Name: imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Claudia Rodrigo og Simone Durry for ekspert teknisk assistanse. Vi takker Dr. Niklas J. Gerkau og M.Sc. Joel Nelson for assistanse i utarbeidelsen av organotypic skive kulturer. Forskning i forfatterens laboratorium ble finansiert av den tyske Research Association (DFG; FOR 2795: ro 2327/13-1 og SPP 1757: ro 2327/8-2 til CRR; og SPP 1757: Young Glia oppstart midler til RL).

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser. Forfatterne fikk økonomisk støtte muliggjør åpen tilgang publikasjon av Nikon mikroskop Solutions, Düsseldorf, Tyskland, som produserer instrumenter som brukes i videoen artikkelen. Selskapet var hverken involvert i utformingen av eksperimentene som ble presentert her, heller ikke i utførelsen, heller ikke i data håndteringen, heller ikke i manuskriptet som skrev.

Her viser vi en prosedyre for celle-type spesifikke uttrykk for ATeam 1.03YEMK, et bånd-basert, genetisk kodet nanosensor14, for måling av endringer i ATP nivåer i astrocytter eller neurons i organotypic vev skive kulturer av musen hjernen15. I eksemplarisk innspillinger, viser vi at en økning i den ekstracellulære kalium konsentrasjonen ikke resulterer i en endring i ATP konsentrasjoner i neurons, mens astrocytic ATP nivåer stiger som svar på denne manipulasjon. Videre våre resultater viser at ved hemming av cellulære metabolisme, ATeam 1.03YEMK bånd ratio raskt synker i begge celletyper, noe som indikerer en rask nedgang i intracellulære ATP.
Uttrykk for ATeam 1.03YEMK i organotypic skive kulturer krever vedlikehold av vevet i kulturen under kontrollerte forhold i minst 7-10 dager. Alternativt kan Ateam 1.03YEMK også være ansatt for måling av ATP i akutt isolert hjernevev skiver og i optiske nerver av mus13,15. Målinger i akutt isolert vev, men nødvendig generering av transgene dyr eller en stereotactic anvendelse av viral vektorer i hjernen, som involverer dyr eksperimentering og strenge dyr omsorg protokoller. I denne forbindelse Ateam 1.03YEMK uttrykk i organotypic vev skive kulturer representerer en nyttig og verdifullt alternativ22,23. I mange år nå, organotypic tissue skive kulturer tjene som en etablert modell system for å studere neural egenskaper, tilkobling og utvikling24,25,26. De ikke bare opprettholde den generelle vev arkitektur og laminering (figur 1), men også vert for fortrinnsrett egenskaper cellekulturer som overlegen tilgjengelighet og direkte kontroll av eksperimentelle forhold. Organotypic vev skive kulturer er også rutinemessig ansatt for å uttrykke utenlandske gener ved hjelp av viral vektorer27. Flere typer viral vektorer har blitt rapportert å levere transgenes i hjernevevet16,28. Adenoviral vektorer induserer høye uttrykk i gliacellene celler, men ikke hippocampus neurons16, og kan generere gliacellene reaktivitet17. Adeno-assosiert viral vektorer som brukes her fremstå som et godt alternativ15, og deres effektivitet har også vært vist i vivo29.
Mens hovedsakelig brukes til studiet av neuronal egenskaper, nyere studier har fastslått at organotypic vev skive kulturer kan også være ansatt for analyse av astrocytter. Kultivert skiver er vanligvis dekket av et lag av reaktive astrocytter19,30 (figur 5), men astrocytter viser en mer innfødt, ikke-reaktiv morfologi og cytoarchitecture i dypere lag19,30 (figur 5). I denne studien beskriver vi en prosedyre for mekanisk fjerning av ytre gliacellene arr, som resulterer i en bedre eksperimentell og optisk tilgjengelighet av innfødte astrocytter innenfor de riktige organotypic vevs lag. Videre, dens fjerning forbedrer uttrykket effekt i dypere lag av organotypic skiver; Hvis gliacellene arr ikke er fjernet, Transduction av AAVs kan tendens til å være begrenset til overfladiske celle lag.
Flere eksterne mekaniske faktorer må vurderes når du utfører eksperimenter i vev skiver. En variasjon i Bad-hastighet kan indusere bevegelser av hele preparatet og/eller indusere endringer i fokus, noe som resulterer i kunstige forbigående endringer av sensorsignalet. Videre har både astrocytter og neurons blitt rapportert å reagere på mekaniske deformasjon som pålagt av høye takst32,33. I våre hender, ved hjelp av en pålitelig peristaltisk pumpe, sammen med å opprettholde små og stabile volumer av saltvann mellom vevet og målet (menisk) resulterer i et stabilt bånd-signal under Baseline forhold ved bruk av bruk her (1.5-2.5 mL/min; Figur 8).
