבור מדידה דינמית של שינויים ברמות ה-ATP הסלולר בנוירונים ו אסטרוציטים על עליות בתוך מסחטות אשלגן ובעקבות אינדוקציה של איסכמיה כימית (כלומר, עיכוב של מטבוליזם האנרגיה התאית).

וקטורים AAV הם כלי אמין באופן סלקטיבי לבטא גנים זרים בתאים בתוך רקמת חיים16. יישום ישיר של AAVs המכיל את הקלטת רצף של ATeam 1.03ימק ומיזם ספציפי מביא ביטוי גבוה של החיישן בסוג התא הנבחר. ב-DIV 14 (~ 10 ימים לאחר התמרה), נוירונים ביטוי ateam תחת היזם סינפסין האנושית נמצאים בצפיפות גבוהה בקליפת המוח של פרוסות הרקמה התרבותית במעמקי של עד 50 יקרומטר מתחת למשטח הפרוסה (איור 5א). תוצאות דומות ניתן להשיג בהיפוקמפוס (איור 5ב).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg"> איור 5: ויזואליזציה של הנוירונים המבטא ATeam 1.03ימק בשנת הפארא-מתורבת של פרוסות מוח אורגנוטימיות. תמונות בצד שמאל תואמים התחזיות מיקוד מורחב של 43 מקטעים אופטיים (1.05 יקרומטר כל אחד) של רקמת קליפת המוח (א) ו (ב) של 70 מקטעים אופטיים (0.6 יקרומטר כל אחד) של רקמת ההיפוקאמאל. תמונות מימין מייצגות את תצוגת אמצעי האחסון של אותה הקרנה. התאים מסומנים בצבע בהתאם לעומק שלהם יחסית למשטח הפרוסה, כפי שמצוין בסולם הצבעים שבצד ימין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
למדידה של רמות ATP ב אסטרוציטים, ATeam 1.03ימק מתבטא תחת השליטה של חלבון חומצי האנושי fibrillary (GFAP) מקדם. התוצאה היא התמרה יעילה של תאים בקליפת המוח וההיפוקמפוס של פרוסות רקמה תרבותית (איור 6). בעיקר, שני פנוטיפים מורפולוגיים שונים ניתן להבדיל, בהתאם לעומק יחסית לפני השטח של ההכנות פרוסה. ברובד הראשון, השכבה השטחית, התאים מאופיינים בתהליכים ראשוניים עבים שמסודרים במקביל לפני השטח. תאים אלה מוצגים בתחומים חופפים מאוד, יצירת מאשר צפופה של האסטרוציטים כנראה תגובתי (איור 6). בשכבות עמוקות יותר (30-60 יקרומטר מפני השטח), מוצג התמרה של התערוכה הסלולרית משובח תהליכים סלולריים שיוצרים תחומים כדוריים ברובו והמבנה שלהם דומה לזה של אסטרוציטים באתרו כפי שדווח מוקדם יותר19,20,21 (איור 6). כדי להשיג התמרה טובה יותר של האסטרוציטים עמוק יותר, כמו גם גישה אופטית טובה יותר השכבות האלה עמוק יותר, רקמת צלקת גליה ניתן להסיר כמתואר בשלב 4.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg"> איור 6: ויזואליזציה של אסטרוציטים ביטוי ATeam 1.03ימק בשנת הפאראטילית התרבותית של המוח בפרוסות. התמונה בצד שמאל מקבילה לתחזית ממוקדת מורחבת של 191 מקטעים אופטיים (0.45 יקרומטר כל אחד). להמחשה, הצלקת גליה לא נכלל ההקרנה של האסטרוציטים. תמונות מימין מייצגות את תצוגת עוצמת הקול של אותה הקרנה לפני ואחרי הסרת הצלקת הגליאל. התאים