Name: imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Los autores desean agradecer a Claudia Roderigo y Simone Durry por su asistencia técnica experta. Agradecemos al Dr. Niklas J. Gerkau y al M.Sc. Joel Nelson por su asistencia en la preparación de las culturas de las rebanadas organotípicas. La investigación en el laboratorio del autor fue financiada por la Asociación Alemana de Investigación (DFG; PARA 2795: Ro 2327/13-1 y SPP 1757: Ro 2327/8-2 a CRR; y SPP 1757: Financiación de Young Glia Start-Up a RL).

Los autores no declaran intereses en competencia. Los autores recibieron apoyo financiero que permite la publicación de acceso abierto por Nikon Microscope Solutions, Dusseldorf, Alemania, que produce instrumentos utilizados en el artículo de vídeo. La compañía no participó en el diseño de los experimentos presentados aquí, ni en su ejecución, ni en el manejo de datos, ni en la escritura manuscrita.

Aquí, demostramos un procedimiento para la expresión específica de tipo celular de ATeam1.03YEMK, un nanosensor genéticamente codificado basado en FRET14,para la medición de cambios en los niveles de ATP en astrocitos o neuronas en cultivos de rebanadas de tejido organotípico del cerebro del ratón15. En grabaciones ejemplares, mostramos que un aumento en la concentración de potasio extracelular no resulta en un cambio en las concentraciones de ATP en las neuronas, mientras que los niveles astrocíticos de ATP aumentan en respuesta a esta manipulación. Además, nuestros resultados demuestran que tras la inhibición del metabolismo celular, la relación ATeam1.03YEMK FRET cae rápidamente en ambos tipos de células, lo que indica una rápida disminución del ATP intracelular.
La expresión de ATeam1.03YEMK en cultivos de rebanadas organotípicas requiere el mantenimiento del tejido en cultivo en condiciones controladas durante al menos 7-10 días. Alternativamente, ATeam1.03YEMK también se puede emplear para la medición de ATP en rebanadas de tejido cerebral agudamente aisladas y en nervios ópticos de ratones13,15. Las mediciones en tejidos agudamente aislados, sin embargo, requieren la generación de animales transgénicos o una aplicación estereotáctica de vectores virales en el cerebro, que implican experimentación animal y protocolos estrictos de cuidado animal. En este sentido, la expresión ATeam1.03YEMK en cultivos de rebanadas de tejido organotípico representa una alternativa útil y valiosa22,23. Desde hace muchos años, los cultivos de rebanadas de tejido organotípico sirven como un sistema modelo establecido para estudiar las propiedades neuronales, conectividad y desarrollo24,25,26. No sólo mantienen la arquitectura general del tejido y la laminación(Figura 1),sino que también albergan las propiedades preferenciales de los cultivos celulares, como la accesibilidad superior y el control directo de las condiciones experimentales. Los cultivos de rebanadas de tejido organotípico también se emplean rutinariamente para expresar genes extraños mediante el uso de vectores virales27. Se han notificado varios tipos de vectores virales para suministrar transgenes en el tejido cerebral16,28. Los vectores adenovirales inducen una alta expresión en las células gliales, pero no en las neuronas del hipocampo16,y podrían generar reactividad del glial17. Los vectores virales asociados a los adenos como se utilizan aquí emergen como una buena alternativa15,y su eficacia también se ha demostrado in vivo29.
Aunque se utiliza principalmente para el estudio de las propiedades neuronales, estudios recientes han establecido que los cultivos de rebanadas de tejido organotípico también se pueden emplear para el análisis de astrocitos. Las rodajas cultivadas suelen estar cubiertas por una capa de astrocitos reactivos19,30 (Figura 5), pero los astrocitos exhiben una morfología y citoarquitectura más nativas y no reactivas en capas más profundas19,30 (Figura 5). En el presente estudio, describimos un procedimiento para la eliminación mecánica de la cicatriz del glial exterior, lo que resulta en una mejor accesibilidad experimental y óptica de los astrocitos nativos dentro de las capas de tejido organotípico adecuadas. Además, su eliminación mejora la eficacia de la expresión en capas más profundas de las rebanadas organotípicas; si no se elimina la cicatriz del glial, la transducción por AAV podría tender a limitarse a las capas celulares superficiales.