I denne studien viser vi også at båndbasert avbildning med ATeam 1.03YEMK kan benyttes til å overvåke ATP-nivåer i neurons og astrocytter. En alternativ betyr innført tidligere for måling av Cellular ATP er den såkalte luciferin-luciferase analysen34,35,36,37. Denne tilnærmingen er imidlertid basert på Imaging av bioluminesens og gir bare en ganske lav Temporal og romlig oppløsning delvis på grunn av høy bakgrunnsstøy nivåer. En annen metode rutinemessig ansatt de siste årene var Imaging av endringer i intracellulære magnesium konsentrasjon ved hjelp av ion-sensitive fluoroforen magnesium grønn38,39,40. Denne tilnærmingen er knyttet til observasjon at et forbruk av ATP resulterer i utgivelsen av co-faktor magnesium. Bildebehandling med magnesium grønn gir dermed bare et sekundært estimat av endringer i ATP-nivåer. Videre er magnesium grønn også følsom for endringer i intracellulære kalsium, innføre en annen vanskelighet når tolke resultater oppnådd med denne metoden.
Den nylige utviklingen av genetisk-kodet nanosensors for direkte bildebehandling av cellulære metabolitter, derfor representerte et stort skritt fremover11,12. Flere forskjellige sensorer ble generert som kan benyttes for måling av intracellulære ATP36,41,42,43. Blant dem er de ratiometrisk fluorescerende ATP indikatoren "QUEEN"41 samt PercevalHR, som sanser ATP: ADP ratio42. Mens sistnevnte sonde er et verdifullt verktøy for studiet av energi status av celler, krever det samtidig måling av endringer i pH42.
ATeam er en nanosensor hvorav det finnes flere varianter, som – blant annet – er forskjellige i deres bindings affinitet for ATP14. In vitro, ATeam 1.03YEMK utstillinger en Kd på 1,2 mm ved 37 ° c, som er nær mobilnettet ATP nivåer bestemmes i ulike neuronal celletyper, alt fra hypothalamus og lillehjernen34 tilhippocampus 37,44,45. Ved Cuvette målinger resulterte senke temperaturen med 10 ° c i en signifikant reduksjon i bindings affinitet til ATeam 1.03YEMK til ATP, noe som tyder på at det kanskje ikke er ideelt for cellulær bildebehandling ved romtemperatur14. Våre tidligere studie15, men viste at atferden og responsen av Ateam 1.03YEMK uttrykt i neurons og astrocytter til ulike manipulasjoner ligner på nær fysiologiske og ved romtemperatur, noe som indikerer at sensoren gir pålitelig bestemmelse av intracellulære ATP nivåer under begge forhold. I tillegg adressert våre tidligere eksperimenter pH-følsomheten til ATeam 1.03YEMK uttrykt i cellene15, viser at det er ufølsom for endringer i intracellulære pH med om lag 0,1-0,2 pH-enheter. Hvis Kd i den lave mm-serien er en bekymring, kan alternative ATeam-varianter brukes14, blant dem rød-forskjøvet varianter av ATeam ("Go-ATeam")43.
Våre eksperimenter bruker ATeam 1.03YEMK demonstrere at en økning i ekstracellulære kalium konsentrasjon av noen få mm bare (fra 3 til 8 mm) resulterer i en forbigående økning i Ateam 1.03YEMK ratio i astrocytter i organotypic Slice kultur. Denne observasjonen bekrefter tidligere studier15,46 og tydelig indikerer at astrocytter svare på utgivelsen av kalium av aktive neurons med en økning i deres ATP produksjon, mest sannsynlig som en konsekvens av en stimulering av na+/K+-ATPase og na+/HCO3- cotransporter, henholdsvis47,48. I motsetning til dette, nevroner ikke viser et svar, som er i tråd med tidligere arbeid så vel15. Begge celle typene reagerte imidlertid raskt og sterkt på hemming av cellulær Glykolysen og mitokondrie åndedrett som vist før15. Under forhold av kjemiske iskemi, ATeam bånd prosenter falt til et nytt stabilt nivå, noe som indikerer en nominell nedbryting av mobilnettet ATP. Sistnevnte resultat antyder at både neurons samt astrocytter viser et relevant forbruk av ATP også under steady-state forhold uten ekstra stimulering av Synaptic aktivering eller anvendelse av nevrotransmittere. Til sammen konkluderer vi med at båndbasert avbildning med genetisk kodet nanosensors, blant dem ATeam 1.03YEMK, vil gi en verdifull tilnærming for å belyse de cellulære prosessene som er ansvarlige for endringer i intracellulære ATP-nivåer og cellulær ATP-forbruk under ulike forhold.