מסומנים בצבע בהתאם לעומק שלהם יחסית למשטח הפרוסה, כפי שמצוין על-ידי סולמות הצבע בצד ימין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ביטוי מוצלח של ATeam 1.03ימק מאפשר את המדידה הדינמית של שינויים ברמות ATP בנוירונים או באסטרוציטים, בהתאם ליזם המשמש (ראה לעיל). ניסויים נערכו באמבט ניסיוני כל הזמן עם E-ACSF (בעבע עם 95% O2/5% CO2). בפרוסות אורגאואיות המבטאות ATeam 1.03ימק בנוירונים, אזורים מעניינים (rois) נבחרו לפני התחלת ההקלטה, המייצגים את התאים האחרים של תאי הסחלב (איור 7א). יתר על כן, אזור לחיסור רקע נבחר (איור 7א). פליטת ונוס, כמו גם eCFP פלואורסצנטית נאסף אז עבור כל אחד ROIs אלה בנפרד מתואר כרמת פליטה של זריחה לאורך זמן (איור 7B). לאחר הקלטת זריחה תחת תנאי שליטה במשך כמה דקות כדי להבטיח בסיס יציב, חילוף החומרים הסלולר היה מעוכב על ידי חשיפת הכנת הפרוסה לתמיסת מלח נטול גלוקוז, שאליו 5 מ"מ נתרן (נאן3) התווסף לדקה אחת (איור 7ב). מניפולציה זו המושרה שינויים הפוך את עוצמת הפליטה של הזוג סריג (איור 7B, שמאל חלוניות), עם ירידה של ונוס (527 nm) ועלייה של הפליטה ecfp (475 nm). חישוב יחס סריג על ידי חלוקת פליטת הזריחה של ונוס על ידי eCFP (Fונוס/Fecfp) הביא אותות המשקפים את השינויים היחסיים ברמות ATP תאיים, מה שנקרא "ateam היחס הנכון" (איור 7B, הלוח הימני). בכל הנוירונים מוקלטים (n = 70 תאים N = 5 פרוסות), נאן3 גרם לירידה הפיכה ביחס ateam, המציין ירידה הפיכה ברמות ATP תאיים על עיכוב של חילוף החומרים הסלולרי.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg"> איור 7: הפגנה של צניחה בזמן ATeam יחס הדמיה. (א) למעלהמשמאל: תמונת הזריחה הרחבה של שכבת הפירמידה ושכבה רדיואטום של האזור CA1 של היפוקמאז בהידמית תרבותית המבטא ateam 1.03ימק בנוירונים. למעלה מימין: תצוגה מוגדלת של מקטע מסגרת כמצוין משמאל. קווים לבנים מצטלבים אזורים מעניינים (ROIs) 1-3 המייצגים את גופי התא של נוירונים CA1 מידאל שנבחרו לניתוח ב (ב). BG מייצג את ה-ROI שנבחר לתיקון רקע. בתחתית: תמונות בצבע דומה המייצגים פליטת זריחה של ונוס (ירוק), eCFP (סגול) ואת היחס של ונוס/eCFP. (ב) הקלטה של הזמן ב-rois 1-3, המייצג גופי תאים עצביים (ראה A). רשמים משמאל מראים פליטת קרינה מנורמלת של ונוס (ירוק) ו-eCFP (מגנטה). עקבות בצד ימין להראות את היחס המתאים ATeam לדאוג. שים לב כי זלוף עם 5 מ"מ נאן3 בהיעדר גלוקוז מתוך החילוץ עבור 1 דקה (בר אפור) משרה ירידה הפיך ביחס לדאוג ateam, המציין ירידה בריכוז ATP תאיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כדי להבטיח את יציבות ההכנה ואת החיישן בתנאים ארוכי טווח הניסוי, פרוסות ביטוי ateam בנוירונים או אסטרוציטים היו כל הזמן עם acsf לתקופות ממושכות (> 50 דקות; n = 12 תאים כל אחד, n = 3 otcs מ 3 מוחות). בתנאים אלה לא השתנה יחס הפרט (איור 8). חשיפת ההכנות ל-CIS המכיל מעכבי מטבולית ("איסכמיה כימית", לראות את שולחן 1), לעומת זאת, שוב הביא את הירידה הצפויה ביחס לדאוג ateam כפי שנצפתה לעיל.