Varios factores mecánicos externos deben tenerse en cuenta al realizar experimentos en rebanadas de tejido. Una variación en la velocidad de perfusión del baño puede inducir movimientos de toda la preparación y/o inducir cambios en el enfoque, lo que resulta en cambios transitorios artificiales de la señal del sensor. Además, tanto los astrocitos como las neuronas han sido reportados para responder a la deformación mecánica como impuesta por altas tasas de perfusión32,33. En nuestras manos, el uso de una bomba peristáltica fiable, junto con el mantenimiento de volúmenes pequeños y estables de solución salina entre el tejido y el objetivo (menisco) resulta en una señal FRET estable en condiciones basales a la velocidad de perfusión utilizada aquí (1,5-2,5 ml/min; Figura 8).
En el presente estudio, también demostramos que las imágenes basadas en FRET con ATeam1.03YEMK se pueden emplear para monitorear los niveles de ATP en neuronas y astrocitos. Un medio alternativo introducido anteriormente para la medición de ATP celular es el llamado ensayo luciferina-luciferasa34,35,36,37. Este enfoque, sin embargo, se basa en imágenes de bioluminiscencia y sólo proporciona una resolución temporal y espacial bastante baja en parte debido a los altos niveles de ruido de fondo. Otro método empleado rutinariamente en los últimos años fue la toma de imágenes de los cambios en la concentración de magnesio intracelular utilizando el verde magnesio fluoróforo sensible al ion38,39,40. Este enfoque se relaciona con la observación de que un consumo de ATP resulta en la liberación de su magnesio cofactor. Por lo que las imágenes con verde magnesio sólo proporcionan una estimación secundaria de los cambios en los niveles de ATP. Además, el verde magnesio también es sensible a los cambios en el calcio intracelular, introduciendo otra dificultad a la hora de interpretar los resultados obtenidos con este método.
El reciente desarrollo de nanosensores codificados genéticamente para la toma directa de imágenes de metabolitos celulares, por lo tanto, representó un gran paso adelante11,12. Se generaron varios sensores diferentes que se pueden emplear para la medición de ATP intracelular36,41,42,43. Entre ellos se encuentran el indicador de ATP fluorescente ratiométrico "QUEEN"41 así como PercevalHR, que detecta la relación ATP:ADP42. Si bien esta última sonda es una herramienta valiosa para el estudio del estado energético de las células, requiere la medición simultánea de los cambios en el pH42.
ATeam es un nanosensor del que existen varias variantes, que, entre otras, difieren en su afinidad vinculante con ATP14. In vitro, ATeam1.03YEMK exhibe una Kd de 1,2 mM a 37 oC, que está cerca de los niveles de ATP celular determinados en diferentes tipos de células neuronales, que van desde el hipotálamo y el cerebelo34 hasta el hipocampo37,44,45. En las mediciones de la cubeta, la reducción de la temperatura en 10 oC dio lugar a una disminución significativa en la afinidad de unión de ATeam1.03YEMK a ATP, lo que sugiere que podría no ser ideal para imágenes celulares a temperatura ambiente14. Nuestro estudio anterior15, sin embargo, demostró que el comportamiento y la respuesta de ATeam1.03YEMK expresado en neuronas y astrocitos a diferentes manipulaciones es similar en casi fisiológica y a temperatura ambiente, lo que indica que el sensor permite la determinación confiable de los niveles de ATP intracelular en ambas condiciones. Además, nuestros experimentos anteriores abordaron la sensibilidad al pH de ATeam1.03YEMK expresada dentro de las células15,mostrando que es insensible a los cambios en el pH intracelular en aproximadamente 0.1-0.2 unidades de pH. Si la Kd en el rango de mM bajo es una preocupación, las variantes alternativas de ATeam podrían utilizarse14, entre ellas variantes de cambio rojo de ATeam ("GO-ATeam")43.
Nuestros experimentos con ATeam1.03YEMK demuestran que un aumento en la concentración de potasio extracelular solo en unos pocos mM (de 3 a 8 mM) resulta en un aumento transitorio en la relación ATeam1.03YEMK en astrocitos en el cultivo de rebanadas organotípicas. Esta observación confirma estudios anteriores15,46 e indica claramente que los astrocitos responden a la liberación de potasio por las neuronas activas con un aumento en su producción de ATP, probablemente como consecuencia de una estimulación del Na+/K+-ATPase y el Na+/HCO3- cotransportador, respectivamente47,48. En contraste con esto, las neuronas no mostraron una respuesta, que está en línea con el trabajo anterior, así15. Ambos tipos de células, sin embargo, reaccionaron rápida y fuertemente a la inhibición de la glucólisis celular y la respiración mitocondrial como se muestra antes de15. En condiciones de isquemia química, las relaciones FRET de ATeam cayeron a un nuevo nivel estable, lo que indica un agotamiento nominal de ATP celular. Este último resultado sugiere que tanto las neuronas como los astrocitos exhiben un consumo relevante de ATP también en condiciones de estado estacionario sin estimulación adicional por activación sináptica o aplicación de neurotransmisores. En conjunto, llegamos a la conclusión de que las imágenes basadas en FRET con nanosensores codificados genéticamente, entre ellos ATeam1.03YEMK,proporcionarán un enfoque valioso para dilucidar los procesos celulares que son responsables de los cambios en los niveles de ATP intracelular y el consumo de ATP celular en diferentes condiciones.

