Name: imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Författarna vill tacka Claudia Roderigo och Simone Durry för expert teknisk assistans. Vi tackar Dr. Niklas J. Gerkau och M.Sc. Joel Nelson för hjälp med att förbereda de organotypiska segment kulturerna. Forskning i författarens laboratorium finansierades av den tyska forskningsföreningen (DFG; FÖR 2795: ro 2327/13-1 och SPP 1757: ro 2327/8-2 till CRR; och SPP 1757: unga glia start finansiering till RL).

Författarna förklarar inga konkurrerande intressen. Författarna fick ekonomiskt stöd som möjliggör Open Access-publicering av Nikon Mikroskop Solutions, Düsseldorf, Tyskland, som producerar instrument som används i video artikeln. Företaget var varken involverat i utformningen av de experiment som presenteras här, inte heller i deras utförande, inte heller i datahanteringen eller i manuskriptet.

Här visar vi ett förfarande för den cell-typ specifika uttryck av ATeam 1,03Yemk, en FRET-baserade, genetiskt kodade nanosensor14, för mätning av förändringar i ATP nivåer i astrocyter eller nervceller i organotypic vävnad slice kulturer av mushjärna15. I exemplariska inspelningar, visar vi att en ökning av den extracellulära kaliumkoncentrationen inte resulterar i en förändring i ATP-koncentrationer i nervceller, medan astrocytic ATP nivåer stiger som svar på denna manipulation. Dessutom, våra resultat visar att vid hämning av cellulär metabolism, ATeam 1,03Yemk FRET förhållandet snabbt sjunker i båda celltyper, indikerar en snabb minskning av INTRACELLULÄRA ATP.
Uttryck för ATeam 1,03Yemk i organotypic slice kulturer kräver underhåll av vävnaden i kulturen under kontrollerade betingelser under minst 7-10 dagar. Alternativt kan ATEAM 1,03yemk också användas för mätning av ATP i akut isolerade hjärnvävnad skivor och i optiska nerver av möss13,15. Mätningar i akut isolerad vävnad, dock nödvändiggör generering av transgena djur eller en stereotaktisk tillämpning av virusvektorer i hjärnan, med djurförsök och strikt djuromsorg protokoll. I detta avseende, ATEAM 1,03yemk uttryck i organotypic vävnad slice kulturer representerar ett användbart och värdefullt alternativ22,23. Under många år nu, organotypic vävnad slice kulturer fungera som ett etablerat modellsystem för att studera neurala egenskaper, anslutning och utveckling24,25,26. De upprätthåller inte bara den allmänna vävnads arkitekturen och lamineringen (figur 1), utan också värd för förmåns egenskaperna hos cellkulturer som överlägsen tillgänglighet och direkt kontroll av Försöksförhållanden. Organotypic vävnad slice kulturer är också rutinmässigt används för att uttrycka främmande gener med hjälp av virala vektorer27. Flera typer av virala vektorer har rapporterats att leverera transgener till hjärnvävnad16,28. Adenovirala vektorer inducerar högt uttryck i gliaceller celler, men inte Hippocampus nervceller16, och kan generera gliaceller reaktivitet17. Adeno-associerade virala vektorer som används här framstår som ett bra alternativ15, och deras effektivitet har också visats i vivo29.
Medan främst används för studier av neuronala egenskaper, nyligen genomförda studier har fastställt att organotypic vävnad slice kulturer kan också användas för analys av astrocyter. Odlade skivor är oftast omfattas av ett skikt av reaktiva astrocyter19,30 (figur 5), men astrocyter uppvisar en mer infödd, icke-reaktiv morfologi och cytoarchitecture i djupare skikt19,30 (figur 5). I den nuvarande studien beskriver vi ett förfarande för mekanisk borttagning av den yttre glialärr, vilket resulterar i en bättre experimentell och optisk tillgänglighet av inhemska astrocyter inom rätt organotypic vävnad skikt. Dessutom förbättrar dess avlägsnande uttrycket effektivitet i djupare skikt av organotypic skivor; om glialärr inte avlägsnas, kan transduktion av AAVs tenderar att begränsas till de ytliga cellagren.