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg"> איור 8: ניסויים בסיסיים בהעסקת ATeam. לטווח ארוך ateam היחס הדמיה ב 14 תאים שונים בתנאים הבסיסיים בנוירונים (למעלה) ו אסטרוציטים (למטה). נתונים נלקחו בתנאים דומים כמו נתונים ניסיוניים אחרים. בסוף כל מדידה, איסכמיה כימית היתה מעוררת על ידי הפרזיה עם CIS כפי שמצוין על ידי החץ. הערה: היחס הבסיסי של ATeam הוא יציב לאורך זמן בתנאים בסיסיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בשלב הבא, ניתחנו את התגובות של נוירונים ו אסטרוציטים המבטא ateam 1.03ימק לעלייה בריכוז היכולת המפוטאותאי. לאחר יצירת קו בסיס יציב, נוירונים היו מלוחים עם תמיסת מלח שבה ריכוז אשלגן הוגדלה מ 3 עד 8 מ"מ עבור 3 דקות (איור 9א). עם זאת, מניפולציה זו לא הייתה תוצאה של שינוי לזיהוי ביחס הטיפול ב-ATeam (n = 56 תאים ב-N = 5 פרוסות). כדי להבטיח שהחיישן הגיב לשינוי ברמות ה-ATP, הפרוסות נחשפו שוב לתקופה ממושכת של איסכמיה כימית שהגיבה על ידי החלפת E-ACSF על ידי CIS. איסכמיה כימית הביאה לירידה מהירה ב-ATeam ביחס לרמה חדשה ויציבה, המציינת דילול נומינלי של ATP אחרי 2-3 דקות (איור 9א).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg"> איור 9: ניסויים מייצגים הממחישות שינויים ברמות ATP בנוירונים ו אסטרוציטים. (א,ב): תמונות על התצוגה השמאלית ateam פלואורסצנטית מנוירונים ו אסטרוציטים הממוקם באזור CA1 היפוקמאל של פרוסות אורגאוסטיאית. עקבות בצד ימין מייצגים הקלטות לפקיעה זמן של יחס הדאגה ATeam המתקבל מתוך ROI ממוקם על גוף תא בודד. בשני הניסויים, הפרוסות הראשונות נחשפו לגידול בריכוז האשלגן במשך 3 דקות (ראה בר), ואחריו חשיפה סופית לאיסכמיה כימית. שים לב כי בעוד נוירונים לא מגיבים העלאת של אשלגן החילוץ (א), האסטרוציטים להגיב עם עלייה ב-ATP (ב). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
אותו פרוטוקול ניסיוני בוצע עם פרוסות, שבו ATeam 1.03ימק התבטא ב אסטרוציטים. בניגוד למה שנצפה בנוירונים, אסטרוציטים הגיב לעלייה אשלגן מסחטות על ידי עלייה הפיכה ביחס לדאוג ateam, המציין עלייה ברמות ATP תאיים (n = 70 תאים n = 5 פרוסות) (איור 9ב). החשיפה הבאה של איסכמיה כימית הביא, כצפוי, בירידה גדולה ביחס ATeam, הרומז על דלדול הנומינלי של ATP תאיים (איור 9ב).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

