Name: imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

著者たちは、クラウディア・ロデリゴとシモーネ・デュリーに専門家の技術支援を感謝したいと考える。ニクラス・J・ゲルカウ博士とジョエル・ネルソンM.Scは、オルガオティピック・スライス文化の準備に協力してくださったことに感謝します。著者の研究室での研究は、ドイツ研究協会(DFG;2795 の場合: Ro 2327/13-1 および SPP 1757: Ro 2327/8-2 から CRR;SPP 1757: RL へのヤング グリアスタートアップ資金)

著者たちは競合する利害関係を宣言しない。著者らは、ビデオ記事で使用される楽器を生産するニコン顕微鏡ソリューションズ、デュッセルドルフ、ドイツによるオープンアクセス出版を可能にする財政的支援を受けました。同社は、ここで提示された実験の設計にも、その実行にも、データ処理にも、原稿の執筆にも関与しませんでした。

ここでは、マウス脳15の組織スライス培養におけるアストロサイトまたはニューロンにおけるATPレベルの変化を測定するための、FRETベースの遺伝子コード化ナノセンサ14であるATeam1.03YEMKの細胞型特異的発現に関する手順を示す。例示的な記録では、細胞外カリウム濃度の上昇はニューロンのATP濃度の変化をもたらさない一方で、この操作に応答して星値ATPレベルが上昇することを示す。さらに、我々の結果は、細胞代謝の阻害に際して、ATeam1.03YEMK FRET比が両方の細胞型で急速に低下し、細胞内ATPの急速な減少を示す。
組織分スライス培養におけるATeam1.03YEMKの発現は、少なくとも7〜10日間制御された条件下で培養中の組織の維持を必要とする。あるいは、ATeam1.03YEMKは、急性単離脳組織スライスおよびマウス13、15の視神経におけるATPの測定にも採用することができる。しかし、急性単離組織での測定には、トランスジェニック動物の生成やウイルスベクターの脳への立体的な応用が必要であり、動物実験と厳格な動物ケアプロトコルが含まれる。この点に関して、組織組織スライス培養におけるATeam1.03YEMK発現は、有用かつ貴重な代替22、23を表す。長年にわたり、組織組織スライス培養は、神経特性、接続性および発達を研究するための確立されたモデルシステムとして機能する。それらは、一般的な組織アーキテクチャと積層(図1)を維持するだけでなく、優れたアクセシビリティや実験条件の直接制御などの細胞培養物の優遇特性をホストする。組織組織スライス培養物はまた、ウイルスベクター27を用いて外来遺伝子を発現させるために日常的に用いられ得る。いくつかのタイプのウイルスベクターが脳組織16、28にトランスジーンを送り出することが報告されている。アデノウイルスベクターはグリア細胞において高発現を誘導するが、海馬ニューロン16は誘導せず、グリア反応性17を発生させ得る。ここで使用されるアデノ関連ウイルスベクターは、良好な代替15として出現し、その有効性はvivo29においても示されている。
主に神経特性の研究に使用されている一方で、最近の研究では、組織組織スライス培養物もアストロサイトの分析に用いることができることが確立されています。培養スライスは、通常、反応性アストロサイト19、30(図5)の層で覆われているが、アストロサイトはより深層19、30においてよりネイティブで非反応性の形態および細胞構造を示す(図5)。本研究では、外グリア瘢痕の機械的除去の手順を説明し、適切な組織学的組織層内の天然アストロサイトのより良い実験的および光学的アクセシビリティをもたらす。さらに、その除去は、組織図スライスのより深い層における発現の有効性を改善する。グリア瘢痕が除去されない場合、AAVによる伝達は表面的な細胞層に制限される傾向がある。
組織スライスで実験を行う際には、いくつかの外部機械的要因を考慮する必要があります。浴灌流速度の変動は、調製物全体の動きを誘発し、焦点の変化を誘発し、センサー信号の人工的な過渡変化をもたらす可能性があります。また、アストロサイトとニューロンの両方が、高い灌流率32、33によって課されるような機械的変形に応答することが報告されている。私たちの手では、信頼性の高い蠕動ポンプを使用して、組織と目的(メニスカス)の間の小さく安定した量の生理食合いを維持すると共に、ここで使用される灌流速度(1.5-2.5 mL/min;)図 8)。
