Name: imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Os autores desejam agradecer a Claudia Roderigo e Simone Durry por assistência técnica especializada. Agradecemos ao Dr. Niklas J. Gerkau e ao M.Sc. Joel Nelson pela ajuda na preparação das culturas organotípicas. A pesquisa no laboratório do autor foi financiada pela Associação Alemã de Pesquisa (DFG; PARA 2795: Ro 2327/13-1 e SPP 1757: Ro 2327/8-2 a CRR; e SPP 1757: Financiamento start-up da Glia Young para rl).

Os autores não declaram interesses concorrentes. Os autores receberam apoio financeiro permitindo a publicação de acesso aberto pela Nikon Microscope Solutions, Düsseldorf, Alemanha, que produz instrumentos utilizados no artigo de vídeo. A empresa não estava envolvida na concepção dos experimentos aqui apresentados, nem na execução, nem no manuseio de dados, nem na escrita do manuscrito.

Aqui, demonstramos um procedimento para a expressão específica do tipo célula de ATeam1.03YEMK, um nanosensor14geneticamente codificado por FRET, para medição de alterações nos níveis de ATP em astrocitos ou neurônios em culturas organotípicas de fatia de tecido do cérebro do rato15. Em gravações exemplares, mostramos que um aumento na concentração de potássio extracelular não resulta em uma mudança nas concentrações de ATP nos neurônios, enquanto os níveis ascíticos de ATP aumentam em resposta a essa manipulação. Além disso, nossos resultados demonstram que, após a inibição do metabolismo celular, a relação ATeam1.03YEMK FRET cai rapidamente em ambos os tipos de células, indicando uma rápida diminuição do ATP intracelular.
Expressão de ATeam1.03YEMK em culturas organotípicas da fatia exige a manutenção do tecido na cultura circunstâncias controladas no mínimo 7-10 dias. Alternativamente, ATeam1.03YEMK também pode ser empregado para a medição de ATP em fatias de tecido cerebral agudamente isoladas e em nervos ópticos de camundongos13,15. Medidas em tecido suprido agudamente, no entanto, exigem a geração de animais transgênicos ou uma aplicação estereotática de vetores virais no cérebro, envolvendo experimentação animal e protocolos rigorosos de cuidados com animais. A este respeito, a expressão deYEMK ATeam1.03 em culturas organotípicas da fatia do tecido representa uma alternativa útil e valiosa22,23. Há muitos anos, culturas organotípicas de fatias de tecido servem como um sistema modelo estabelecido para estudar propriedades neurais, conectividade e desenvolvimento24,25,26. Eles não só mantêm a arquitetura geral do tecido e laminação (Figura 1), mas também hospedam as propriedades preferenciais das culturas celulares, como acessibilidade superior e controle direto das condições experimentais. As culturas organotípicas da fatia do tecido são empregadas igualmente rotineiramente para expressar genes extrangeiros usando vetores virais27. Vários tipos de vetores virais foram relatados para entregar transgenes no tecido cerebral16,28. Vetores adenovirais induzir alta expressão em células gliais, mas não neurônios hipocampais16, e pode gerar reatividade glial17. Vetores virais associados ao Adeno, como usados aqui, emergem como uma boa alternativa15,e sua eficácia também foi mostrada in vivo29.
Embora seja usado principalmente para o estudo de propriedades neuronais, estudos recentes estabeleceram que culturas organotípicas de fatia sitipade também podem ser empregadas para a análise de astrócitos. As fatias cultivadas são geralmente cobertas por uma camada de astrócitos reativos19,30 (Figura 5), mas os astrócitos exibem uma morfologia e citoarquitetura mais nativas e não reativas em camadas mais profundas19,30 (Figura 5). No presente estudo, descrevemos um procedimento para a remoção mecânica da cicatriz glial externa, o que resulta em uma melhor acessibilidade experimental e óptica de astrócitos nativos dentro das camadas adequadas do tecido organotypic. Além disso, sua remoção melhora a eficácia da expressão em camadas mais profundas das fatias organotípicas; se a cicatriz glial não for removida, a transdução por AAVs pode tender a ser restrita às camadas celulares superficiais.