אנו מתארים פרוטוקול עבור ביטוי מסוים בסוג תא של החיישן מקודד גנטית המבוסס על החיישנים ATeam 1.03ימק בתרבויות הפרוסות של העכבר הקדמי. יתר על כן, אנו מראים כיצד להשתמש בחיישן זה עבור הדמיה דינמית של רמות ATP סלולריים בנוירונים ו astrocytes.

הדמיה של ATP תאיים בפרוסות רקמה אורגנותית של המוח העכבר באמצעות חיישן מבוסס-הסריג ATeam 1.03ימק

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

כאן אנו מדגימים כיצד להשתמש בחיישן FRET רגיש ATP ATeam 1.03 YEMK למדידות דינמיות של שינויים ברמות ATP עצביות ואסטרוציטיות בפרוסות היפוקמפוס עכבר מתורבתות אורגנוטיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי אחד יכול ללמוד חילוף החומרים של האנרגיה ברקמת המוח חי בסביבה מבוקרת, סביבה עם רמות ביטוי חיישן גבוהות. טכניקה זו עשויה לסייע בהשגת תובנות על פתומכניזם, מחלות בסיסיות, או נזק מוחי, למשל, הנגרם על ידי מחסור באנרגיה, כמו שבץ איסכמי.זה יכול, באופן עקרוני, לשמש לחקר רמות ATP, לא רק ברקמת המוח, אבל באיברים אחרים גם כן. כדי להפעיל בהצלחה את הניסוי הזה, חיוני לבצע את כל השלבים המעורבים culturing הרקמה זהיר מאוד ולשמור על סטריליות. יתר על כן, קצת ידע של הדמיה פלואורסצנטי הסלולר נדרש.טיפול ברקמות בגישה המתוחכמת ביותר והדמיה חיוניים להבנת ההליכים הנכונים. הדבר נכון גם לגבי ניסויי הדמיה. הדגמת ההליך תהיה רודריגו לרצ'ונדי, פוסט-דוק, נה הואנג, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה.בצלחת פטרי קרה כקרח מלאה ב- ACSF, מניחים את המוח על קרום מסנן. להפריד את ההמיספרות ולבצע חתך parasagittal בזווית של 45 מעלות. תקן חצי כדור אחד בשלב רקמת הרטט עם דבק-על, והעבר מיד את בלוק הרקמה לאמבט הרטט המכיל ACSF קר כקרח עם 5% פחמן דו-חמצני ו-95% חמצן.יישר את הרקמה באמבט הרטט. שמור על חצי הכדור השני ב- ACSF קר כקרח עד חיתוך. כוונן את הרטט לפרוסות חתוכים ב-250 עד 400 מיקרומטר.לאחר חיתוך הפרוסה, זהה את היווצרות ההיפוקמפוס בהתבסס על המראה המורפולוגי הטיפוסי שלו ובודד אותו באמצעות מחטים מזרק, תוך שמירה על החלק של קליפת המוח הסמוכה להיפוקמפוס. מניחים את הפרוסה על רשת ב- ACSF, מחוממת ל-34 מעלות צלזיוס ומבעבעת ב-5% פחמן דו-חמצני ו-95% חמצן עד שכל הפרוסות נאספות. מעבירים את הפרוסות לארון הזרימה למינארי כדי להמשיך בתנאים סטריליים.עם פיפטה פסטר הפוכה, סטרילית וזכוכית, מעבירים בעדינות את הפרוסות מה-ACSF לאחת ממנות פטרי מחוממות מראש, המלאות בתספורת סטרילית של הנקס. משנים את הפיפסה ומעבירים את הפרוסות לצלחת התרבות השנייה. חזור על התהליך חמש פעמים בסך הכל.העבר כמה שפחות HBSS לצלחות התרבות הבאות. בעזרת פיפטה, מניחים בעדינות פרוסה אחת בכל פעם בחלק העליון של הוספת התרבות. הימנע מערבולות פיפטה, ולחכות עד הפרוסה יורדת לקצה פיפטה פסטר.חזור על התהליך עבור כל פרוסה. מניחים שתי פרוסות על קרום. בזהירות להסיר כל פתרון האנק עודף מהחלק העליון של הכנס באמצעות טיפ עדין.