本研究では、ATeam1.03YEMKを用いたFRETベースのイメージングを用いて、ニューロンおよびアストロサイトのATPレベルをモニタリングするために採用できることも実証した。細胞ATPの測定のために先に導入された代替手段は、いわゆるルシフェリン-ルシフェラーゼアッセイ34、35、36、37である。しかし、このアプローチは生物発光のイメージングに基づいており、バックグラウンドノイズレベルが高いため、かなり低い時間的および空間的な分解能を提供するだけです。近年日常的に採用されている別の方法は、イオン感受性フルオロフォアマグネシウムグリーン38、39、40を用いた細胞内マグネシウム濃度の変化のイメージングであった。このアプローチは、ATPの消費が同因子マグネシウムの放出をもたらすという観察に関連する。マグネシウムグリーンによるイメージングは、ATPレベルの変化の二次的な推定値を提供するだけです。また、マグネシウムグリーンは細胞内カルシウムの変化にも敏感であり、この方法で得られた結果を解釈する際に別の困難を引き起こしている。
細胞代謝産物の直接イメージングのための遺伝子コードされたナノセンサの最近の開発は、したがって、大きな前進11、12を表した。細胞内ATP 36、41、42、43の測定に用いることができるいくつかの異なるセンサが生成された。その中には、比率測定蛍光ATP指標「QUEEN」41とPercevalHRが含まれており、ATP:ADP比42を感知する。後者のプローブは、細胞のエネルギー状態を研究するための貴重なツールですが、pH42の変化を同時に測定する必要があります。
ATeam は、ATP14に対する結合親和性が異なるいくつかのバリアントが存在するナノセンサーです。インビトロでは、ATeam1.03YEMKは、視床下部および小脳34から海馬37、44、45に至るまで、異なる神経細胞型で決定される細胞ATPレベルに近い37°Cで1.2mMのKdを示す。キュベット測定では、温度を10°C下げると、ATeam1.03YEMKとATPの結合親和性が有意に低下し、室温14での細胞イメージングには理想的ではない可能性が示唆された。しかしながら、我々の以前の研究15は、異なる操作に対するニューロンおよびアストロサイトで発現されるATeam1.03YEMKの挙動および応答が生理学的および室温で類似していることを実証し、センサーが両方の条件下で細胞内ATPレベルの確実な決定を可能にすることを示した。さらに、これまでの実験では、細胞15内で発現するATeam1.03YEMKのpH感受性に対処し、細胞内pHの変化に対して約0.1〜0.2pH単位で感受性が低いことが示された。低mM範囲のKdが懸念される場合、代替ATeamバリアントは14を使用する可能性があり、その中でもATeamの赤シフトバリアント(「GO-ATeam」)43 。
ATeam1.03YEMKを用いた実験では、細胞外カリウム濃度が数mM(3~8mM)だけ増加すると、組織図スライス培養におけるアストロサイトにおけるATeam1.03YEMK比が一時的に増加することが実証されています。この観察は、以前の研究15、46を確認し、アストロサイトがATP産生の増加に伴う活性ニューロンによるカリウムの放出に反応することを明確に示し、主にNa + /K+-ATPaseおよびNa+/HCO3-共輸送体の刺激の結果として、それぞれ47、48。これとは対照的に、ニューロンは応答を示さなかったが、これは以前の作品と同様に15.しかしながら、両方の細胞型は、15日前に示すように細胞糖上昇およびミトコンドリア呼吸の阻害に迅速かつ強く反応した。化学虚血の条件下では、ATeam FRET比は新しい安定したレベルに低下し、細胞ATPの名目枯渇を示す。後者の結果は、両方のニューロンとアストロサイトがシナプス活性化または神経伝達物質の適用によって追加の刺激なしに定常状態条件下でもATPの関連する消費を示すことを示唆している。まとめると、遺伝的にコードされたナノセンサを用いたFRETベースのイメージングは、その中でもATeam1.03YEMKが、異なる条件下で細胞内ATPレベルと細胞ATP消費の変化を引き起こする細胞プロセスを解明するための貴重なアプローチを提供すると結論付ける。

ニューロンの興奮的な電気活動は、主にその形質膜を横切るナトリウム(Na+)およびカリウム(K+)などのカチオンのフラックスに基づいています。このようにシグナリングには、これら2つのイオンの電気化学的勾配の維持が必要である。これは、細胞Na+/K+-ATPase(NKA)によって達成され、ユビキタスに発現する電気起源膜貫通ポンプであり、細胞外空間から2K+と引き換えに3Na+を細胞から押し出し、輸送サイクル1当たりのATPの1分子の消費を必要とする。NKAに加えて、血漿膜Ca2+-ATPアーゼを含むいくつかの他のATPを消費するイオントランスポーターがあり、これは細胞内Ca2+恒常性およびその輸出に続く活性誘発流入2に不可欠である。シナプス前小胞では、液疱型H+-ATPアーゼ(v-ATPアーゼ)は、このコンパートメント3への神経伝達物質の取り込みに必要なプロトン勾配を作成する。