Vários fatores mecânicos externos precisam ser considerados ao realizar experimentos em fatias de tecido. Uma variação na velocidade da perfusão do banho pode induzir movimentos da preparação inteira e/ou induzir mudanças no foco, tendo por resultado mudanças transientes artificiais do sinal do sensor. Além disso, tanto os astrócitos quanto os neurônios têm sido relatados para responder à deformação mecânica, como imposta s altas taxas de perfusão32,33. Em nossas mãos, usando uma bomba peristaltic de confiança, junto com a manutenção de volumes pequenos e estáveis de salina entre o tecido e o objetivo (menisco) conduz a um FRET-sinal estável circunstâncias da linha de base na velocidade da perfusão usada aqui (1.5-2.5 mL/min; Figura 8).
No presente estudo, também demonstramos que imagens baseadas em FRET com ATeam1.03YEMK podem ser empregadas para monitorar os níveis de ATP em neurônios e astrócitos. Um meio alternativo introduzido anteriormente para a medição do ATP celular é o chamado ensaio luciferin-lúciferase34,35,36,37. Esta abordagem, no entanto, é baseada em imagens de bioluminescência e fornece apenas uma resolução temporal e espacial bastante baixa, em parte devido aos altos níveis de ruído de fundo. Outro método rotineiramente empregado nos últimos anos foi a imagem de mudanças na concentração intracelular de magnésio usando o verde38,39,40. Essa abordagem diz respeito à observação de que o consumo de ATP resulta na liberação de seu cofator magnésio. A imagem latente com verde do magnésio fornece desse modo somente uma estimativa secundária das mudanças em níveis do ATP. Além disso, o verde magnésio também é sensível às mudanças no cálcio intracelular, introduzindo outra dificuldade na interpretação dos resultados obtidos com este método.
O recente desenvolvimento de nanosensores geneticamente codificados para imagens diretas de metabólitos celulares, portanto, representou um grande passo em frente11,12. Vários sensores diferentes foram gerados que podem ser empregados para medição do ATP intracelular36,41,42,43. Entre eles estão o indicador de ATP fluorescente ratiométrica "QUEEN"41, bem como PercevalHR, que detecta a relação ATP:ADP42. Enquanto a última sonda é uma ferramenta valiosa para o estudo do estado energético das células, requer medição simultânea de alterações no pH42.
ATeam é um nanosensor do qual existem várias variantes, que - entre outras - diferem em sua afinidade vinculativa para atp14. In vitro, ATeam1.03YEMK exibe um Kd de 1.2 mM em 37 °C, que está perto dos níveis de ATP celulares determinados em diferentes tipos de células neuronais, variando de hipotálamo e cerebelo34 a hipocampo37,44,45. Nas medições de cuvette, a redução da temperatura em 10 °C resultou em uma diminuição significativa na afinidade vinculativa de ATeam1.03YEMK para ATP, sugerindo que pode não ser ideal para imagens celulares à temperatura ambiente14. Nosso estudo anterior15, no entanto, demonstrou que o comportamento e a resposta do ATeam1.03YEMK expressos em neurônios e astrócitos a diferentes manipulações é semelhante a quase fisiológico e à temperatura ambiente, indicando que o sensor permite determinação confiável dos níveis intracelulares de ATP em ambas as condições. Além disso, nossos experimentos anteriores abordaram a sensibilidade ao pH do ATeam1.03YEMK expressa dentro das células15,mostrando que é insensível às mudanças no pH intracelular em cerca de 0,1-0,2 unidades pH. Se o Kd na faixa de mM baixo é uma preocupação, variantes alternativas ATeam pode ser usado14,entre eles variantes em mudança vermelha de ATeam ("GO-ATeam")43.
Nossos experimentos usando OYEMK ATeam1.03 demonstram que um aumento na concentração de potássio extracelular em alguns mM apenas (de 3 para 8 mM) resulta em um aumento transitório na relaçãoYEMK ATeam1.03 em astrocitos na cultura de fatia organótípica. Esta observação confirma estudos anteriores15,46 e indica claramente que os astrócitos respondem à liberação de potássio por neurônios ativos com um aumento na sua produção atp, principalmente provável como conseqüência de uma estimulação do Na+/ K+-ATPase e o Na+/ HCO3- cotransportador, respectivamente47,48. Em contraste com isso, os neurônios não mostraram uma resposta, que está em linha com o trabalho anterior também15. Ambos os tipos de células, no entanto, reagiram rapidamente e fortemente à inibição da glicolyse celular e respiração mitocondrial, como mostrado antesde 15. Em condições de isquemia química, as proporções de FRET da ATeam caíram para um novo nível estável, indicando um esgotamento nominal do ATP celular. O último resultado sugere que ambos os neurônios, bem como astrócitos apresentam um consumo relevante de ATP também condições de estado estável, sem estimulação adicional por ativação sináptica ou aplicação de neurotransmissores. Em conjunto, concluímos que a imagem de imagens baseadas em FRET com nanosensores geneticamente codificados, entre eles ATeam1.03YEMK,fornecerá uma abordagem valiosa para elucidar os processos celulares responsáveis por mudanças nos níveis intracelulares de ATP e no consumo de ATP celular em diferentes condições.