Flera yttre mekaniska faktorer måste beaktas när man utför experiment i vävnad skivor. En variation i Bad perfusion hastighet kan inducera rörelser hela preparatet och/eller inducera förändringar i fokus, vilket resulterar i konstgjorda övergående förändringar av sensorn signalen. Dessutom, både astrocyter och nervceller har rapporterats att reagera på mekanisk deformation såsom införts genom höga perfusion priser32,33. I våra händer, med hjälp av en pålitlig Peristaltisk pump, tillsammans med att upprätthålla små och stabila volymer av saltlösning mellan vävnaden och målet (menisken) resulterar i en stabil bandet-signal under baslinjen förhållanden vid perfusion hastighet som används här (1.5-2.5 mL/min; Figur 8).
I den nuvarande studien, visar vi också att FRET-baserad avbildning med ATeam 1,03Yemk kan användas för att övervaka ATP nivåer i nervceller och astrocyter. Ett alternativt sätt som infördes tidigare för mätning av cellulära ATP är den så kallade Luciferin-luciferase assay34,35,36,37. Detta tillvägagångssätt är dock baserat på avbildning av bioluminescens och ger bara en ganska låg tidsmässiga och rumsliga upplösning delvis på grund av höga bakgrundsljud nivåer. En annan metod som rutinmässigt använts under de senaste åren var avbildning av förändringar i den intracellulära magnesium koncentrationen med hjälp av Jon känsliga fluorofore magnesium Green38,39,40. Detta tillvägagångssätt avser iakttagelsen att en konsumtion av ATP resulterar i frisläppandet av dess Co-Factor magnesium. Avbildning med magnesium grönt ger därmed endast en sekundär uppskattning av förändringar i ATP-nivåer. Dessutom är magnesium grön också känslig för förändringar i intracellulära kalcium, införa en annan svårighet när tolka resultat som erhållits med denna metod.
Den senaste utvecklingen av genetiskt kodade nanosensorer för direkt avbildning av cellulära metaboliter, därför representerade ett stort steg framåt11,12. Flera olika sensorer genererades som kan användas för mätning av intracellulära ATP36,41,42,43. Bland dessa är den ratiometriska fluorescerande ATP indikatorn "drottning"41 samt PercevalHR, som känner av ATP: ADP ratio42. Medan den sistnämnda sonden är ett värdefullt verktyg för att studera cellernas energistatus krävs samtidig mätning av förändringar i pH42.
ATeam är en nanosensor där flera varianter finns, vilka bland annat skiljer sig åt i deras bindningsaffinitet för ATP-14. In vitro, ATEAM 1,03yemk uppvisar en Kd på 1,2 mm vid 37 ° c, som är nära cellulära ATP nivåer bestäms i olika neuronala celltyper, allt från hypotalamus och lillhjärnan34 till Hippocampus37,44,45. I kyvetten mätningar, sänka temperaturen med 10 ° c resulterade i en signifikant minskning av bindningsaffinitet av ATEAM 1,03yemk till ATP, vilket tyder på att det kanske inte är idealisk för cellulära Imaging vid rumstemperatur14. Vår tidigare studie15, emellertid, visade att beteendet och svaret av ATEAM 1,03yemk uttrycks i nervceller och astrocyter till olika manipulationer är liknande på nära fysiologiska och vid rumstemperatur, vilket indikerar att sensorn tillåter tillförlitlig bestämning av intracellulära ATP nivåer under båda förhållanden. Dessutom, våra tidigare experiment riktat pH-känslighet ATeam 1,03Yemk uttrycks inuti celler15, visar att det är okänsligt för förändringar i intracellulära pH med ca 0,1-0,2 pH-enheter. Om Kd i den låga mm-serien är ett bekymmer, alternativa ATEAM varianter kan användas14, bland dem röd-skiftade varianter av ATEAM ("go-ateam")43.