ニューロンの活性は、このようにATP4のかなりの量を必要としますが、彼らはエネルギーの貯蔵のための重要な容量を示していません。代わりに、彼らは隣接するアストロサイト、脳5の主要なグリコーゲンストアとの代謝相互作用に依存しているようです。星値状グリコーゲンは確かに神経エネルギーの必要性をサポートする上で重要な役割を果たすることが示唆されている;そして、この提案された2つの細胞型間の神経代謝結合における重要な現象は、神経活動6、7、8に応答してATP産生を増加させるアストロサイトの能力である。アストロサイト-ニューロン乳酸シャトル(ANLS)として知られるこの仮説は、他の研究が刺激9、10に応答して糖上昇の独自の速度を増加させるかもしれないという証拠を提供しているので、まだ議論中であり、神経グリア相互作用を研究するためのさらなる方法とアプローチの必要性を反映している。
神経グリア代謝相互作用を解明するニューロンおよびアストロサイトにおける細胞エネルギー代謝およびATPレベルの研究は、脳組織における生細胞における代謝産物濃度の変化の検出に適したプローブの欠如によって長い間妨げられてきた。しかし、過去10年間、ATP、乳酸、ピルビン酸などのセンサーを含む、異なる代謝産物に対する新しいツールと新しい遺伝子コードされた蛍光プローブの開発が急増しました。これらのツールを用いて、細胞ATP消費および細胞エネルギーレベルの変化に関する質問に、単一細胞レベルおよび無傷の脳組織13における細胞型特異的な方法で直接対処することが可能となった。
本研究では、培養組織目細胞のニューロンおよびアストロサイト上の細胞性ATPダイナミクスを可視化する手順について説明する。我々は、数週間15年間細胞培養で維持することができるマウス脳のスライスのニューロンおよびアストロサイトにおいて、遺伝子コードされたATP-ナノセンサATeam1.03YEMK(14)の細胞型特異的発現にアデノ関連ウイルスベクター(AAV)を用いる方法を示す。培養組織スライスを覆うグリア瘢痕を除去する手順について説明し、これは下の組織組織層における細胞の光学的アクセシビリティおよびイメージングを改善する。最後に、ATeam1.03YEMKを使用して、この調製における細胞ATPレベルの変化のFRETベースのイメージングを実行する方法を示します。この方法は、外科的脳の処置を必要としない主な利点をホストし、培養された脳スライスにおけるセンサおよび細胞型特異性の高レベルの発現を提供し、他の方法と比較して細胞内の侵襲性またはストレスを低減し、エレクトロポレーションまたは他のウイルスベクター10、16、17とのトランスフェクションのような。さらに、このプロトコルは、ATP14に対して低い結合親和性を提供するATeam1.03の変異体の中でも、他のFRETベースのナノセンサに適用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxyglucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L07338</td>
			<td>Non-metabolizable glucose analog</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-IMA-410-019 Argon laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>488 nm wavelength argon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3525.1</td>
			<td>Antioxidant, Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 483/32</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 542/27</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 455 LP</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 505 LPXR</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scannig microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit)</td>
			<td>OriginLab corporation</td>
			<td></td>
			<td>Scientific graphing and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Caelo</td>
			<td>2580-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td>Perfusion chamber for live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394</td>