Eksitatoriske elektriske aktivitet av neurons er i stor grad basert på Flux av spesifikasjoner som natrium (na+) og kalium (K+) på tvers av deres plasma membraner. Vedlikehold av elektrokjemiske graderinger av disse to ioner er dermed nødvendig for signalering. Dette oppnås ved mobilnettet na+/K+-ATPase (NKA), en overalt uttrykt electrogenic transmembrane pumpe, som spyr 3 na+ ut av cellen i bytte for 2 K+ fra ekstracellulære plass, som krever inntak av ett molekyl ATP per transport syklus1. I tillegg til NKA, er det flere andre ATP-forbruker ion transportører inkludert plasma membranen ca2 +-ATPase, som er avgjørende for intracellulære ca2 + homeostase og eksport følgende aktivitet-indusert tilstrømningen2. I presynaptiske nerve blemmer, en vacuolar-type H+-ATPase (v-ATPase) skaper Proton gradient nødvendig for signalstoffet opptak i dette rommet3.
Mens aktiviteten av neurons dermed krever en betydelig mengde av ATP4, de ikke viser en betydelig kapasitet for lagring av energi. I stedet synes de å stole på metabolske interaksjoner med nabo astrocytter, de store glykogen butikker i hjernen5. Det har blitt antydet at astrocytic glykogen faktisk spiller en viktig rolle i å støtte neuronal energibehov; og et viktig fenomen i denne foreslåtte Nevro-metabolsk kopling mellom de to celle typene er kapasiteten til astrocytter å øke sin ATP produksjon som svar på neuronal aktivitet6,7,8. Denne hypotesen, kjent som astrocytt melkesyre shuttle (ANLS), er fortsatt under debatt, fordi annet arbeid har gitt bevis for at neurons kan også øke sin egen rate på Glykolysen som svar på stimulering9,10, reflekterer nødvendigheten av videre metoder og tilnærminger for å studere Nevro-glia interaksjon.
Gransking av cellulær energi metabolisme og ATP nivåer i neurons og astrocytter til belyse Nevro-glia metabolske interaksjoner har lenge vært hemmet av mangelen på egnede sonder for påvisning av endringer i metabolitten konsentrasjoner i levende celler i hjernevevet. Det siste tiåret har imidlertid gitt en økning i utviklingen av nye verktøy og nye genetisk kodede lysrør sonder for ulike metabolitter, inkludert sensorer for ATP, melkesyre, pyruvat og andre11,12. Ved hjelp av disse verktøyene, er det nå mulig å direkte adresse spørsmål knyttet til mobilnettet ATP forbruk og endringer i mobilnettet energi nivå på enkelt cellenivå og i en celle-type spesifikk måte i intakt hjernevev13.
I dagens arbeid, beskriver vi en prosedyre for å visualisere cytosolic ATP dynamikk på neurons og astrocytter av kultivert organotypic hjerne skiver. Vi viser hvordan å ansette adeno-assosiert viral vektorer (AAV) for celle-type spesifikke uttrykk for genetisk kodet ATP-nanosensor ATeam 1.03YEMK (14) i neurons og astrocytter av skiver av mus hjernen som kan opprettholdes i celle kulturen i flere uker15. En fremgangsmåte av hvor å fjerne det gliacellene arr det dekker kultivert tissue skive er beskrevet, hvilke gjøre bedre optisk tilgjengeligheten og tenkelig av celler inne det organotypic tissue lag nedenunder. Til slutt viser vi hvordan ATeam 1.03YEMK kan brukes til å utføre bånd-basert avbildning av endringer i mobilnettet ATP nivåer i dette preparatet. Denne metoden verter de store fordelene at det ikke krever kirurgiske hjerne prosedyrer, gir høye nivåer av uttrykk for sensor og celle type spesifisitet i kultivert hjerne skiver, redusere invasiveness eller stress i cellene sammenlignet med andre metoder, som transfeksjoner av electroporation eller Transduction med andre viral vektorer10,16,17. I tillegg kan denne protokollen brukes til andre bånd basert nanosensors, blant dem varianter av ATeam 1.03 som gir lavere bindende affinitet for ATP14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxyglucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L07338</td>
			<td>Non-metabolizable glucose analog</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-IMA-410-019 Argon laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>488 nm wavelength argon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3525.1</td>
			<td>Antioxidant, Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 483/32</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 542/27</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 455 LP</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 505 LPXR</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scannig microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit)</td>
			<td>OriginLab corporation</td>
			<td></td>