Våra experiment med ATeam 1,03yemk visar att en ökning av den extracellulära kaliumkoncentrationen med några mm endast (från 3 till 8 mm) resulterar i en övergående ökning av ATEAM 1,03yemk förhållandet i astrocyter i organotypic slice kultur. Denna observation bekräftar tidigare studier15,46 och visar tydligt att astrocyter svara på frisättning av kalium genom aktiva nervceller med en ökning av deras ATP produktion, mest sannolikt som en följd av en stimulering av na+/k+-ATPas och na+/HCO3- cotransporter, respektive47,48. I motsats till detta, nervceller visade inte ett svar, som är i linje med tidigare arbete samt15. Båda celltyperna, dock, snabbt och starkt reagerade på hämning av cellulär glykolys och mitokondriell andning som visas före15. Under förhållanden av kemisk ischemia, ATeam FRET nyckeltal föll till en ny stabil nivå, vilket indikerar en nominell utarmning av cellulära ATP. Det senare resultatet tyder på att både nervceller samt astrocyter uppvisar en relevant konsumtion av ATP även under steady-state villkor utan ytterligare stimulering av synaptisk aktivering eller tillämpning av signalsubstanser. Sammantaget drar vi slutsatsen att FRET-baserad avbildning med genetiskt kodade nanosensorer, bland dem ATeam 1,03Yemk, kommer att ge en värdefull strategi för att belysa de cellulära processer som är ansvariga för förändringar i intracellulära ATP nivåer och cellulära ATP konsumtion under olika förhållanden.

Excitatoriska elektrisk aktivitet av nervceller är till stor del baserat på flödet av katjoner såsom natrium (na+) och kalium (K+) över deras plasmamembran. Underhåll av elektrokemiska gradienter av dessa två joner krävs därför för signalering. Detta åstadkoms genom cellulära na+/k+-ATPAS (nka), en ubiquitously uttryckt elektrogena transmembranpump, som extruderar 3 na+ ut ur cellen i utbyte mot 2 K+ från extracellulära rymden, som kräver konsumtion av en molekyl av ATP per transport cykel1. Förutom NKA, det finns flera andra ATP-konsumerar Jon transportörer inklusive plasmamembranet ca2 +-ATPas, vilket är viktigt för intracellulära ca2 + homeostas och dess export efter aktivitetsinducerad tillströmning2. I presynaptiska blåsor, en vacuolar-typ H+-ATPas (v-ATPas) skapar protongradienten som krävs för signalsubstansen upptag i detta fack3.
Medan aktiviteten hos nervceller kräver därför en betydande mängd ATP4, de uppvisar inte en betydande kapacitet för lagring av energi. Istället, de verkar förlita sig på metaboliska interaktioner med angränsande astrocyter, de stora glykogen butikerna i hjärnan5. Det har föreslagits att astrocytic glykogen verkligen spelar en viktig roll för att stödja neuronala energibehov; och ett nyckel fenomen i detta föreslagna neuro-metabolisk koppling mellan de två celltyperna är kapaciteten hos astrocyter att öka deras ATP produktion som svar på neuronala aktivitet6,7,8. Denna hypotes, känd som astrocyte-neuron laktat Shuttle (anls), är fortfarande under debatt, eftersom annat arbete har gett belägg för att nervceller också kan öka sin egen frekvens av glykolys som svar på stimulering9,10, vilket återspeglar nödvändigheten av ytterligare metoder och metoder för att studera neuro-glia interaktion.
Utredning av cellulär energimetabolism och ATP nivåer i nervceller och astrocyter för att belysa neuro-glia metaboliska interaktioner har länge hämmats av avsaknaden av lämpliga sonder för detektion av förändringar i metabolitkoncentrationer i levande celler i hjärnvävnad. Det senaste decenniet har dock gett en ökning av utvecklingen av nya verktyg och nya genetiskt kodade fluorescerande prober för olika metaboliter, inklusive sensorer för ATP, laktat, pyruvat och andra11,12. Med hjälp av dessa verktyg, är det nu möjligt att direkt ta itu med frågor som rör cellulära ATP konsumtion och förändringar i cellulära energi nivåer på enstaka cellnivå och i en cell-typ specifikt sätt i intakt hjärnvävnad13.