A atividade elétrica excitatória dos neurônios é em grande parte baseada no fluxo de cições como sódio (Na+)e potássio (K+)através de suas membranas plasmáticas. A manutenção dos gradientes eletroquímicos destes dois íons é exigida assim para sinalizar. Isso é realizado pela celular Na+/K+-ATPase (NKA), uma bomba de transmembrana eletrogênica onipresentemente expressa, que extrude 3 Na+ fora da célula em troca de 2 K+ do espaço extracelular, exigindo o consumo de uma molécula de ATP por ciclo de transporte1. Além do NKA, existem vários outros transportadores de íons consumidores de ATP, incluindo a membrana plasmática Ca2+-ATPase, que é vital para a homeostase intracelular Ca2+ e sua exportação após o influxo induzido pela atividade2. Nas vesículas pré-sinápticas, um tipo vacuolar H+-ATPase (v-ATPase) cria o gradiente de prótons necessário para a captação de neurotransmissores neste compartimento3.
Enquanto a atividade dos neurônios, portanto, requer uma quantidade substancial de ATP4, eles não exibem uma capacidade significativa para o armazenamento de energia. Em vez disso, eles parecem confiar em interações metabólicas com os astrocitos vizinhos, as principais lojas de glicogênio no cérebro5. Tem sido sugerido que o glicogênio ascítico realmente desempenha um papel importante no apoio às necessidades de energia neuronal; e um fenômeno chave neste acoplamento neuro-metabólico proposto entre os dois tipos de células é a capacidade dos astrócitos para aumentar sua produção de ATP em resposta à atividade neuronal6,7,8. Esta hipótese, conhecida como ônibus de lactato do neurônio astrócito (ANLS), ainda está em debate, porque outros trabalhos forneceram evidências de que os neurônios também podem aumentar sua própria taxa de glicolíse em resposta à estimulação9,10,refletindo a necessidade de outros métodos e abordagens para estudar a interação neuro-glia.
Investigação do metabolismo da energia celular e níveis de ATP em neurônios e astrócitos para elucidar interações metabólicas neuro-glia tem sido dificultada pela falta de sondas adequadas para a detecção de mudanças nas concentrações de metabólitos em células vivas no tecido cerebral. A última década, no entanto, proporcionou um aumento no desenvolvimento de novas ferramentas e novas sondas fluorescentes geneticamente codificadas para diferentes metabólitos, incluindo sensores para ATP, lactato, piruvato e outros11,12. Usando essas ferramentas, agora é possível abordar diretamente questões relacionadas ao consumo de ATP celular e mudanças nos níveis de energia celular no nível de célula única e de forma específica do tipo celular no tecido cerebral intacto13.