La actividad eléctrica excitatoria de las neuronas se basa en gran medida en el flujo de cationes como el sodio (Na+) y el potasio (K+) a través de sus membranas plasmáticas. Por lo tanto, se requiere el mantenimiento de los gradientes electroquímicos de estos dos iones para la señalización. Esto se logra mediante el celular Na+/K+-ATPase (NKA), una bomba transmembrana electrogénica ubicuamente expresada, que extruye 3 Na+ fuera de la célula a cambio de 2K+ desde el espacio extracelular, requiriendo el consumo de una molécula de ATP por ciclo de transporte1. Además de la NKA, hay varios otros transportadores de iones que consumen ATP, incluyendo la membrana plasmática Ca2+-ATPase, que es vital para la homeostasis intracelular Ca2+ y su exportación después de la influencia inducida por la actividad2. En vesículas presinápticas, un tipo vacuolar H+-ATPase (v-ATPase) crea el gradiente de protones necesario para la admisión de neurotransmisores en este compartimiento3.
Mientras que la actividad de las neuronas por lo tanto requiere una cantidad sustancial de ATP4, no exhiben una capacidad significativa para el almacenamiento de energía. En su lugar, parecen depender de interacciones metabólicas con astrocitos vecinos, las principales reservas de glucógeno en el cerebro5. Se ha sugerido que el glucógeno astrocítico desempeña un papel importante en el apoyo a las necesidades de energía neuronal; y un fenómeno clave en este acoplamiento neurometabólico propuesto entre los dos tipos de células es la capacidad de los astrocitos para aumentar su producción de ATP en respuesta a la actividad neuronal6,7,8. Esta hipótesis, conocida como transbordador de lactato astrocito-neurona (ANLS), todavía está en debate, porque otros trabajos han proporcionado evidencia de que las neuronas también pueden aumentar su propia tasa de glucólisis en respuesta a la estimulación9,10,lo que refleja la necesidad de otros métodos y enfoques para estudiar la interacción neuro-glia.
La investigación del metabolismo de la energía celular y los niveles de ATP en neuronas y astrocitos para dilucidar las interacciones metabólicas de la neuro-glia se ha visto obstaculizada durante mucho tiempo por la falta de sondas adecuadas para la detección de cambios en las concentraciones de metabolitos en células vivas en el tejido cerebral. La última década, sin embargo, ha proporcionado un aumento en el desarrollo de nuevas herramientas y nuevas sondas fluorescentes codificadas genéticamente para diferentes metabolitos, incluyendo sensores para ATP, lactato, piruvato y otros11,12. Usando estas herramientas, ahora es posible abordar directamente las preguntas relacionadas con el consumo de ATP celular y los cambios en los niveles de energía celular a nivel de una sola célula y de una manera específica de tipo celular en el tejido cerebral intacto13.