שמור את התרבויות באינקובטור לח ב 5%פחמן דו חמצני ו 37 מעלות צלזיוס עד יום הניסוי. החלף את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים. מבלי לגעת ברקמה, יש למרוח 0.5 מיקרוליטר של הווקטור המדולל ישירות על החלק העליון של כל פרוסה.לבסוף, מניחים את הפרוסות בחזרה לתוך החממה ולשמור אותם שם לפחות שישה ימים נוספים. רגע לפני שמתחילים בניסוי, מעבירים הכנס המכיל פרוסות מתורבתות למכסה המנוע הסטרילי, ומכניסים אותו לצלחת של 30 מילימטר המכילה מיליליטר אחד של מדיום תרבות פרוסה אורגנותית, או מדיום חיוני מינימלי. מניחים את המנה מתחת לסטריאוסקופ ומתמקדים על פני השטח של הפרוסה.השתמש בשתי מחטים מזרק סטרילי לעשות חתך לחצות קצר ממש על הקצוות הצרים של פרוסה שנבחרה, ובשכבה העליונה מבלי לפגוע ברקמה שמתחת. כדי להסיר את הפרוסה המוכנה מהתוספת, החזיקו את קצות הממברנה עם פינצטה ולהשתמש באזמל סטרילי כדי לבצע חתכים ישרים ומקבילים לקרום, ויוצרים ריבוע או משולש עם הפרוסה במרכז. אם ההוספה מארחת פרוסות נוספות, מעבירים אותה בחזרה לצלחת המקורית ולתוך החממה.מתח פני השטח של המדיום ימנע את זליגתו אל פני השטח של הממברנה. הכן ACSF ניסיוני ולקבל pH של 7.4 על ידי מבעבע אותו עם 95%חמצן ו 5%פחמן דו חמצני דרך צינור מוכנס מחובר אספקת הפחמן לפחות שלושים דקות. שמור על בועות מלוחים במהלך הניסוי כולו.לאחר מכן הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי של המונוכרומטר. מעבירים את תרבות הפרוסות האורגנוטיפיקות לתא הניסוי. מניחים רשת על גבי תרבות הפרוסות האורגנוטיפיקות כשהמסגרת למטה, לא נוגעים בתרבות, וחוטים למעלה, נוגעים בממברנה.מניחים את התא על שלב המיקרוסקופ ולחבר אותו למערכת חיסון. הפעל את המשאבה ההיסטלית בקצב זרימה של 1.5 עד 2.5 מיליליטר לדקה. ודא שאין דליפה של מערכת חיסון.באמצעות אור שידור, להביא את הפרוסה התרבותית לפוקוס ולזהות את האזור שבו ניסויים יבוצעו. לפני תחילת ניסויי הדמיה, המתן לפחות 15 דקות כדי לאפשר לפרוסות להסתגל לתנאי התמיסת מלח ולאחר מכן הפעל את המצלמה ואת תוכנת ההדמיה. רגש את חלבון הפלואורסצנט התורם ב 435 ננומטר.הגדר את זמן החשיפה ל- 40 עד 90 אלפיות שניה. לאחר מכן הכנס את המראה הדיקורית ואת המסננים ליחידת מפצל הקרן. לפצל את פליטת הפלואורסצנטיות ב 500 ננומטר עם מפצל תמונת פליטה, ומעסיקים מסנני מעבר הלהקה ב 482 פלוס או מינוס 16 ו 542 פלוס או מינוס 13.5 ננומטר כדי לבודד עוד יותר את פלואורסצנטיות התורם והמקבל.בחר אזור מעניין ככל הנראה נטול פלואורסצנטיות תאית עבור חיסור רקע. הקף בעיגול מבנים בודדים של רקמה מסומנת בתמונה על המסך כדי ליצור ROIs. הגדר את התדירות של רכישת תמונה ואת זמן ההקלטה הכולל.לניסויים בני יותר מ-30 דקות, מומלץ לבצע תדירות רכישה של 0.2 עד 0.5 הרץ כדי למנוע פוטוטוקסיות. לאחר מכן, התחל את ההקלטה. כדי לגרום לשינויים ב- ATP תאי, העבר את צינור הזלוף מ- ACSF סטנדרטי לתמיסת מלח המכילה מעכבי מטבולית, למשל, פתרון אצמיה כימית.