No presente trabalho, descrevemos um procedimento para visualizar a dinâmica citossólica atp em neurônios e astrócitos de fatias de cérebro organotypic culturado. Mostramos como empregar vetores virais associados ao adeno (AAV) para expressão específica do tipo célula do atp-nanosensor geneticamente codificado ATeam1.03YEMK (14) em neurônios e astrócitos de fatias de cérebro de rato que podem ser mantidas na cultura celular por várias semanas15. Um procedimento de como remover a cicatriz glial que cobre fatias cultivadas do tecido é descrito, que melhora a acessibilidade ótica e a imagem latente das pilhas nas camadas organotypic do tecido embaixo. Finalmente, mostramos como o ATeam1.03YEMK pode ser usado para realizar imagens baseadas em FRET de alterações nos níveis de ATP celular nesta preparação. Este método hospeda as principais vantagens de que não requer procedimentos cerebrais cirúrgicos, fornece altos níveis de expressão do sensor e especificidade do tipo celular em fatias cerebrais cultivadas, reduzindo a invasividade ou estresse nas células em comparação com outros métodos, como a transfecção por eletroporação ou transdução com outros vetores virais10,16,17. Além disso, este protocolo pode ser aplicado a outros nanosensores baseados em FRET, entre eles variantes do ATeam1.03 que fornecem menor afinidade de ligação para ATP14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxyglucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L07338</td>
			<td>Non-metabolizable glucose analog</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-IMA-410-019 Argon laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>488 nm wavelength argon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3525.1</td>
			<td>Antioxidant, Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 483/32</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 542/27</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 455 LP</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 505 LPXR</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scannig microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit)</td>
			<td>OriginLab corporation</td>
			<td></td>
			<td>Scientific graphing and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Caelo</td>
			<td>2580-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td>Perfusion chamber for live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394</td>
			<td>With Phenol Red for pH monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator HERAcell &#174; 150 with decontamination routine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAsafe KS/KSP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>26050088</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td>SVI Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.52i</td>
			<td>Wayne Rasban national Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software available in the public domain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP serie peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>High-precisionmulti-channel pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout software, Illustrator CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 16</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software for basic data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture insert</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7278</td>
			<td>Synthetic cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator Polychrome V</td>
			<td>Thermo Scientific/FEI</td>
			<td></td>
			<td>Ultra fast switching monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3 (Sodium Azide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &#8734;/0 WD 2.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Water Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements 4.50 advanced Research</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software. Upgraded version for FRET imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Pro Liquid GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS 6 Version 13.0</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v244</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v307</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WVIEW GEMINI optic system</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Emission Image Splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk

A atividade neuronal no sistema nervoso central (SNC) evoca uma alta demanda de energia celular fornecida pela quebra do triposfato de adenosina (ATP). Uma grande parte do ATP é necessária para reinstalar gradientes de íons através de membranas plasmáticas degradadas pela sinalização elétrica dos neurônios. Há evidências de que os astrócitos - embora não gerem sinais elétricos rápidos - passam pelo aumento da produção de ATP em resposta à atividade neuronal e suportam neurônios ativos, fornecendo metabólitos de energia para eles. O recente desenvolvimento de sensores geneticamente codificados para diferentes metabólitos agora permite o estudo de tais interações metabólicas entre neurônios e astrócitos. Aqui, descrevemos um protocolo para a expressão específica do tipo celular do sensor De setores de ressonância de ressonância (FRET-) aTeam1.03YEMK em culturas organotípicas de fatia de tecido do hipocampo e córtex do mouse usando vetores virais associados ao adeno (AAV). Além disso, demonstramos como este sensor pode ser empregado para a medição dinâmica das mudanças nos níveis de ATP celular em neurônios e astrócitos após aumentos no potássio extracelular e após a indução da isquemia química (ou seja, uma inibição do metabolismo energético celular).