En el presente trabajo, describimos un procedimiento para visualizar la dinámica de ATP citosólico en neuronas y astrocitos de rebanadas de cerebro organotípico cultivadas. Mostramos cómo emplear vectores virales asociados adeno-asociados (AAV) para la expresión específica de tipo celular del nanosensor DE ATP codificado genéticamente ATeam1.03YEMK (14) en neuronas y astrocitos de rebanadas de cerebro de ratón que se pueden mantener en el cultivo celular durante varias semanas15. Se describe un procedimiento de cómo extraer la cicatriz glial que cubre las rebanadas de tejido cultivado, que mejora la accesibilidad óptica y la imagen de las células en las capas de tejido organotípico debajo. Por último, mostramos cómo ATeam1.03YEMK se puede utilizar para realizar imágenes basadas en FRET de los cambios en los niveles de ATP celular en esta preparación. Este método alberga las principales ventajas de que no requiere procedimientos quirúrgicos del cerebro, proporciona altos niveles de expresión del sensor y la especificidad del tipo celular en rebanadas cerebrales cultivadas, reduciendo la invasividad o el estrés en las células en comparación con otros métodos, como la transfección por electroporación o transducción con otros vectores virales10,16,17. Además, este protocolo se puede aplicar a otros nanosensores basados en FRET, entre ellos variantes de ATeam1.03 que proporcionan menor afinidad de enlace para ATP14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxyglucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L07338</td>
			<td>Non-metabolizable glucose analog</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-IMA-410-019 Argon laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>488 nm wavelength argon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3525.1</td>
			<td>Antioxidant, Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 483/32</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 542/27</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 455 LP</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 505 LPXR</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scannig microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit)</td>
			<td>OriginLab corporation</td>
			<td></td>
			<td>Scientific graphing and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Caelo</td>
			<td>2580-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td>Perfusion chamber for live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394</td>
			<td>With Phenol Red for pH monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator HERAcell &#174; 150 with decontamination routine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAsafe KS/KSP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>26050088</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td>SVI Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.52i</td>
			<td>Wayne Rasban national Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software available in the public domain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP serie peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>High-precisionmulti-channel pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout software, Illustrator CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 16</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software for basic data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture insert</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7278</td>
			<td>Synthetic cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator Polychrome V</td>
			<td>Thermo Scientific/FEI</td>
			<td></td>
			<td>Ultra fast switching monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3 (Sodium Azide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &#8734;/0 WD 2.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Water Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements 4.50 advanced Research</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software. Upgraded version for FRET imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Pro Liquid GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS 6 Version 13.0</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v244</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v307</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WVIEW GEMINI optic system</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Emission Image Splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk

La actividad neuronal en el sistema nervioso central (SNC) evoca una alta demanda de energía celular proporcionada por la descomposición del trifosfato de adenosina (ATP). Se necesita una gran parte de ATP para reinstalar gradientes de iones a través de membranas plasmáticas degradadas por la señalización eléctrica de las neuronas. Hay evidencia de que los astrocitos -aunque no generan señales eléctricas rápidas en sí mismos- se someten a una mayor producción de ATP en respuesta a la actividad neuronal y apoyan a las neuronas activas proporcionándoles metabolitos energéticos. El reciente desarrollo de sensores codificados genéticamente para diferentes metabolitos ahora permite el estudio de tales interacciones metabólicas entre las neuronas y los astrocitos. Aquí, describimos un protocolo para la expresión específica de tipo celular del sensor de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia sensible a ATP (FRET-) ATeam1.03YEMK en cultivos de rebanadas de tejido organotípico del hipocampo y la corteza del ratón utilizando vectores virales asociados adeno (AAV). Además, demostramos cómo este sensor se puede emplear para la medición dinámica de los cambios en los niveles de ATP celular en las neuronas y astrocitos tras los aumentos en el potasio extracelular y después de la inducción de la isquemia química (es decir, una inhibición del metabolismo de la energía celular).