לחלופין, השתמש מלוחים עם ריכוז אשלגן גבוה בשמונה מילימולרים כדי לחקות שחרור של יון אשלגן מתאי עצב פעילים. מיד לאחר ההקלטות, החלף את ה- ACSF הניסיוני ב- ACSF עם מאגר ערימות. ואז להעביר את תא ההקלטה המכיל את תרבות הפרוסה למיקרוסקופ סריקת לייזר confocal.קח תמונות מחסנית Z ברזולוציית Z הגבוהה ביותר האפשרית בתצורה האופטית הנתינת. בפרוטוקול זה, עשרה ימים לאחר ההתמרה, נוירונים המבטאים ATeam 1.03 YEMK נמצאו בצפיפות גבוהה בניאוקורטקס של פרוסות רקמה מתורבתות בעומקים של עד 50 מיקרומטר מתחת לפני השטח הפרוסים. תוצאות דומות הושגו בהיפוקמפוס.עבור אסטרוציטים, ATeam 1.03 YEMK בא לידי ביטוי תחת שליטתו של מקדם החלבון הפיברולרי האנושי, ופרוסות אורגנוטיפיקות המבטאת ATeam 1.03 YEMK בנוירונים ההיפוקמפוס שנבחרו ROIs מייצגים את סומטה של תאים פירמידליים. לאחר חשיפת הפרוסה ל-5 מילימולאר נתרן אזיד בהיעדר גלוקוז חוץ-תאי למשך דקה אחת, נגרמו שינויים מנוגדים בעוצמת הפליטה של זוג FRET. כמו כן נצפתה ירידה הפיכה ביחס ATeam FRET.יחס ATeam FRET לטווח ארוך ב -14 תאים שונים בתנאים בסיסיים בנוירונים ובאסטרוציטים מראה כי ATeam הוא חיישן אמין ויציב. שים לב כי שום כימי הביא לירידה החזקה הצפויה ביחס ATeam בשני סוגי התאים בסוף ניסוי זה. עלייה בריכוז האשלגן החוץ-תאי משלוש עד שמונה מילימולרים במשך שלוש דקות לא גרם לשינוי ניכר בנוירונים המבטאת ATeam 1.03 YEMK.לעומת זאת, אסטרוציטים הגיבו לעלייה באשלגן חוץ-תאי על ידי עלייה הפיכה ביחס ATeam FRET, מה שמצביע על עלייה ברמות ATP תאיות. שוב, שום כימי גרם לירידה מיידית ביחס ATeam, המוכיח כי החיישן יכול לזהות שינויים ATP. בעת ניסיון הדמיה סלולרית מבוססת FRET כמתואר כאן, חשוב לזכור כי הייצור של פרוסות באיכות גבוהה בתרבויות אורגנוטיפיק הוא צעד מפתח.יתר על כן, הסרה זהירה של צלקת גליה והדמיה ברמת מומחה נדרשים. בעקבות הליך זה, אחד צריך גם להיות מסוגל לבצע ניסוי המשלב ננו-סנסור אחר מבוסס FRET אחר עבור מטבוליטים הסלולר. לדוגמה, אלה עבור גלוקוז או לקטט.אחרון, אבל לא פחות, יש להדגיש כי מעשים רלוונטיים להגנה על בעלי חיים חייבים תמיד להיות שנצפו. זה נכון גם לגבי החוקים היעילים המסדירים את הטיפול באורגניזמים מהונדסים גנטית.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselective Biolistic המיקוד בOrganotypic פרוסות המוח באמצעות אקדח ג&#39;ין השתנה

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

ויזואליזציה והדמיה בשידור חי של Organelles אוליגודנדרוציטים בפרוסות Organotypic המוח באמצעות וירוס Adeno-הקשורים ומיקרוסקופיה קונפוקלית

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

שני הפוטונים הדמיה של תהליכים Microglial המשיכה לכיוון ATP או סרוטונין המוח חריפה פרוסות

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

תיוג והדמיה של שלטי עמילואיד ברקמת המוח באמצעות פוליפנול טבעי כורכומין

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...