Os vetores de AAV são uma ferramenta confiável para expressar seletivamente genes estranhos em células dentro do tecido vivo16. A aplicação direta de AAVs contendo a fita de seqüência de ATeam1.03YEMK e um promotor específico resulta em uma alta expressão do sensor no tipo de célula escolhida. Na DIV 14 (~10 dias após uma transdução), os neurônios que expressam ATeam o promotor de sinapse humana são encontrados em alta densidade no neocórtex de fatias de tecido cultivado em profundidades de até 50 μm abaixo da superfície da fatia (Figura 5A). Resultados comparáveis podem ser alcançados no hipocampo(Figura 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg"> Figura 5: Visualização de neurônios expressando ATeam1.03YEMK em fatias de cérebro organotipatoorganolípicas parasagitais cultivadas. As imagens à esquerda correspondem a projeções de foco estendida de 43 seções ópticas (1,05 μm cada) de tecido cortical(A)e (B)de 70 seções ópticas (0,6 μm cada) de tecido hipocampal. As imagens à direita representam a visão de volume da mesma projeção. As células são codificadas por cores de acordo com sua profundidade em relação à superfície da fatia, como indicado pela escala de cor à direita. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
Para a medição dos níveis de ATP em astrócitos, O ATeam1.03YEMK é expresso o controle do promotor de proteína cibrilar ácida glial humana (GFAP). Isso resulta em transdução eficiente de células tanto no neocórtex quanto no hipocampo de fatias de tecido cultivado (Figura 6). Notavelmente, dois fenótipos morfológicos diferentes podem ser distinguidos, dependendo da profundidade em relação à superfície dos preparativos de fatias. Na primeira camada superficial, as células são caracterizadas por processos primários espessos que são predominantemente dispostos em paralelo à superfície. Essas células exibem domínios fortemente sobrepostos, criando uma densa malha de astrócitos aparentemente reativos (Figura 6). Em camadas mais profundas (30-60 μm da superfície), os astrócitos transinduzidos exibem processos celulares finos que formam domínios esféricos em grande parte e sua morfologia se assemelha à de astrócitos in situ, conforme relatado anteriormente19,20,21 ( Figura6). Para obter uma melhor transdução de astrocitos de camada mais profunda, bem como melhor acesso óptico a estas camadas mais profundas, o tecido cicatricial glial pode ser removido como descrito no Passo 4.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg"> Figura 6: Visualização de astrócitos expressando ATeam1.03YEMK em fatias de cérebro organotipato parasagitais cultivadas. A imagem à esquerda corresponde a uma projeção de foco estendida de 191 seções ópticas (0,45 μm cada). Para fins ilustradores, a cicatriz glial foi excluída da projeção de astrócitos. As imagens à direita representam a visão de volume da mesma projeção antes e depois da remoção da cicatriz glial. As células são codificadas por cores de acordo com sua profundidade em relação à superfície da fatia, como indicado pelas escalas de cor à direita. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
A expressão bem-sucedida do ATeam1.03YEMK permite a medição dinâmica das mudanças nos níveis de ATP em neurônios ou astrócitos, dependendo do promotor usado (veja acima). Experimentos foram realizados em um banho experimental constantemente perfundido com E-ACSF (borbulhado com 95% O2/5% CO2). Em fatias organotípicas expressando ATeam1.03YEMK em neurônios hipocampais, regiões de interesse (ROIs) foram selecionadas antes de iniciar a gravação, representando os somatas das células piramidais (Figura 7A). Além disso, foi escolhida uma região para subtração de fundo(Figura 7A). Emissão de Vênus, bem como fluorescência eCFP foi então coletado para cada um desses ROIs separadamente e descrito como nível de emissão de fluorescência ao longo do tempo (Figura 7B). Depois de registrar fluorescência condições de controle por vários minutos para garantir uma linha de base estável, o metabolismo celular foi inibido por expor a preparação da fatia a uma soro fisiola sem glicose, à qual 5 mM de sódio azide (NaN3)foi adicionado por um minuto (Figura 7B). Essa manipulação induziu mudanças opostas na intensidade de emissão do par de FRET(Figura 7B,painéis esquerdos), com diminuição de Vênus (527 nm) e aumento da emissão de eCFP (475 nm). Calcular a relação FRET dividindo a emissão de fluorescência de Vênus pela eCFP (FVenus/FeCFP)resultou em sinais que refletem as mudanças relativas nos níveis intracelulares de ATP, a chamada "relação ATeam FRET" (Figura 7B, painel direito). Em todos os neurônios registrados (n = 70 células em N = 5 fatias), NaN3 causou uma diminuição reversível na relação ATeam FRET, indicando uma diminuição reversível nos níveis intracelulares de ATP após a inibição do metabolismo celular.