			<td>With Phenol Red for pH monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator HERAcell &#174; 150 with decontamination routine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAsafe KS/KSP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>26050088</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td>SVI Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.52i</td>
			<td>Wayne Rasban national Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software available in the public domain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP serie peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>High-precisionmulti-channel pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout software, Illustrator CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 16</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software for basic data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture insert</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7278</td>
			<td>Synthetic cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator Polychrome V</td>
			<td>Thermo Scientific/FEI</td>
			<td></td>
			<td>Ultra fast switching monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3 (Sodium Azide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &#8734;/0 WD 2.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Water Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements 4.50 advanced Research</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software. Upgraded version for FRET imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Pro Liquid GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS 6 Version 13.0</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v244</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v307</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WVIEW GEMINI optic system</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Emission Image Splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk

中枢神経系の神経活動(CNS)は、アデノシン三リン酸(ATP)の分解によって提供される細胞エネルギーに対する高い需要を呼び起こす。ニューロンの電気的シグナル伝達によって劣化したプラズマ膜全体にイオン勾配を再設置するには、ATPの大きなシェアが必要です。アストロサイトは、高速電気信号自体を生成しない一方で、神経活動に応答してATPの産生を増加させ、それらにエネルギー代謝産物を提供することによって活性ニューロンをサポートするという証拠があります。異なる代謝産物に対する遺伝子コード化されたセンサーの最近の開発は、ニューロンとアストロサイト間のそのような代謝相互作用の研究を可能にするようになりました。ここでは、アデノ関連ウイルスベクター(AAV)を用いたマウス海馬および皮質の組織海馬および皮質の組織組織スライス培養におけるATP感受性蛍光共鳴エネルギー移転(FRET-)センサATeam1.03YEMKの細胞型特異的発現に関するプロトコルについて説明する。さらに、細胞外カリウムの増加や化学虚血の誘導(すなわち、細胞エネルギー代謝の阻害)に際して、ニューロンやアストロサイトにおける細胞ATPレベルの変化を動的に測定するために、このセンサをどのように用いることができるかを実証する。

AAVベクターは、生体組織16内の細胞において外来遺伝子を選択的に発現させる信頼性の高いツールである。ATeam1.03YEMKのシーケンスカセットと特定のプロモーターを含むAAVの直接適用は、選択されたセルタイプのセンサの高発現をもたらす。DIV 14(転移後〜10日後)において、ヒトシナプスインプロモーターの下でATeamを発現するニューロンは、スライス表面の下に最大50μmの深さで培養組織スライスのネオコルテックスにおいて高密度で発見される(図5A)。海馬で同等の結果を得ることができます (図 5B)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg"> 図5:培養視鏡下組織組織脳スライスにおけるATeam1.03YEMKを発現するニューロンの可視化左側の画像は、海馬組織の70個の光学切片(A)と(B)の43個の光学切片(それぞれ1.05μm)の拡張焦点突起に対応しています。右側のイメージは、同じ投影法のボリューム ビューを表します。セルは、右側のカラー スケールで示されているように、スライス サーフェスに対する深さに応じて色分けされます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
アストロサイトにおけるATPレベルの測定のために、ATeam1.03YEMKはヒトグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーターの制御下で発現される。これにより、培養組織スライスのネオコルテックスと海馬の両方における細胞の効率的な伝達をもたらす(図6)。特に、スライス調製物の表面に対する深さに応じて、2つの異なる形態表現型を区別することができる。第1の表表面層において、細胞は、主に表面に平行に配置された厚い一次プロセスによって特徴付けられる。これらの細胞は強く重なり合うドメインを示し、明らかに反応性のアストロサイトの緻密なメッシュワークを作り出す(図6)。より深い層(表面から30〜60μm)では、形質誘導アストロサイトは、大部分が球状ドメインを形成する微細な細胞プロセスを示し、その形態は、先に報告したように、その上皮のアストロサイトの形態に似ている(図6)。より深層アストロサイトのより良い伝達を得るために、また、これらのより深い層へのより良い光学アクセスを得るために、グリア瘢痕組織は、ステップ4で説明したように除去することができる。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg"> 図6:培養した視鏡組織体細胞におけるATeam1.03YEMKを発現するアストロサイトの可視化左側の画像は、191個の光学セクション(それぞれ0.45μm)の拡張焦点投影に対応しています。説明のために、グリア瘢痕はアストロサイトの投影から除外された。右側の画像は、グリア瘢痕を除去する前後の同じ投影のボリュームビューを表します。セルは、右側のカラー スケールで示されているように、スライス サーフェスに対する深さに応じて色分けされます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ATeam1.03YEMKの発現に成功すると、使用されるプロモーターに応じて、ニューロンまたはアストロサイトにおけるATPレベルの変化を動的に測定することができます(上記参照)。実験は、E-ACSF(95%O 2/5%CO2で気泡化)で絶えず浸透した実験浴中で行った。海馬ニューロンでATeam1.03YEMKを発現する組織学的スライスでは、記録を開始する前に目的の領域(ROI)が選択され、ピラミッド細胞のソマタを表す(図7A)。また、背景減算の領域を選択しました (図 7A)。その後、金星とeCFP蛍光の発光をこれらのROIごとに別々に収集し、時間の経過とともに蛍光発光レベルとして描いた(図7B)。