Los vectores AAV son una herramienta confiable para expresar selectivamente genes extraños en células dentro del tejido vivo16. La aplicación directa de AAVs que contienen el casete de secuencia de ATeam1.03YEMK y un promotor específico da como resultado una alta expresión del sensor en el tipo de celda elegido. En div 14 (10 días después de una transducción), las neuronas que expresan ATeam bajo el promotor de la sinapsina humana se encuentran a alta densidad en el neocórtex de rodajas de tejido cultivado a profundidades de hasta 50 m por debajo de la superficie de la rebanada(Figura 5A). Se pueden lograr resultados comparables en el hipocampo(Figura 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg"> Figura 5: Visualización de neuronas que expresan ATeam1.03YEMK en rebanadas de cerebro organotípico parasagittal cultivado. Las imágenes de la izquierda corresponden a proyecciones de enfoque extendido de 43 secciones ópticas (1,05 m cada una) de tejido cortical (A) y (B) de 70 secciones ópticas (0,6 m cada una) de tejido hipocampal. Las imágenes de la derecha representan la vista de volumen de la misma proyección. Las celdas están codificadas por colores según su profundidad en relación con la superficie del sector, como indica la escala de color de la derecha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para la medición de los niveles de ATP en astrocitos, ATeam1.03YEMK se expresa bajo el control del promotor de la proteína ácida fibrilar glial humana (GFAP). Esto resulta en la transducción eficiente de las células tanto en el neocórtex como en el hipocampo de las rebanadas de tejido cultivado(Figura 6). En particular, se pueden distinguir dos fenotipos morfológicos diferentes, dependiendo de la profundidad en relación con la superficie de las preparaciones de las rodajas. En la primera capa superficial, las células se caracterizan por procesos primarios gruesos que están dispuestos predominantemente en paralelo a la superficie. Estas células presentan dominios fuertemente superpuestos, creando una malla densa de astrocitos aparentemente reactivos (Figura 6). En capas más profundas (30-60 m de la superficie), los astrocitos transducidos exhiben procesos celulares finos que forman dominios en gran medida esféricos y su morfología se asemeja a la de los astrocitos in situ como se informó anteriormente19,20,21 ( Figura6). Para obtener una mejor transducción de astrocitos de capa más profunda, así como un mejor acceso óptico a estas capas más profundas, el tejido cicatricial glial se puede extraer como se describe en el paso 4.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg"> Figura 6: Visualización de astrocitos que expresan ATeam1.03YEMK en rebanadas de cerebro organotípicos parasagittales cultivados. La imagen de la izquierda corresponde a una proyección de enfoque extendido de 191 secciones ópticas (0,45 m cada una). A efectos ilustrativos, la cicatriz glial fue excluida de la proyección de los astrocitos. Las imágenes de la derecha representan la vista de volumen de la misma proyección antes y después de la eliminación de la cicatriz del glial. Las celdas están codificadas por colores según su profundidad en relación con la superficie del sector, como indican las escalas de color de la derecha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La expresión exitosa de ATeam1.03YEMK permite la medición dinámica de los cambios en los niveles de ATP en neuronas o astrocitos, dependiendo del promotor utilizado (ver arriba). Los experimentos se realizaron en un baño experimental constantemente perfundido con E-ACSF (burbuja con 95% O2/5% CO2). En las rebanadas organotípicas que expresan ATeam1.03YEMK en neuronas hipocampales, se seleccionaron regiones de interés (ROI) antes de iniciar el registro, representando los somatas de las células piramidales(Figura 7A). Además, se eligió una región para la resta de fondo(Figura 7A). La emisión de Venus, así como la fluorescencia eCFP, se recogió para cada uno de estos ROC por separado y se representó como nivel de emisión de fluorescencia a lo largo del tiempo(Figura 7B). Después de registrar la fluorescencia bajo condiciones de control durante varios minutos para asegurar una línea de base estable, el metabolismo celular se inhibió al exponer la preparación de la rebanada a una solución salina libre de glucosa, a la que se añadieron 5 mM de azida sódica (NaN3) durante un minuto(Figura 7B). Esta manipulación indujo cambios opuestos en la intensidad de emisión del par FRET(Figura 7B,paneles izquierdos), con una disminución de Venus (527 nm) y un aumento de la emisión de eCFP (475 nm). El cálculo de la relación FRET dividiendo la emisión de fluorescencia de Venus por la de eCFP (FVenus/FeCFP) dio lugar a señales que reflejan los cambios relativos en los niveles de ATP intracelular, la llamada "relación ATeam FRET"(Figura 7B,panel derecho). En todas las neuronas registradas (n a 70 células en n a 5 rebanadas), NaN3 causó una disminución reversible en la relación ATeam FRET, lo que indica una disminución reversible en los niveles de ATP intracelular tras la inhibición del metabolismo celular.