			<td>Scientific graphing and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Caelo</td>
			<td>2580-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td>Perfusion chamber for live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394</td>
			<td>With Phenol Red for pH monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator HERAcell &#174; 150 with decontamination routine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAsafe KS/KSP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>26050088</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td>SVI Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.52i</td>
			<td>Wayne Rasban national Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software available in the public domain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP serie peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>High-precisionmulti-channel pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout software, Illustrator CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 16</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software for basic data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture insert</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7278</td>
			<td>Synthetic cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator Polychrome V</td>
			<td>Thermo Scientific/FEI</td>
			<td></td>
			<td>Ultra fast switching monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3 (Sodium Azide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &#8734;/0 WD 2.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Water Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements 4.50 advanced Research</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software. Upgraded version for FRET imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Pro Liquid GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS 6 Version 13.0</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v244</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v307</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WVIEW GEMINI optic system</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Emission Image Splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk

Neuronal aktivitet i sentralnervesystemet (CNS) fremkaller en høy etterspørsel på mobilnettet energi levert av nedbryting av adenosin trifosfat (ATP). En stor andel av ATP er nødvendig for å re-installere ion graderinger på tvers av plasma membraner degradert av elektriske signaler av neurons. Det er bevis for at astrocytter-samtidig ikke generere raske elektriske signaler selv-gjennomgår økt produksjon av ATP som svar på neuronal aktivitet og støtte aktive neurons ved å gi energi metabolitter til dem. Den nylige utviklingen av genetisk kodede sensorer for ulike metabolitter gjør det nå mulig å studere slike metabolske interaksjoner mellom neurons og astrocytter. Her beskriver vi en protokoll for celle-type spesifikke uttrykk for ATP-sensitive fluorescens resonans Energy Transfer-(SLITE-) sensor ATeam 1.03YEMK i organotypic vev skive kulturer av musen hippocampus og cortex bruker adeno-assosiert viral VEKTORER (AAV). Videre viser vi hvordan denne sensoren kan benyttes for dynamisk måling av endringer i cellulære ATP nivåer i neurons og astrocytter ved økninger i ekstracellulære kalium og etter induksjon av kjemiske iskemi (dvs. en hemming av cellulær energi metabolisme).

AAV vektorer er et pålitelig verktøy for å selektivt uttrykke utenlandske gener i celler i levende vev16. Direkte anvendelse av AAVs som inneholder sekvens kassetten til ATeam 1.03YEMK og en spesifikk promoter resulterer i et høyt uttrykk for sensoren i den valgte celletypen. På DIV 14 (~ 10 dager etter en Transduction), neurons uttrykker ATeam under den menneskelige synapsin arrangøren er funnet ved høy tetthet i mektig av kultivert vev skiver på dybder på opptil 50 μm under skive overflaten (figur 5a). Sammenlignbare resultater kan oppnås i hippocampus (figur 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg"> Figur 5: visualisering av neurons uttrykke ATeam 1.03YEMK i kultivert parasagittal organotypic hjerne skiver. Bilder til venstre tilsvarer utvidet fokus anslag av 43 optiske seksjoner (1,05 μm hver) av kortikale vev (A) og (B) av 70 optiske seksjoner (0,6 μm hver) av hippocampus vev. Bilder til høyre representerer volum visningen av samme projeksjon. Celler er fargekodet i henhold til dybden i forhold til skive overflaten som angitt av Fargeskalaen til høyre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