I det nuvarande arbetet, beskriver vi ett förfarande för att visualisera cytosoliska ATP dynamik på nervceller och astrocyter av odlade organotypic hjärn skivor. Vi visar hur man använder Adeno-associerade virala vektorer (AAV) för cell-typ specifikt uttryck för den genetiskt kodade ATP-nanosensor ATeam 1,03Yemk (14) i nervceller och astrocyter av skivor av mushjärna som kan upprätthållas i cellkulturen i flera veckor15. Ett förfarande för hur man tar bort den gliaceller ärr som täcker odlade vävnad skivor beskrivs, vilket förbättrar optisk tillgänglighet och avbildning av celler i organotypic vävnad lagren under. Slutligen visar vi hur ATeam 1,03Yemk kan användas för att utföra FRET-baserad avbildning av förändringar i cellulära ATP nivåer i denna beredning. Denna metod är värd de stora fördelarna att det inte kräver kirurgiska hjärnan förfaranden, ger höga nivåer av uttryck av sensorn och celltyp specificitet i odlade hjärn skivor, minska invasivitet eller stress i cellerna jämfört med andra metoder, som transfektion av elektroporation eller transduktion med andra virala vektorer10,16,17. Dessutom kan detta protokoll tillämpas på andra FRET baserade nanosensorer, bland dem varianter av ATeam 1,03 som ger lägre bindning affinitet för ATP14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxyglucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L07338</td>
			<td>Non-metabolizable glucose analog</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-IMA-410-019 Argon laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>488 nm wavelength argon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3525.1</td>
			<td>Antioxidant, Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 483/32</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 542/27</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 455 LP</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 505 LPXR</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scannig microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit)</td>
			<td>OriginLab corporation</td>
			<td></td>
			<td>Scientific graphing and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Caelo</td>
			<td>2580-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td>Perfusion chamber for live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394</td>
			<td>With Phenol Red for pH monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator HERAcell &#174; 150 with decontamination routine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAsafe KS/KSP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>26050088</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td>SVI Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.52i</td>
			<td>Wayne Rasban national Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software available in the public domain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP serie peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>High-precisionmulti-channel pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout software, Illustrator CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 16</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software for basic data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture insert</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7278</td>
			<td>Synthetic cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator Polychrome V</td>
			<td>Thermo Scientific/FEI</td>
			<td></td>
			<td>Ultra fast switching monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3 (Sodium Azide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &#8734;/0 WD 2.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Water Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements 4.50 advanced Research</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software. Upgraded version for FRET imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Pro Liquid GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS 6 Version 13.0</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v244</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v307</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WVIEW GEMINI optic system</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Emission Image Splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk

Neuronal aktivitet i centralanervsystemet (CNS) framkallar en hög efterfrågan på cellulär energi från nedbrytningen av adenosintrifosfat (ATP). En stor del av ATP behövs för att ominstallera Jon gradienter över plasmamembran bryts ned av elektrisk signalering av nervceller. Det finns bevis för att astrocyter-samtidigt inte generera snabba elektriska signaler själva-genomgår ökad produktion av ATP som svar på neuronala aktivitet och stödja aktiva nervceller genom att ge energimetaboliter till dem. Den senaste utvecklingen av genetiskt kodade sensorer för olika metaboliter nu möjliggör studiet av sådana metaboliska interaktioner mellan nervceller och astrocyter. Här beskriver vi ett protokoll för cell-typ specifikt uttryck för ATP-känsliga Fluorescence resonans energiöverföring-(FRET-) sensor ATeam 1,03Yemk i organotypic vävnad slice kulturer av musen hippocampus och cortex med Adeno-associerade virala vektorer (AAV). Vidare, vi visar hur denna sensor kan användas för dynamisk mätning av förändringar i cellulära ATP nivåer i nervceller och astrocyter på ökningar av extracellulära kalium och efter induktion av kemisk ischemi (dvs., en hämning av cellulära energimetabolism).