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg"> Figura 7: Demonstração de tempo lapso ateam fret ratio imagem. (A)Canto superior esquerdo: Imagem de fluorescência de campo largo da camada piramidal e estrato radiatum da região CA1 de uma fatia hipocampal organotypic cultivada expressando ATeam1.03YEMK em neurônios. Canto superior direito: Visão ampliada da seção encaixotada, conforme indicado à esquerda. Linhas brancas delineam regiões de interesse (ROIs) 1-3 representando corpos celulares de neurônios piramidais CA1 escolhidos para análise em (B). Bg representa o ROI escolhido para correção de fundo. Inferior: Imagens pseudocoloridas que representam a emissão de fluorescência de Vênus (verde), eCFP (roxo) e a proporção de Vênus/eCFP. (B) Gravação de lapso de tempo em ROIs 1-3, representando corpos de células neuronais (ver A). Traços à esquerda mostram emissão normalizada de fluorescência de Vênus (verde) e eCFP (magenta). Os traços à direita mostram a proporção correspondente do ATeam FRET. Note-se que a perfusão com 5 mM NaN3 na ausência de glicose extracelular por 1 minuto (barra cinzenta) induz uma diminuição reversível na relação ATeam FRET, indicando uma diminuição na concentração intracelular de ATP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
Para garantir a estabilidade da preparação e do sensor em condições de experimento sinuoso de longo prazo, as fatias expressando ATeam em neurônios ou astrócitos eram constantemente perfundidas com ACSF por períodos prolongados (>50 min; n = 12 células cada, N = 3 OTCs de 3 cérebros). Nessas condições, a relação ATeam FRET não mudou(Figura 8). Expor os preparativos à CEI contendo inibidores metabólicos ("Isquemia Química", ver Tabela 1), em contraste, novamente resultou na queda esperada na relação ATeam FRET, conforme observado acima.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg"> Figura 8: Experimentos de base empregando ATeam. Imagens de longo prazo da relação ATeam FRET em 14 células diferentes em condições de base em neurônios (superior) e astrócitos (inferior). Os dados foram dados em condições comparáveis como outros dados experimentais. Ao final de cada medida, a isquemia química foi eliciada pela perfusão com CEI, conforme indicado pela seta. NOTA: Os índices de FRET da ATeam de base estão estáveis ao longo do tempo em condições de base. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
Em seguida, analisamos as respostas de neurônios e astrócitos expressando ATeam1.03YEMK a um aumento na concentração de potássio extracelular. Depois de estabelecer uma linha de base estável, os neurônios foram perfundidos com um soro salino em que a concentração de potássio foi aumentada de 3 para 8 mM por 3 minutos(Figura 9A). Esta manipulação, no entanto, não resultou em uma mudança detectável na relação ATeam FRET (n = 56 células em N = 5 fatias). Para garantir que o sensor reagisse a uma mudança nos níveis de ATP, as fatias foram novamente expostas a um período sustentado de isquemia química provocada pela substituição do E-ACSF pela CIS. A isquemia química resultou em uma rápida diminuição da relação ATeam FRET para um nível novo e estável, indicando esgotamento nominal do ATP após 2-3 min (Figura 9A).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg"> Figura 9: Experimentos representativos ilustrando mudanças nos níveis de ATP em neurônios e astrócitos. (A,B): Imagens à esquerda mostram fluorescência ATeam de neurônios e astrócitos localizados na região hipocampal CA1 de fatias organotípicas. Traços à direita representam gravações de lapso de tempo da relação ATeam FRET obtidas a partir de um ROI posicionado sobre um único corpo celular. Em ambos os experimentos, as fatias foram submetidas a um aumento na concentração de potássio extracelular por 3 minutos (ver barra), seguida de uma exposição final à isquemia química. Note-se que, enquanto os neurônios não respondem à elevação do potássio extracelular(A),ostrócitos reagem com um aumento no ATP (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
O mesmo protocolo experimental foi realizado com fatias, nas quais o ATeam1.03YEMK foi expresso em astrócitos. Em contraste com o que foi observado nos neurônios, os astrócitos reagiram ao aumento do potássio extracelular por um aumento reversível na relação ATeam FRET, indicando um aumento nos níveis intracelulares de ATP (n = 70 células em N = 5 fatias) (Figura 9B). A exposição subsequente à isquemia química resultou, como esperado, em uma grande queda na relação ATeam FRET, indicativa do esgotamento nominal do ATP intracelular(Figura 9B).

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Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Descrevemos um protocolo para a expressão específica do tipo celular do sensor geneticamente codificado baseado em FRET ATeam1.03YEMK em culturas organotípicas do antecérebro do rato. Além disso, mostramos como usar este sensor para imagens dinâmicas dos níveis de ATP celular em neurônios e astrócitos.