For måling av ATP nivåer i astrocytter, ATeam 1.03YEMK uttrykkes under kontroll av den menneskelige gliacellene fibrillary surt PROTEIN (GFAP) promoter. Dette resulterer i effektiv Transduction av celler i både mektig og hippocampus av kultivert vev skiver (figur 6). Spesielt kan to forskjellige morfologiske fenotyper skilles, avhengig av dybden i forhold til overflaten av skive forberedelser. I det første, overfladiske laget, er celler preget av tykke primære prosesser som er hovedsakelig arrangert parallelt med overflaten. Disse cellene viser sterkt overlappende domener, og skaper en tett meshwork av tilsynelatende reaktiv astrocytter (figur 6). I dypere lag (30-60 μm fra overflaten), transduced astrocytter Exhibit fine cellulære prosesser som danner stort sett sfæriske domener og deres morfologi ligner på astrocytter in situ som rapportert tidligere19,20,21 (figur 6). For å få bedre Transduction av dypere-lags astrocytter samt bedre optisk tilgang til disse dypere lag, kan gliacellene arrvev fjernes som beskrevet i trinn 4.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg"> Figur 6: visualisering av astrocytter uttrykker Ateam 1.03YEMK i kultivert parasagittal organotypic hjerne skiver. Bildet til venstre tilsvarer en utvidet fokus projeksjon av 191 optiske seksjoner (0,45 μm hver). For illustrasjon hensikt, det gliacellene arr var utelukket fra det prosjektering av astrocytter. Bilder til høyre representerer volum visningen av samme projeksjon før og etter fjerning av gliacellene arr. Celler er fargekodet i henhold til dybden i forhold til skive overflaten som angitt av fargeskalaer til høyre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Vellykket uttrykk for ATeam 1.03YEMK tillater dynamisk måling av endringer i ATP nivåer i neurons eller astrocytter, avhengig av arrangøren som brukes (se ovenfor). Eksperimenter ble utført i en eksperimentell bad stadig perfusert med E-ACSF (boblet med 95% O2/5% co2). I organotypic skiver uttrykker ATeam 1.03YEMK i hippocampus neurons, regioner av interesse (ROIs) ble valgt før du starter innspillingen, som representerer somata av pyramideformet celler (figur 7A). Videre ble det valgt en region for bakgrunns subtraksjon (figur 7a). Utslipp av Venus samt eCFP fluorescens ble deretter samlet for hver av disse ROIs separat og avbildet som fluorescens utslippsnivå over tid (figur 7B). Etter innspillingen fluorescens under kontroll forhold i flere minutter for å sikre en stabil Baseline, cellulær metabolisme ble hemmet ved å utsette stykket forberedelse til en glukose-fri saltvann, som 5 mM natrium Natriumazid (NaN3) ble lagt i ett minutt (figur 7B). Dette manipulasjon indusert motsatte endringer i utslipps intensiteten av bånd pair (figur 7B, venstre paneler), med en reduksjon av Venus (527 NM) og en økning på eCFP (475 NM) utslipp. Beregning av bånd ratio ved å dele den fluorescens utslipp av Venus av eCFP (FVenus/feCFP) resulterte i signaler som reflekterer de RELATIVE endringene i intracellulære ATP nivåer, den såkalte "ATeam bånd ratio" (figur 7B, høyre panel). I alle innspilte neurons (n = 70 celler i N = 5 skiver), NaN3 forårsaket en reversibel nedgang i ATeam bånd ratio, noe som indikerer en reversibel nedgang i intracellulære ATP nivåer ved hemming av cellulær metabolisme.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg"> Figur 7: demonstrasjon av tid forfalle ATEAM bånd ratio Imaging. (A) øverst til venstre: bred-Field fluorescens bilde av pyramideformet lag og stratum RADIATUM av CA1 regionen av en kultivert organotypic hippocampus skive uttrykker Ateam 1.03YEMK i neurons. Øverst til høyre: forstørret visning av eske delen som angitt til venstre. Hvite linjer avgrense regioner av interesse (ROIs) 1-3 representerer celle organer av CA1 pyramideformet neurons valgt for analyse i (B). BG representerer AVKASTNINGEN valgt for bakgrunnen korreksjon. Bunn: pseudo-fargede bilder som representerer fluorescens utslipp av Venus (grønn), eCFP (lilla) og forholdet mellom Venus/eCFP. (B) tidsforløp innspilling i ROIs 1-3, som representerer neuronal celle organer (se A). Spor på venstre Vis normalisert fluorescens utslipp av Venus (grønn) og eCFP (magenta). Spor til høyre viser tilsvarende ATeam bånd ratio. Merk at blod med 5 mM NaN3 i fravær av ekstracellulære glukose i 1 minutt (grå bar) induserer en reversibel nedgang i ATeam bånd-forholdet, noe som indikerer en reduksjon i intracellulære ATP-konsentrasjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