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg"> Figura 7: Demostración de la imagen de relación ATeam FRET de lapso de tiempo. (A) Arriba a la izquierda: Imagen de fluorescencia de campo ancho de la capa piramidal y radiatum de estrato de la región CA1 de una rebanada de hipocampo organotípico cultivado que expresa ATeam1.03YEMK en neuronas. Arriba a la derecha: Vista ampliada de la sección en caja como se indica a la izquierda. Las líneas blancas delinean las regiones de interés (ROI) 1-3 que representan los cuerpos celulares de las neuronas piramidales CA1 elegidas para el análisis en (B). BG representa el ROI elegido para la corrección de fondo. Parte inferior: Imágenes pseudocolores que representan la emisión de fluorescencia de Venus (verde), eCFP (púrpura) y la relación de Venus/eCFP. (B) Registro de lapso de tiempo en ROIs 1-3, que representa los cuerpos de células neuronales (ver A). Las trazas a la izquierda muestran la emisión normalizada de fluorescencia de Venus (verde) y eCFP (magenta). Las trazas de la derecha muestran la relación aTeam FRET correspondiente. Tenga en cuenta que la perfusión con 5 mM NaN3 en ausencia de glucosa extracelular durante 1 minuto (barra gris) induce una disminución reversible en la relación ATeam FRET, lo que indica una disminución en la concentración de ATP intracelular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para garantizar la estabilidad de la preparación y el sensor en condiciones de experimento a largo plazo, las rebanadas que expresaban ATeam en neuronas o astrocitos se perfundieron constantemente con ACSF durante períodos prolongados (>50 min; n a 12 células cada una, N a 3 OTCs de 3 cerebros). En estas condiciones, la relación FRET de ATeam no cambió(Figura 8). La exposición de los preparados a la ISC que contienen inhibidores metabólicos ("Isquemia química", ver Tabla 1), en cambio, dio lugar de nuevo a la caída esperada en la relación ATeam FRET como se observó anteriormente.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg"> Figura 8: Experimentos de línea de base que emplean ATeam. Imágenes de relación FRET de ATeam a largo plazo en 14 células diferentes en condiciones basales en neuronas (arriba) y astrocitos (abajo). Los datos se tomaron en condiciones comparables que otros datos experimentales. Al final de cada medición, la isquemia química se produjo por perfusión con SCI, como indica la flecha. NOTA: Las relaciones asoFRET de línea de base son estables en el tiempo en condiciones de referencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
A continuación, analizamos las respuestas de las neuronas y astrocitos expresando ATeam1.03YEMK a un aumento en la concentración de potasio extracelular. Después de establecer una línea de base estable, las neuronas fueron perfundidas con una solución salina en la que la concentración de potasio se incrementó de 3 a 8 mM durante 3 minutos(Figura 9A). Sin embargo, esta manipulación no dio lugar a un cambio detectable en la relación FRET de ATeam (n a 56 celdas en n a 5 sectores). Para asegurarse de que el sensor reaccionó a un cambio en los niveles de ATP, las rebanadas fueron expuestas de nuevo a un período sostenido de isquemia química provocada por la sustitución de E-ACSF por CIS. La isquemia química dio lugar a una rápida disminución de la relación FRET de ATeam a un nivel nuevo y estable, lo que indica el agotamiento nominal de ATP después de 2-3 min(Figura 9A).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg"> Figura 9: Experimentos representativos que ilustran los cambios en los niveles de ATP en neuronas y astrocitos. (A,B): Las imágenes de la izquierda muestran fluorescencia de ATeam de neuronas y astrocitos ubicados en la región del hipocampo CA1 de rodajas organotípicas. Las trazas de la derecha representan las grabaciones de lapso de tiempo de la relación ATeam FRET obtenidas a partir de un ROI posicionado sobre un solo cuerpo de celda. En ambos experimentos, las rodajas fueron sometidas por primera vez a un aumento en la concentración de potasio extracelular durante 3 minutos (ver barra), seguido de una exposición final a la isquemia química. Tenga en cuenta que mientras que las neuronas no responden a la elevación del potasio extracelular (A), los astrocitos reaccionan con un aumento en ATP (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El mismo protocolo experimental se realizó con rebanadas, en las que ATeam1.03YEMK se expresaba en astrocitos. En contraste con lo observado en las neuronas, los astrocitos reaccionaron al aumento del potasio extracelular en un aumento reversible de la relación ATeam FRET, lo que indica un aumento en los niveles de ATP intracelular (n a 70 células en n a 5 rebanadas)(Figura 9B). La exposición posterior a la isquemia química dio lugar, como se esperaba, a una gran caída de la relación ATeam FRET, indicativa del agotamiento nominal del ATP intracelular(Figura 9B).

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Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Describimos un protocolo para la expresión específica de tipo celular del sensor basado en FRET genéticamente codificado ATeam1.03YEMK en cultivos de rebanadas organotípicas del forebrain del ratón. Además, mostramos cómo utilizar este sensor para imágenes dinámicas de los niveles de ATP celular en neuronas y astrocitos.