AAV vektorer är ett pålitligt verktyg för att selektivt uttrycka främmande gener i celler inom levande vävnad16. Direkt applicering av AAVs som innehåller sekvens kassetten för ATeam 1,03Yemk och en specifik promotor resulterar i ett högt uttryck av sensorn i den valda celltypen. Vid DIV 14 (~ 10 dagar efter en transduktion), neuroner uttrycker ATeam under mänskliga synapsin promotorn finns på hög densitet i neocortex av odlade vävnad skivor på djup av upp till 50 μm under slice ytan (figur 5a). Jämförbara resultat kan uppnås i hippocampus (figur 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg"> Figur 5: visualisering av nervceller som uttrycker ATeam 1,03Yemk i odlade parasagittal organotypic hjärn skivor. Bilder till vänster motsvarar utökade fokus projektioner av 43 optiska sektioner (1,05 μm vardera) av kortikal vävnad (a) och (B) av 70 optiska sektioner (0,6 μm vardera) av hippocampus vävnad. Bilder till höger representerar volymvyn för samma projektion. Cellerna är färgkodade enligt deras djup i förhållande till segment ytan, vilket indikeras av färgskalan till höger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
För mätning av ATP nivåer i astrocyter, ATEAM 1,03yemk uttrycks under kontroll av den mänskliga gliaceller hjärn sura protein (gfap) promotor. Detta resulterar i en effektiv transduktion av celler i både neocortex och Hippocampus odlade vävnads skivor (figur 6). Särskilt kan två olika morfologiska fenotyper särskiljas, beroende på djupet i förhållande till ytan av segmentet preparat. I det första ytliga skiktet, celler kännetecknas av tjocka primära processer som huvudsakligen arrangeras parallellt med ytan. Dessa celler uppvisar starkt överlappande domäner, skapa en tät meshwork av tydligen reaktiva astrocyter (figur 6). I djupare skikt (30-60 μm från ytan), sensorik astrocyter uppvisar fina cellulära processer som bildar till stor del sfäriska domäner och deras morfologi liknar den av astrocyter på plats som rapporterats tidigare19,20,21 (figur 6). För att få bättre transduktion av djupare skikt astrocyter samt bättre optisk tillgång till dessa djupare skikt, kan gliaceller ärrvävnad avlägsnas som beskrivs i steg 4.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg"> Figur 6: visualisering av astrocyter uttrycker ATeam 1,03Yemk i odlade parasagittal organotypic hjärn skivor. Bilden till vänster motsvarar en utökad fokusprojektion på 191 optiska sektioner (0,45 μm vardera). För illustration ändamål var gliaceller ärr uteslutas från projektion av astrocyter. Bilder till höger representerar volymvyn av samma projektion före och efter avlägsnande av glialärr. Cellerna är färgkodade enligt deras djup i förhållande till segment ytan, vilket indikeras av Färgskalorna till höger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Framgångsrikt uttryck för ATeam 1,03Yemk möjliggör dynamisk mätning av förändringar i ATP-nivåer i nervceller eller astrocyter, beroende på arrangören används (se ovan). Experiment utfördes i ett experiment bad ständigt parfymera med E-ACSF (bubblade med 95% O2/5% Co2). I organotypic skivor uttrycker ATeam 1,03Yemk i hippocampus nervceller, områden av intresse (Rois) valdes innan inspelningen, som representerar Somata av pyramidala celler (figur 7A). Dessutom valdes en region för bakgrunds subtraktion (figur 7a). Utsläppen av Venus och eCFP-fluorescensen samlades sedan in för var och en av dessa ROIs separat och avbildas som fluorescensutsläppsnivå över tiden (figur 7B). Efter att ha inspelat fluorescensen under kontrollförhållanden i flera minuter för att säkerställa en stabil baslinje hämmade cellulär metabolism genom att exponera segment preparatet för en glukos fri saltlösning, till vilken 5 mM natriumazid (NaN3) lades till en minut (figur 7B). Denna manipulation inducerade motsatta förändringar i utsläppsintensiteten av bandet paret (figur 7B, vänster paneler), med en minskning av Venus (527 nm) och en ökning av ecfp (475 nm) utsläpp. Beräkna bandet förhållandet genom att dividera fluorescensutsläpp av Venus med eCFP (FVenus/fecfp) resulterade i signaler som återspeglar de relativa förändringarna i intracellulära ATP nivåer, den så kallade "ATEAM FRET ratio" (figur 7B, höger panel). I alla inspelade nervceller (n = 70 celler i N = 5 skivor), NaN3 orsakade en reversibel minskning av ATEAM FRET förhållandet, indikerar en reversibel minskning av INTRACELLULÄRA ATP nivåer vid hämning av cellulär metabolism.