For å sikre stabiliteten av preparatet og sensoren under langsiktige eksperiment vilkår, skiver uttrykke ATeam i neurons eller astrocytter ble stadig perfusert med ACSF for lengre perioder (> 50 min; n = 12 celler hver, N = 3 OTCs fra 3 hjerner). Under disse forholdene, ATeam bånd forholdet endret ikke (Figur 8). Utsette forberedelsene til CIS inneholder metabolske hemmere ("kjemisk iskemi", se tabell 1), i kontrast, igjen resulterte i forventet fall i ATeam bånd ratio som observert ovenfor.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg"> Figur 8: planlagte eksperimenter som sysselsetter ATeam. Langsiktig ATeam bånd ratio Imaging i 14 forskjellige celler under Baseline forhold i neurons (topp) og astrocytter (nederst). Data ble tatt under sammenlignbare forhold som andre eksperimentelle data. På slutten av hver måling, kjemisk iskemi ble elicited ved å være med CIS som indikert av pilen. Merk: Baseline ATeam bånd prosenter er stabile over tid under Baseline forhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Deretter analyserte vi responsen av neurons og astrocytter uttrykker ATeam 1.03YEMK til en økning i ekstracellulære kalium konsentrasjon. Etter å etablere en stabil Baseline, neurons ble perfusert med en saltvann der kalium konsentrasjonen ble økt fra 3 til 8 mM i 3 minutter (figur 9a). Dette manipulasjon gjorde imidlertid ikke resultere i en synlig endring i ATeam bånd ratio (n = 56 celler i N = 5 skiver). For å sikre at sensoren reagerte på en endring i ATP nivåer, ble skiver deretter igjen utsatt for en vedvarende periode av kjemiske iskemi elicited ved å erstatte E-ACSF av CIS. Kjemisk iskemi resulterte i en rask nedgang i ATeam bånd ratio til et nytt, stabilt nivå, indikerer nominell nedbryting av ATP etter 2-3 min (figur 9a).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg"> Figur 9: representative eksperimenter som illustrerer endringer i ATP-nivåer i neurons og astrocytter. (A,B): bilder på venstre Vis ATeam fluorescens fra neurons og ASTROCYTTER ligger i hippocampus CA1 regionen organotypic skiver. Spor på høyre representerer tidsforløp innspillinger av ATeam bånd ratio innhentet fra en ROI plassert over en enkelt celle kroppen. I begge eksperimenter ble skiver først utsatt for en økning i ekstracellulære kalium konsentrasjon i 3 minutter (se bar), etterfulgt av en endelig eksponering for kjemiske iskemi. Merk at mens neurons ikke reagerer på høyden av ekstracellulære kalium (A), astrocytter reagere med en økning i ATP (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Den samme eksperimentelle protokollen ble utført med skiver, der ATeam 1.03YEMK ble uttrykt i astrocytter. I motsetning til det som ble observert i neurons, astrocytter reagerte på økningen i ekstracellulære kalium ved en reversibel økning i ATeam bånd ratio, noe som indikerer en økning i intracellulære ATP nivåer (n = 70 celler i N = 5 skiver) (figur 9B). Påfølgende eksponering for kjemiske iskemi resulterte, som forventet, i et stort fall i ATeam bånd ratio, indikasjon på nominell reduksjon av intracellulære ATP (figur 9B).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Vi beskriver en protokoll for celle-type spesifikke uttrykk for genetisk kodet bånd-basert sensor ATeam 1.03YEMK in organotypic skive kulturer av musen forebrain. Videre viser vi hvordan du bruker denne sensoren for dynamisk bildebehandling av mobilnettet ATP nivåer i neurons og astrocytter.

Imaging av intracellulære ATP i Organotypic tissue skiver av Mouse Brain ved hjelp av bånd-basert sensor ATeam 1.03YEMK

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Her demonstrerer vi hvordan du bruker DEN ATP-sensitive FRET-sensoren ATeam 1.03 YEMK for dynamiske målinger av endringer i nevronale og astrocytiske ATP-nivåer i organotypisk kultiverte museflodcampale skiver. Den største fordelen med denne teknikken er at man kan studere energimetabolisme i levende hjernevev i en kontrollert setting, et miljø med høye sensoruttrykksnivåer. Denne teknikken kan bidra til å få innsikt i pathomechanisms, underliggende sykdommer, eller hjerneskade, for eksempel forårsaket av energimangel, som iskemisk hjerneslag.Det kan i prinsippet brukes til å studere ATP-nivåer, ikke bare i hjernevev, men også i andre organer. For å kunne kjøre dette eksperimentet, er det viktig å utføre alle trinnene som er involvert i å kultere vevet ekstremt forsiktig og for å opprettholde sterilitet. Videre er det nødvendig med litt kunnskap om cellulær fluorescerende bildebehandling.Vevshåndtering i mest sofistikert tilnærming og en visualisering er