Imagen de ATP intracelular en rebanadas de tejido organotípico del cerebro del ratón utilizando el sensor basado en FRET ATeam1.03YEMK

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Aquí demostramos cómo emplear el sensor FRET sensible a ATP ATeam 1.03 YEMK para mediciones dinámicas de los cambios en los niveles neuronales y astrocíticos de ATP en sectores organotípicamente cultivados del hipocampo del ratón. La principal ventaja de esta técnica es que se puede estudiar el metabolismo energético en el tejido cerebral vivo en un entorno controlado, un entorno con altos niveles de expresión de sensores. Esta técnica puede ayudar a obtener información sobre los pathomecanismos, enfermedades subyacentes o daño cerebral, por ejemplo, causado por la privación de energía, como el accidente cerebrovascular isquémico.Se puede, en principio, se puede utilizar para estudiar los niveles de ATP, no sólo en el tejido cerebral, pero en otros órganos, así. Para ejecutar con éxito este experimento, es esencial realizar todos los pasos involucrados en el cultivo del tejido extremadamente cuidadoso y mantener la esterilidad. Además, se requiere cierto conocimiento de la imagen fluorescente celular.El manejo de tejidos en el enfoque más sofisticado y una visualización es vital para entender los procedimientos adecuados. Lo mismo ocurre con los experimentos de diagnóstico por imágenes. Demostrando el procedimiento estarán Rodrigo Lerchundi, un postdoctorado, y Na Huang, un estudiante de maestría del laboratorio.En un plato de Petri helado lleno de ACSF, coloque el cerebro sobre una membrana de filtro. Separe los hemisferios y realice un corte parasagittal en un ángulo de 45 grados. Fije un hemisferio en la etapa del tejido Vibratome con superpegamento, e inmediatamente transfiera el bloque de tejido al baño Vibratome que contiene ACSF helado burbujeado con 5% de dióxido de carbono y 95%oxígeno.Alinee el tejido en el baño Vibratome. Mantenga el segundo hemisferio en ACSF helado hasta cortarlo. Ajuste el Vibratome para cortar rodajas a 250 a 400 micrómetros.Después de cortar la rebanada, identificar la formación del hipocampo en función de su aspecto morfológico típico y aislarlo utilizando agujas hipodérmicas, manteniendo la parte de la corteza cerebral adyacente al hipocampo. Coloque la rebanada sobre una malla en ACSF, calentada a 34 grados Celsius y burbujeada con 5% de dióxido de carbono y 95%oxígeno hasta que se recojan todas las rodajas. Transfiera las rodajas al armario de flujo laminar para continuar en condiciones estériles.Con una pipeta Pasteur de vidrio invertido y estéril, transfiera suavemente las rodajas del ACSF a uno de los platos Petri precalegados llenos de solución estéril de sal de Hanks. Cambie la pipeta y transfiera las rodajas al segundo plato de cultivo. Repita el proceso cinco veces en general.Transfiera el menor HBSS posible a las siguientes placas de cultivo. Con una pipeta, coloque suavemente una rebanada a la vez en la parte superior del inserto de cultivo. Evite las turbulencias en la pipeta y espere hasta que la rebanada descienda hasta la punta de la pipeta Pasteur.Repita el proceso para cada sector. Coloque dos rodajas en una membrana. Retire cuidadosamente cualquier exceso de solución Hank de la parte superior de la plaquita usando una punta fina.Mantenga los cultivos en una incubadora humidificada en 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados hasta el día del experimento. Reemplace el medio cada dos o tres días. Sin tocar el tejido, aplique 0,5 microlitros del vector diluido directamente en la parte superior de cada rodaja.Finalmente, vuelva a colocar las rodajas en la incubadora y mantenlas allí durante al menos seis días más. Justo antes de comenzar un experimento, transfiera un inserto que contenga rodajas cultivadas en la capucha estéril y colóquelo en un plato de 30 milímetros que contenga un mililitro de medio de cultivo de rodajas organotípicas, o medio esencial mínimo. Coloque el plato debajo del estereoscopio y concéntrese en la superficie de la rebanada.Utilice dos agujas hipodérmicas estériles para hacer un corte cruzado corto justo en los bordes estrechos de una rebanada elegida, y en la capa superior sin dañar el tejido debajo. Para eliminar la rebanada preparada de la plaquita, sostenga los bordes de la membrana con pinzas y utilice un bisturí estéril para hacer cortes rectos y paralelos a la membrana, formando un cuadrado o un triángulo con la rebanada en el centro. Si el inserto aloja rodajas adicionales, transfiérelos de vuelta a la placa original y a la incubadora.La tensión superficial del medio evitará su fuga sobre la superficie de la membrana. Preparar ACSF experimental y obtener un pH de 7,4 burbujeándolo con 95%oxígeno y 5% de dióxido de carbono a través de un tubo insertado conectado al suministro de carbógeno durante al menos treinta minutos. Mantenga la solución salina burbujeada durante todo el experimento.A continuación, encienda la fuente de luz fluorescente del monocroma. Transfiera el cultivo de la rebanada organotípica a la cámara experimental. Coloque una rejilla en la parte superior del cultivo organotípico de la rebanada con el marco hacia abajo, sin tocar el cultivo, y los hilos hacia arriba, tocando la membrana.Coloque la cámara en la etapa del microscopio y conéctela al sistema de perfusión. Encienda la bomba peristáltica a un