安定したベースラインを確保するために数分間制御条件下で蛍光を記録した後、スライス調製物をグルコースフリー生理食用に曝露することにより細胞代謝を抑制し、これに5mMアジ化ナトリウム(NaN3)を1分間添加した(図7B)。この操作は、FRET対の発光強度(図7B、左パネル)の逆の変化を誘発し、金星(527nm)の減少およびeCFP(475 nm)放出の増加を伴う。金星の蛍光発光をeCFP(F金星/FeCFP)とで割ってFRET比を算出すると、細胞内ATPレベルの相対的な変化を反映するシグナル、いわゆる「ATeam FRET比」(図7B、右パネル)が生じた。全ての記録されたニューロン(N=5スライス中のn=70細胞)において、NaN3はATeam FRET比において可逆的な減少を引き起こし、細胞代謝の阻害時に細胞内ATPレベルの可逆的な低下を示す。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg"> 図7:タイムラプスATeam FRET比イメージングのデモンストレーション(A)左上:培養した組織分海海馬スライスのCA1領域のピラミッド層および層ラジタムの広視野蛍光画像をニューロンでATeam1.03YEMKを発現する。右上: 左側に示すように、ボックス化されたセクションの拡大表示。白い線は、(B)で分析のために選択されたCA1ピラミッドニューロンの細胞体を表す目的領域(ROI)1-3を表す。BG は、バックグラウンド補正用に選択された ROI を表します。下: 金星(緑)、eCFP(紫色)および金星/eCFPの比率の蛍光発光を表す擬似色画像。(B) ROI 1-3 でのタイムラプス記録は、神経細胞体を表す(Aを参照)。左側の痕跡は、金星(緑)とeCFP(マゼンタ)の正規化された蛍光発光を示す。右側のトレースは、対応する ATeam FRET 比を示しています。なお、細胞外グルコースが1分間存在しない場合に5mMNaN3を用いた灌流(灰色バー)は、ATeam FRET比の可逆的な減少を誘発し、細胞内ATP濃度の低下を示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
長期的な実験条件下での調製物およびセンサの安定性を確保するために、ニューロンまたはアストロサイトでATeamを発現するスライスは、常にACSFと長期間にわたって融合された(>50分;n=12細胞、3つの脳から3つのOTC)。このような状況では、ATeam FRET比は変わりません(図8)。代謝阻害剤を含むCIS(「化学的虚血」、「表1参照」)に調製物を曝露すると、対照的に、再び上記で観察したようにATeam FRET比の期待される低下をもたらした。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg"> 図 8: ATeam を用いたベースライン実験ニューロン(上)およびアストロサイト(下)のベースライン条件下で14種類の細胞における長期ATeam FRET比イメージング。データは、他の実験データと同等の条件下で採取した。各測定の終わりに、化学的虚血は、矢印で示されるCISとの灌流によって引き起こされた。注: ベースライン ATeam FRET 比は、ベースライン条件下で時間の経過と同じ時間の経過と同じ安定性に基づく安定しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
次に、ATeam1.03YEMKを発現するニューロンおよびアストロサイトの応答を、細胞外カリウム濃度の上昇に分析した。安定したベースラインを確立した後、ニューロンを3分間3mMから8mMに増加させた生理積糸を用いた(図9A)。ただし、この操作では、ATeam FRET 比 (N = 5 スライスの 56 セル) が検出可能な変化を起こさなかった。センサーがATPレベルの変化に反応することを確実にするために、スライスは再びCISによってE-ACSFを置き換えることによって引き起こされる化学虚血の持続期間にさらされた。化学的虚血は、ATeam FRET比が新しい安定したレベルに急激に低下し、2~3分後のATPの名義枯渇を示す(図9A)。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg"> 図9:ニューロンおよびアストロサイトにおけるATPレベルの変化を示す代表的な実験。(A,B): 左の画像は、組織分スライスの海馬CA1領域に位置するニューロンおよびアストロサイトからのATeam蛍光を示す。右側のトレースは、単一のセル本体上に配置された ROI から得られた ATeam FRET 比のタイムラプス記録を表します。両方の実験において、スライスはまず細胞外カリウム濃度の3分間の増加を行い(barを参照)、続いて化学的虚血への最終的な暴露を行った。なお、ニューロンは細胞外カリウム(A)の上昇に反応しないが、アストロサイトはATP(B)の増加と反応する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ATeam1.03YEMKをアストロサイトで発現させたスライスでも同じ実験プロトコルを行った。ニューロンで観察されたものとは対照的に、ATeam FRET比の可逆的な増加による細胞外カリウムの増加に反応したアストロサイトは、細胞内ATPレベル(N=5スライス中のn=70細胞)の増加を示す(図9B)。その後の化学的虚血への曝露は、予想通り、ATeam FRET比の大きな低下において、細胞内ATPの名目枯渇を示す(図9B)。