viktig for å forstå de riktige prosedyrene. Det samme gjelder for bildeeksperimenter. Demonstrere prosedyren vil være Rodrigo Lerchundi, en postdoc, og Na Huang, en Master student fra laboratoriet.I en iskald petriskål fylt med ACSF, legg hjernen på en filtermembran. Skill halvkulene og utfør et parasagittalt kutt i en vinkel på 45 grader. Fest en halvkule på Vibratome vev stadium med superlim, og umiddelbart overføre vevsblokken til Vibratome bad som inneholder iskalde ACSF bobler med 5% karbondioksid og 95% oksygen.Juster vevet i Vibratome-badet. Hold den andre halvkule i iskald ACSF til kutting. Juster Vibratomen for å kutte skiver på 250 til 400 mikrometer.Etter å ha kuttet skiven, identifiser hippocampalformasjonen basert på det typiske morfologiske utseendet og isolere det ved hjelp av hypodermiske nåler, og hold den delen av hjernebarken ved siden av hippocampus. Legg skiven på et nett i ACSF, varmet opp til 34 grader Celsius og bobler med 5% karbondioksid og 95% oksygen til alle skivene samles inn. Overfør skivene til laminærstrømningskabinettet for å fortsette under sterile forhold.Med en invertert, steril, glass Pasteur pipette, forsiktig overføre skiver fra ACSF til en av de forvarmede Petri retter fylt med sterile Hanks'salt løsning. Bytt pipetten og overfør skivene til den andre kulturretten. Gjenta prosessen fem ganger totalt.Overfør så lite HBSS som mulig til følgende kulturplater. Bruk en pipette til å forsiktig plassere en skive om gangen på toppen av kulturinnsatsen. Unngå turbulenser i pipetten, og vent til skiven går ned til spissen av Pasteur pipetten.Gjenta prosessen for hver sektor. Legg to skiver på en membran. Fjern forsiktig overflødig Hank-løsning fra toppen av innsatsen ved hjelp av en fin spiss.Hold kulturene i en fuktet inkubator ved 5% karbondioksid og 37 grader Celsius til dagen for eksperimentet. Bytt medium hver to til tre dager. Uten å berøre vevet, bruk 0,5 mikroliter av den fortynnede vektoren direkte til toppen av hver skive.Til slutt plasserer skivene tilbake i inkubatoren og vedlikeholder dem der i minst seks dager til. Like før du starter et eksperiment, overfør en innsats som inneholder kultiverte skiver i den sterile hetten, og legg den i en 30 millimeter tallerken som inneholder en milliliter organotypisk skivekulturmedium, eller minimalt viktig medium. Plasser parabolen under stereoskopet og fokuser på overflaten av skiven.Bruk to sterile hypodermiske nåler for å lage en kort krysssnitt rett på de smale kantene av en valgt skive, og i det øvre laget uten å skade vevet under. For å fjerne den tilberedte skiven fra innsatsen, hold kantene på membranen med pinsett og bruk en steril skalpell for å lage rette, parallelle kutt til membranen, danner en firkant eller en trekant med skiven i midten. Hvis innsatsen er vert for flere skiver, overfører du den tilbake til den opprinnelige platen og inn i inkubatoren.Overflatespenningen i mediet vil forhindre lekkasje på membranens overflate. Forbered eksperimentell ACSF og få en pH på 7,4 ved å boble den med 95% oksygen og 5% karbondioksid gjennom en innsatt slange koblet til karbagenforsyningen i minst tretti minutter. Hold saltvannet bobler under hele eksperimentet.Slå deretter på den fluorescerende lyskilden til monokroometeret. Overfør den organotypiske skivekulturen inn i det eksperimentelle kammeret. Plasser et rutenett på toppen av den organotypiske skivekulturen med rammen ned, ikke berøre kulturen, og trådene opp, berøre membranen.Plasser kammeret på mikroskopstadiet og koble det til perfusjonssystemet. Slå på den peristaltiske pumpen med en strømningshastighet på 1,5 til 2,5 milliliter per minutt. Kontroller at det ikke lekker opp perfusjonssystemet.Bruk overføringslys, ta den kultiverte skiven i fokus og identifiser området der eksperimenter skal utføres. Før du starter bildeeksperimenter, må du vente i minst 15 minutter for å la skiver tilpasse seg saltvannsforholdene, og slå deretter på kameraet og bildeprogramvaren. Opphisse donor fluorescerende protein på 435 nanometer.Sett eksponeringstiden til mellom 40 og 90 millisekunder. Sett deretter det diktomiske speilet og filtrene inn i strålesplitterenheten. Del fluorescensutslippet på 500 nanometer med en utslippsbildesplitter, og bruk båndpassfiltre på 482 pluss eller minus 16 og 542 pluss eller minus 13,5 nanometer for å isolere donor og akseptorfluorescens.Velg en interesseregion tilsynelatende blottet for cellulær fluorescens for subtraksjon i bakgrunnen. Sirkel enkeltstrukturer av merket vev i bildet på