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg"> Figur 7: demonstration av tidsfördröjning ATeam FRET ratio Imaging. (A) övre vänster: Wide-fältfluorescens bild av pyramidala skiktet och stratum radiatum i CA1 regionen av en odlade organotypic Hippocampus slice uttrycker ATEAM 1,03yemk i nervceller. Överst till höger: förstorad vy av boxed sektion som anges till vänster. Vita linjer avgränsa regioner av intresse (ROIs) 1-3 representerar cell kroppar av CA1 pyramidala neuroner som valts för analys i (B). BG representerar ROI som valts för bakgrundskorrigering. Nederst: pseudo-färgade bilder som representerar fluorescensutsläpp av Venus (grön), eCFP (lila) och förhållandet mellan Venus och eCFP. B) tidsfördröjd inspelning i rois 1-3, som representerar neuronala cell kroppar (se A). Spår till vänster visar normaliserade fluorescensutsläpp av Venus (grön) och eCFP (magenta). Spår till höger visar motsvarande ATeam FRET ratio. Observera att perfusion med 5 mM NaN3 i avsaknad av extracellulära glukos i 1 minut (grå stapel) inducerar en reversibel minskning av ATEAM FRET förhållandet, vilket indikerar en minskning av INTRACELLULÄR ATP koncentration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
För att säkerställa stabiliteten i preparatet och sensorn under långsiktiga experiment förhållanden, skivor uttrycker ATeam i nervceller eller astrocyter var ständigt parfymera med ACSF under längre perioder (> 50 min, n = 12 celler vardera, N = 3 OTCs från 3 hjärnor). Under dessa förhållanden, den ATeam FRET förhållandet inte ändras (figur 8). Exponera förberedelserna för CIS innehållande metaboliska hämmare ("kemisk ischemia", se tabell 1), däremot, resulterade återigen i den förväntade minskningen av ATEAM FRET förhållandet som observerats ovan.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg"> Figur 8: baslinje experiment som sysselsätter ATeam. Långsiktig ATeam FRET ratio Imaging i 14 olika celler under baslinjen villkor i nervceller (topp) och astrocyter (botten). Data togs under jämförbara förhållanden som andra experimentella data. I slutet av varje mätning, var kemisk ischemi framkallas av perfusion med CIS som anges av pilen. Obs: baseline ATeam FRET nyckeltal är stabila över tiden under baslinjen villkor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Nästa, Vi analyserade svaren från nervceller och astrocyter uttrycker ATeam 1,03Yemk till en ökning av den extracellulära kaliumkoncentrationen. Efter att ha etablerat en stabil baslinje, var neuroner perfunderade med en saltlösning där kaliumkoncentrationen ökades från 3 till 8 mm i 3 minuter (figur 9a). Denna manipulation gjorde dock inte resultera i en detekterbar förändring i ATeam FRET förhållandet (n = 56 celler i N = 5 skivor). För att säkerställa att sensorn reagerade på en förändring i ATP-nivåer, var skivor sedan igen utsätts för en varaktig period av kemisk ischemi framkallade genom att ersätta E-acsf av CIS. Kemisk ischemi resulterade i en snabb minskning av ATEAM FRET förhållandet till en ny, stabil nivå, vilket indikerar nominell utarmning av ATP efter 2-3 min (figur 9a).