Imagem de ATP intracelular em fatias organotípicas do tecido do cérebro do rato usando o sensor ateam1.03yEMK baseado em FRET

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Aqui demonstramos como empregar o sensor FRET sensível ao ATP ATeam 1.03 YEMK para medições dinâmicas de mudanças nos níveis de ATP neuronal e astrócito em fatias hipocampais de camundongos organotipicamente cultivadas. A principal vantagem dessa técnica é que se pode estudar o metabolismo energético no tecido cerebral vivo em um ambiente controlado, um ambiente com altos níveis de expressão de sensores. Essa técnica pode ajudar a obter insights sobre os mecanismos de trajetória, doenças subjacentes ou danos cerebrais, por exemplo, causados pela privação de energia, como o derrame isquêmico.Pode, em princípio, ser usado para estudar níveis de ATP, não apenas no tecido cerebral, mas em outros órgãos também. Para executar este experimento com sucesso, é essencial realizar todas as etapas envolvidas na cultura do tecido extremamente cuidadosa e manter a esterilidade. Além disso, é necessário algum conhecimento sobre imagens fluorescentes celulares.O manuseio de tecidos na abordagem mais sofisticada e uma visualização são vitais para entender os procedimentos adequados. O mesmo vale para experimentos de imagem. Demonstrando o procedimento estarão Rodrigo Lerchundi, pós-doutor, e Na Huang, um estudante de mestrado do laboratório.Em uma placa de Petri gelada cheia de ACSF, coloque o cérebro em uma membrana de filtro. Separe os hemisférios e realize um corte parasagittal em um ângulo de 45 graus. Fixar um hemisfério no estágio do tecido Vibratome com supercola, e transferir imediatamente o bloco de tecido para o banho vibratome contendo ACSF gelado borbulhado com 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio.Alinhe o tecido no banho vibratome. Mantenha o segundo hemisfério em ACSF gelado até cortar. Ajuste o Vibratome para cortar fatias em 250 a 400 micrômetros.Após cortar a fatia, identifique a formação hipocampal com base em sua aparência morfológica típica e isole-a usando agulhas hipodérmicas, mantendo a parte do córtex cerebral adjacente ao hipocampo. Coloque a fatia em uma malha em ACSF, aquecida a 34 graus Celsius e borbulhada com 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio até que todas as fatias sejam coletadas. Transfira as fatias para o armário de fluxo laminar para continuar em condições estéreis.Com uma pipeta pasteur invertida, estéril e de vidro, transfira suavemente as fatias do ACSF para uma das placas de Petri pré-aquecidas cheias de solução de sal estéril hanks. Troque a pipeta e transfira as fatias para o segundo prato de cultura. Repita o processo cinco vezes no total.Transfira o mínimo de HBSS possível para as seguintes placas de cultura. Usando uma pipeta, coloque delicadamente uma fatia de cada vez no topo da inserção da cultura. Evite turbulências na pipeta e espere até que a fatia desça até a ponta da pipeta Pasteur.Repita o processo para cada fatia. Coloque duas fatias em uma membrana. Remova cuidadosamente qualquer solução Hank em excesso da parte superior da inserção usando uma ponta fina.Mantenha as culturas em uma incubadora umidificada a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius até o dia do experimento. Substitua o meio a cada dois ou três dias. Sem tocar no tecido, aplique 0,5 microliters do vetor diluído diretamente na parte superior de cada fatia.Por fim, coloque as fatias de volta na incubadora e mantenha-as lá por pelo menos mais seis dias. Pouco antes de iniciar um experimento, transfira uma inserção contendo fatias cultivadas no capô estéril, e coloque-a em um prato de 30 milímetros contendo um mililitro de cultura de fatia organotípica, ou meio essencial mínimo. Coloque o prato sob o estereoscópio e concentre-se na superfície da fatia.Use duas agulhas hipodérmicas estéreis para fazer um corte cruzado curto nas bordas estreitas de uma fatia escolhida, e na camada superior sem danificar o tecido por baixo. Para remover a fatia preparada da inserção, segure as bordas da membrana com pinças e use um bisturi estéril para fazer cortes retos e paralelos à membrana, formando um quadrado ou um triângulo com a fatia no centro. Se a inserção hospedar fatias adicionais, transfira-a de volta para a placa original e para a incubadora.A tensão superficial do meio evitará seu vazamento na superfície da membrana. Prepare acsf experimental e obtenha um pH de 7,4 borbulhando-o com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono através de uma tubulação inserida conectada ao suprimento de carbogênio por pelo menos trinta minutos. Mantenha o soro fisiológico borbulhado durante todo o experimento.Em seguida, ligue a fonte de luz fluorescente do monocrometro. Transfira a cultura organotipípica para a câmara experimental. Coloque uma grade em cima da cultura de fatia organotípica com o quadro para baixo, não tocando a cultura, e os fios para