skjermen for å lage ROIer. Angi frekvensen for bildeanskaffelse og den totale opptakstiden.For eksperimenter som er lengre enn 30 minutter, anbefales en oppkjøpsfrekvens på 0,2 til 0,5 Hertz for å forhindre fototoksisitet. Deretter starter du opptaket. For å indusere endringer i intracellulær ATP, bytt perfusjonsrøret fra standard ACSF til en saltvannsholdig metabolske hemmere, for eksempel kjemisk iskemiløsning.Alternativt kan du bruke en saltvann med forhøyet kaliumkonsentrasjon på åtte millimolar for å etterligne frigjøring av kaliumion fra aktive nevroner. Rett etter opptakene utveksler du den eksperimentelle ACSF med heaps-bufret ACSF. Deretter overfører du opptakskammeret som inneholder skivekulturen til det konokale laserskanningsmikroskopet.Ta Z-stakkbilder med høyest mulig Z-oppløsning ved den angitte optiske konfigurasjonen. I denne protokollen, ti dager etter en transduksjon, ble nevroner som uttrykker ATeam 1,03 YEMK funnet ved høy tetthet i neocortex av kultiverte vevskiver på dybder på opptil 50 mikrometer under skiveoverflaten. Sammenlignbare resultater ble oppnådd i hippocampus.For astrocytter ble ATeam 1.03 YEMK uttrykt under kontroll av den menneskelige glial fibrolary sure proteinarrangøren, og organotypiske skiver som uttrykker ATeam 1.03 YEMK i hippocampal nevroner utvalgte ROM representerer somata av pyramidale celler. Etter å ha eksponert skiven til 5 millimolar natriumazid i fravær av ekstracellulær glukose i ett minutt, ble motsatte endringer indusert i utslippsintensiteten til FRET-paret. Det ble også observert en reversibel reduksjon i ATeam FRET-forholdet.Langsiktig ATeam FRET-forhold i 14 forskjellige celler under baselineforhold i nevroner og astrocytter viser at ATeam er en pålitelig og stabil sensor. Vær oppmerksom på at kjemisk iskemi resulterte i forventet sterk nedgang i ATeam-forholdet i begge celletyper på slutten av dette eksperimentet. En økning i den ekstracellulære kaliumkonsentrasjonen fra tre til åtte millimolar i tre minutter resulterte ikke i en påviselig endring i nevronene som uttrykte ATeam 1,03 YEMK.Astrocytter reagerte derimot på økningen i ekstracellulær kalium med en reversibel økning i ATeam FRET-forholdet, noe som indikerer en økning i intracellulære ATP-nivåer. Igjen forårsaket kjemisk iskemi en umiddelbar reduksjon i ATeam-forholdet, noe som viste at sensoren kan oppdage endringer i ATP. Når du prøver FRET-basert cellulær bildebehandling som beskrevet her, er det viktig å huske på at produksjon av høykvalitets skiver i organotypiske kulturer er et viktig skritt.Videre er nøye fjerning av glial arr og ekspertnivå bildebehandling nødvendig. Etter denne prosedyren bør man også kunne utføre eksperiment som omfatter forskjellige andre FRET-baserte nanosensor for cellulære metabolitter. For eksempel de for glukose eller laktat.Sist, men ikke minst, må det understrekes at relevante handlinger for beskyttelse av dyr alltid må observeres. Dette gjelder også for de effektive lovene som styrer håndteringen av genmodifiserte organismer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse Imaging av Neuroblast Migrasjon i Akutt Skiver av Adult Mouse forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Sammenkoblede hele cellen Recordings i organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselektiv Biolistic Targeting i organotypic Brain Slices Ved hjelp av en modifisert Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fibers i Mouse Spinal Cord Bruke CLARITY / CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Dyptgående Fysiologisk Analyse av Definerte cellepopulasjoner i Akutt vevssnitt av musen Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging av Migrating Neurons i Organotypic Slice Kultur av Embryonic Mouse Brain Using<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporasjon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Innspillingen synaptiske plastisitet i akutt hippocampus skiver vedlikeholdes i en liten volum resirkulering-, perfusjon og neddykking-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering og Live bildebehandling av Oligodendrocyte Organelles i Organotypic hjernen skiver Adeno-assosiert Virus og AC Confocal mikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

To-fotonet Imaging Microglial prosesser attraksjon mot ATP eller Serotonin i akutt hjernen skiver

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Merking og Imaging av amyloid plaketter i Brain tissue bruke Natural polyphenol curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...