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Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

マウス前脳の組織図スライス培養における遺伝的にコードされたFRETベースのセンサATeam1.03YEMKの細胞型特異的発現に関するプロトコルについて説明する。さらに、ニューロンおよびアストロサイトにおける細胞ATPレベルの動的イメージングにこのセンサを使用する方法を示す。

FRETベースのセンサATeam1.03YEMKを用いたマウス脳の組織組織スライスにおける細胞内ATPのイメージング

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

ここでは、有機的に培養されたマウス海馬スライスにおけるニューロンおよび星状ATPレベルの変化の動的測定にATP感受性FRETセンサーATeam 1.03 YEMKを採用する方法を示します。この技術の主な利点は、制御された環境、高いセンサー発現レベルを持つ環境で生きている脳組織のエネルギー代謝を研究できることです。この技術は、例えば虚血性脳卒中のようなエネルギー欠乏によって引き起こされる病態機構、基礎疾患、または脳損傷に関する洞察を得るのを助けるかもしれない。それは、原則として、脳組織だけでなく、他の器官でもATPレベルを研究するために使用することができる。この実験を成功させるためには、組織の培養に関わるすべてのステップを非常に慎重に行い、無菌性を維持することが不可欠です。また、細胞蛍光イメージングに関する知識も必要とされている。最も洗練されたアプローチと可視化における組織の取り扱いは、適切な手順を理解するために不可欠です。イメージング実験についても同様です。この手順のデモンストレーションは、ポスドクのロドリゴ・レルチュンディと、研究室の修士課程の学生であるNa Huangです。ACSFで満たされた氷冷ペトリ皿に、フィルター膜の上に脳を置きます。半球を分離し、45度の角度でパラサジタルカットを行います。スーパーグルーでビブラードーム組織の段階で1つの半球を固定し、すぐに5%の二酸化炭素と95%の酸素で泡立つ氷冷ACSFを含むビブラートメ浴に組織ブロックを移します。ビブラートメ浴中の組織を揃えます。スライスするまで氷冷ACSFで2番目の半球を保ちます。ビブラートを調整して、250~400マイクロメートルでスライスをカットします。スライスを切断した後、その典型的な形態学的外観に基づいて海馬の形成を識別し、海馬に隣接する大脳皮質の一部を維持し、皮下注射針を使用してそれを分離する。スライスをACSFのメッシュ上に置き、摂氏34度に温め、すべてのスライスが収集されるまで5%の二酸化炭素と95%の酸素で泡立てます。スライスを積層フローキャビネットに移し、滅菌条件下で継続します。逆変、無菌、ガラスパスツールピペットで、ACSFから滅菌ハンクス塩溶液で満たされた事前に温めたペトリ皿の1つにスライスをそっと移します。ピペットを交換し、スライスを2番目の文化皿に移します。全体の 5 回のプロセスを繰り返します。できるだけ少ないHBSSを次の培養プレートに移します。ピペットを使用して、培養インサートの上に一度に1つのスライスをそっと置きます。ピペットの乱気流を避け、スライスがパスツールピペットの先端まで下降するまで待ちます。スライスごとにこのプロセスを繰り返します。膜に2つのスライスを置きます。慎重に細かい先端を使用して、挿入物の上部から余分なハンク溶液を除去します。実験の日まで、培養物を加湿したインキュベーターの5%の二酸化炭素と摂氏37度に保ちます。2~3日ごとに培地を交換してください。組織に触れることなく、希釈したベクターの0.5マイクロリットルを各スライスの上部に直接塗布します。最後に、スライスをインキュベーターに戻し、少なくともあと6日間そこに維持します。実験を開始する直前に、培養スライスを含むインサートを無菌フードに移し、1ミリリットルのorganotypicスライス培養培地、または最小限の必須培地を含む30ミリメートル皿に入れます。皿をステレオスコープの下に置き、スライスの表面に焦点を合わせます。2本の無菌皮下皮注射針を使用して、選択したスライスの狭い端に、下の組織を損傷することなく上層で短いクロスカットを行います。