caudal de 1,5 a 2,5 mililitros por minuto. Asegúrese de que no haya fugas del sistema de perfusión.Usando la luz de transmisión, ponga la rebanada cultivada en el foco e identifique el área donde se realizarán los experimentos. Antes de iniciar los experimentos de diagnóstico por imágenes, espere al menos 15 minutos para permitir que las rebanadas se adapten a las condiciones salinas y, a continuación, encienda la cámara y el software de imágenes. Excite la proteína fluorescente del donante a 435 nanómetros.Establezca el tiempo de exposición en entre 40 y 90 milisegundos. A continuación, inserte el espejo dicroico y los filtros en la unidad divisora de viga. Divida la emisión de fluorescencia en 500 nanómetros con un divisor de imagen de emisión y utilice filtros de paso de banda a 482 más o menos 16 y 542 más o menos 13,5 nanómetros para aislar aún más la fluorescencia de donantes y aceptadores.Seleccione una región de interés aparentemente carente de fluorescencia celular para la resta de fondo. Círculo de estructuras individuales de tejido etiquetado en la imagen en la pantalla para crear ROI. Establezca la frecuencia de adquisición de imágenes y el tiempo total de grabación.Para experimentos de más de 30 minutos, se recomienda una frecuencia de adquisición de 0,2 a 0,5 hercios para evitar la fototoxicidad. Posteriormente, inicie la grabación. Para inducir cambios en el ATP intracelular, cambie el tubo de perfusión del ACSF estándar a una solución salina que contenga inhibidores metabólicos, por ejemplo, solución de isquemia química.Alternativamente, utilice una solución salina con una concentración elevada de potasio a ocho mililitros para imitar la liberación de iones de potasio de las neuronas activas. Directamente después de las grabaciones, intercambie el ACSF experimental con el ACSF con montones-buffered. A continuación, transfiera la cámara de grabación que contiene el cultivo de la rebanada al microscopio de escaneo láser confocal.Tome imágenes de pila Z con la resolución Z más alta posible en la configuración óptica dada. En este protocolo, diez días después de una transducción, las neuronas que expresaban ATeam 1.03 YEMK se encontraron a alta densidad en el neocórtex de las rebanadas de tejido cultivada a profundidades de hasta 50 micrómetros por debajo de la superficie de la rebanada. Se lograron resultados comparables en el hipocampo.Para los astrocitos, ATeam 1.03 YEMK se expresó bajo el control del promotor de proteínas ácidas fibrolares gliales humanas, y las rodajas organotípicas que expresan ATeam 1.03 YEMK en las neuronas del hipocampo crujas seleccionadas LOS ROI representan los somatas de las células piramidales. Después de exponer la rebanada a 5 alzida sódica milimétrica en ausencia de glucosa extracelular durante un minuto, se indujeron cambios opuestos en la intensidad de emisión del par FRET. También se observó una disminución reversible en la relación ATeam FRET.La relación ATeam FRET a largo plazo en 14 células diferentes en condiciones basales en neuronas y astrocitos muestra que el ATeam es un sensor confiable y estable. Tenga en cuenta que la isquemia química resultó en la fuerte caída esperada en la proporción de ATeam en ambos tipos de células al final de este experimento. Un aumento en la concentración extracelular de potasio de tres a ocho milimolar durante tres minutos no resultó en un cambio detectable en las neuronas que expresan ATeam 1.03 YEMK.Por el contrario, los astrocitos reaccionaron al aumento del potasio extracelular por un aumento reversible en la relación ATeam FRET, lo que indica un aumento en los niveles intracelulares de ATP. Una vez más, la isquemia química causó una disminución inmediata en la relación de ATeam, demostrando que el sensor puede detectar cambios en ATP. Al intentar imágenes celulares basadas en FRET como se describe aquí, es importante tener en cuenta que la producción de rebanadas de alta calidad en cultivos organotípicos es un paso clave.Además, se requiere una eliminación cuidadosa de la cicatriz glial y de las imágenes a nivel experto. Después de este procedimiento, uno también debe ser capaz de realizar experimentos que incorporan diferentes otros nanosensores basados en FRET para metabolitos celulares. Por ejemplo, los de glucosa o lactato.Por último, pero no menos importante, es necesario subrayar que siempre deben observarse los actos pertinentes de protección de los animales. Esto también es cierto para las leyes efectivas que rigen el manejo de organismos modificados genéticamente.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Investigación

Neurociencias

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselectiva biolística Focalización en Organotípicos cerebro rebanadas Usando una pistola de genes Modificado

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualización y en proyección de imagen del Oligodendrocyte organelos en rebanadas de cerebro Organotypic mediante Virus Adeno-asociado y Microscopía Confocal

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Proyección de imagen de dos fotones de atracción Microglial procesos hacia ATP o serotonina en rebanadas de cerebro agudo

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Etiquetado e imágenes de placas amiloideas en el tejido cerebral utilizando la curcumina de polifenoles naturales

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...