cima, tocando a membrana.Coloque a câmara no estágio do microscópio e conecte-a ao sistema de perfusão. Ligue a bomba peristáltica a uma vazão de 1,5 a 2,5 mililitros por minuto. Certifique-se de que não há vazamento do sistema de perfusão.Utilizando a luz de transmissão, enfoque a fatia cultivada e identifique a área onde os experimentos devem ser realizados. Antes de iniciar experimentos de imagem, espere pelo menos 15 minutos para permitir que as fatias se adaptem às condições salinas e liguem a câmera e o software de imagem. Excite a proteína fluorescente doadora a 435 nanômetros.Ajuste o tempo de exposição entre 40 a 90 milissegundos. Em seguida, insira o espelho dicroico e os filtros na unidade divisora de feixe. Divida a emissão de fluorescência em 500 nanômetros com um divisor de imagem de emissão, e empregue filtros de passe de banda em 482 mais ou menos 16 e 542 mais ou menos 13,5 nanômetros para isolar ainda mais a fluorescência de doadores e aceitadores.Selecione uma região de interesse aparentemente desprovida de fluorescência celular para subtração de fundo. Circule estruturas únicas de tecido rotulado na imagem na tela para criar ROIs. Defina a frequência de aquisição de imagens e o tempo total de gravação.Para experimentos com mais de 30 minutos, recomenda-se uma frequência de aquisição de 0,2 a 0,5 Hertz para prevenir a fototoxicidade. Posteriormente, inicie a gravação. Para induzir alterações no ATP intracelular, troque o tubo de perfusão do ACSF padrão para um soro fisiológico contendo inibidores metabólicos, por exemplo, solução de isquemia química.Alternativamente, use um soro fisiológico com concentração elevada de potássio a oito milimólares para imitar a liberação de íons de potássio de neurônios ativos. Logo após as gravações, troque o ACSF experimental com o ACSF tamponado por montes. Em seguida, transfira a câmara de gravação contendo a cultura da fatia para o microscópio de varredura a laser confocal.Tire imagens de pilha Z na resolução Z mais alta possível na configuração óptica dada. Neste protocolo, dez dias após uma transdução, neurônios expressando ATeam 1.03 YEMK foram encontrados em alta densidade no neocórtex de fatias de tecidocultural em profundidades de até 50 micrômetros abaixo da superfície da fatia. Resultados comparáveis foram alcançados no hipocampo.Para os astrócitos, o ATeam 1.03 YEMK foi expresso sob o controle do promotor de proteínas ácidas gliais gliais humanos, e as fatias organotípicas expressando ATeam 1.03 YEMK nos neurônios hipocampais selecionados rois representam a somata das células piramiais. Depois de expor a fatia a 5 milimônios de sódio na ausência de glicose extracelular por um minuto, alterações opostas foram induzidas na intensidade de emissão do par FRET. Também foi observada uma diminuição reversível na relação ATeam FRET.A relação ATeam FRET de longo prazo em 14 células diferentes sob condições básicas em neurônios e astrócitos mostram que o ATeam é um sensor confiável e estável. Observe que a isquemia química resultou na queda forte esperada na relação ATeam em ambos os tipos de células no final deste experimento. Um aumento na concentração extracelular de potássio de três para oito milimólares por três minutos não resultou em uma alteração detectável nos neurônios expressando ATeam 1.03 YEMK.Em contraste, os astrócitos reagiram ao aumento do potássio extracelular por um aumento reversível na relação ATeam FRET, indicando um aumento nos níveis de ATP intracelulares. Mais uma vez, a isquemia química causou uma redução imediata na relação ATeam, demonstrando que o sensor pode detectar alterações no ATP. Ao tentar imagens celulares baseadas em FRET como descrito aqui, é importante ter em mente que a produção de fatias de alta qualidade em culturas organotipas é um passo fundamental.Além disso, é necessária uma remoção cuidadosa da cicatriz gliais e da imagem de nível especializado. Após este procedimento, deve-se também ser capaz de realizar experimentos incorporando diferentes outros nanosensor baseados em FRET para metabólitos celulares. Por exemplo, aqueles para glicose ou lactato.Por último, mas não menos importante, é preciso ressaltar que devem ser sempre observados atos relevantes para a proteção dos animais. Isso também é verdade para as leis eficazes que regem o manuseio de organismos geneticamente modificados.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Neurociência

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regiosseletiva Biolistic Segmentação em Organotípicas fatias do cérebro do Usando um Modificado Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualização e imagem ao vivo do Oligodendrocyte organelas em fatias Organotypic cérebro usando microscopia Confocal e vírus Adeno-associado

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Rotulagem e imagem de placas amilóides no tecido cerebral usando a curcumina polifenóis naturais

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...