挿入物から準備されたスライスを取り除くために、ピンセットで膜の端を保持し、無菌メスを使用して膜にまっすぐ平行にカットし、中央にスライスを持つ正方形または三角形を形成します。挿入物が追加のスライスをホストする場合は、元のプレートに戻してインキュベーターに移します。媒体の表面張力は、膜の表面への漏れを防ぎます。実験的ACSFを準備し、少なくとも30分間カルボーゲン供給に接続された挿入チューブを通して95%の酸素および5%の二酸化炭素でそれをバブリングすることによって7.4のpHを得る。実験全体で生理しまいがちな状態に保ちます。次に、モノクロームの蛍光光源をオンにします。実験室に、オルガノティピックスライス培養を移します。フレームを下にして、培養物に触れることなく、糸を上げて膜に触れた状態で、組織のスライス培養の上にグリッドを置きます。チャンバーを顕微鏡ステージに置き、輸液システムに接続します。毎分1.5〜2.5ミリリットルの流量で蠕動ポンプのスイッチを入れます。灌流システムの漏れがないことを確認してください。透過光を使用して、培養したスライスを焦点にし、実験を行う領域を特定します。イメージング実験を開始する前に、スライスが生理食前の状態に適応するまで少なくとも15分待ってから、カメラとイメージングソフトウェアのスイッチを入れます。435ナノメートルでドナー蛍光タンパク質を励起します。露出時間を 40 ~ 90 ミリ秒に設定します。次に、二色性ミラーとフィルターをビームスプリッターユニットに挿入します。500ナノメートルの蛍光発光を発光画像スプリッタで分割し、バンドパスフィルタを482プラスマイナス16と542プラスマイナス13.5ナノメートルで使用して、ドナーとアクセプター蛍光をさらに分離します。背景減算のために細胞蛍光を欠いていると思われる関心のある領域を選択する。画面の画像にラベル付き組織の単一の構造を丸で囲み、ROIを作成します。画像取得の頻度と全体の記録時間を設定します。30分以上の実験では、光毒性を防ぐために0.2〜0.5ヘルツの取得頻度が推奨されます。続いて、記録を開始します。細胞内ATPの変化を誘導するために、灌流管を標準ACSFから代謝阻害剤を含む生理食物、例えば化学虚血溶液に切り替える。あるいは、活性ニューロンからのカリウムイオンの放出を模倣するために、8ミリモルでカリウム濃度が上昇した生理食動物を使用する。録音の直後に、実験 ACSF をヒープバッファリング ACSF と交換します。次に、スライス培養を含む記録室を共焦点レーザースキャン顕微鏡に移す。与えられた光学構成で可能な限り最高のZ解像度でZスタックイメージを取る。このプロトコルでは、トランスダクションの10日後に、ATeam 1.03 YEMKを発現するニューロンは、スライス表面下50マイクロメートルまでの深さで培養組織スライスの新皮質で高密度で発見された。海馬で同等の結果が得られた。アストロサイトの場合、ATeam 1.03 YEMKはヒトグリア線維性酸性タンパク質プロモーターの制御下で発現し、選択された海馬ニューロンでATeam 1.03 YEMKを発現するorganotypicスライスは、ピラミッド型細胞のソマタを表す。1分間の細胞外グルコースがない場合にスライスをアジジドナトリウム5ミリモルに曝露した後、FRET対の発光強度に反対の変化が誘発された。ATeam FRET比の可逆的な減少も観察された。ニューロンおよびアストロサイトのベースライン条件下での14種類の細胞における長期ATeam FRET比は、ATeamが信頼性が高く安定したセンサであることを示しています。化学虚血は、この実験の最後に両方の細胞タイプのATeam比の予想される強い低下をもたらしたことに注意してください。細胞外カリウム濃度が3分から8ミリモルに増加しても、ATeam 1.03 YEMKを発現するニューロンに検出可能な変化は生じなかった。これに対し、アストロサイトはATeam FRET比の可逆的増加により細胞外カリウムの増加に反応し、細胞内ATPレベルの増加を示した。また、化学虚血により、ATeam比が即座に低下し、センサーがATPの変化を検出できることを実証しました。ここで説明するように FRET ベースの細胞イメージングを試みる場合、organotypic 培養で高品質のスライスを生成することが重要なステップであることを覚えておいてください。また、グリアの傷跡やエキスパートレベルのイメージングを注意深く除去する必要があります。この手順に従って、細胞代謝産物に対する異なる他のFRETベースのナノセンサーを組み込んだ実験も行うことができるべきである。例えば、グルコースまたは乳酸塩用のもの。最後に、動物の保護のための関連する行為は常に観察されなければならないことを強調する必要があります。これは、遺伝子組み換え生物の取り扱いを支配する有効な法律にも当てはまります。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...