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg"> Figur 9: representativa experiment som illustrerar förändringar i ATP-nivåerna i nervceller och astrocyter. (A,B): bilder till vänster visar ATEAM fluorescens från nervceller och astrocyter ligger i hippocampus CA1 regionen organotypic skivor. Spår till höger representerar tidsfördröjning inspelningar av ATeam FRET förhållandet erhålls från en ROI placerad över en enda cell kropp. I båda experiment, skivor var först utsattes för en ökning av den extracellulära kaliumkoncentrationen i 3 minuter (se bar), följt av en slutlig exponering för kemisk ischemia. Observera att medan neuroner inte svarar på höjden av extracellulära kalium (a), astrocyter reagerar med en ökning av ATP (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Samma experimentella protokoll utfördes med skivor, där ATeam 1,03Yemk uttrycktes i astrocyter. I motsats till vad som observerades i nervceller, astrocyter reagerat på ökningen av extracellulära kalium genom en reversibel ökning av ATeam bandet förhållandet, vilket tyder på en ökning av intracellulära ATP nivåer (n = 70 celler i N = 5 skivor) (figur 9B). Efterföljande exponering för kemisk ischemi resulterade, som väntat, i en stor droppe i ATEAM FRET förhållandet, indikativt för nominell utarmning av intracellulära ATP (figur 9B).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Vi beskriver ett protokoll för cell-typ specifikt uttryck för den genetiskt kodade FRET-baserade sensorn ATeam 1,03Yemk i organotypic slice kulturer av musen framhjärnan. Dessutom visar vi hur man använder denna sensor för dynamisk avbildning av cellulära ATP nivåer i nervceller och astrocyter.

Avbildning av intracellulära ATP i Organotypic vävnad skivor av musen hjärnan med hjälp av bandet-baserade sensorn ATeam 1,03Yemk

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Här visar vi hur man använder den ATP-känsliga FRET-sensorn ATeam 1.03 YEMK för dynamiska mätningar av förändringar i neuronala och astrocytiska ATP-nivåer i organotypiskt odlade mus hippocampus skivor. Den största fördelen med denna teknik är att den som kan studera energimetabolism i levande hjärnvävnad i en kontrollerad inställning, en miljö med höga sensoruttrycksnivåer. Denna teknik kan bidra till att få insikter i pathomechanisms, underliggande sjukdomar, eller hjärnskador, till exempel, orsakas av energibrist, som ischemisk stroke.Det kan, i princip, användas för att studera ATP-nivåer, inte bara i hjärnvävnad, men i andra organ också. För att framgångsrikt köra detta experiment, Det är viktigt att utföra alla steg som deltar i odling av vävnaden extremt försiktig och att upprätthålla sterilitet. Dessutom krävs viss kunskap om cellulär fluorescerande avbildning.Vävnadshantering i de flesta sofistikerade tillvägagångssätt och en visualisering är avgörande för att förstå de korrekta förfarandena. Detsamma gäller för bildexperiment. Demonstrera förfarandet kommer att Rodrigo Lerchundi, en postdoc, och Na Huang, en Master student från laboratoriet.I en iskall Petriskål fylld med ACSF, placera hjärnan på ett filtermembran. Separera halvkloten och utför ett parasagittal snitt i en vinkel på 45 grader. Fixera en halvsfär vid Vibratome vävnadsstadiet med superlim, och överför omedelbart vävnadsblocket till Vibratome-badet som innehåller iskall ACSF bubblade med 5%koldioxid och 95%-syre.Rikta in vävnaden i Vibratome-badet. Håll den andra hjärnhalvan i iskall ACSF tills skivning. Justera Vibratome för att skära skivor vid 250 till 400 mikrometer.Efter styckning av skiva, identifiera hippocampus formationen baserat på dess typiska morfologiska utseende och isolera den med hjälp av hypodermiska nålar, hålla den del av hjärnbarken intill hippocampus. Placera skivan på ett nät i ACSF, värms till 34 grader Celsius och bubblade med 5% koldioxid och 95% syre tills alla skivor samlas in. Överför skivorna till laminär flödesskåpet för att fortsätta under sterila förhållanden.Med en inverterad, steril, glas Pasteur pipetter, försiktigt överföra skivor från ACSF i en av de förvörda Petriskålar fyllda med steril Hanks'saltlösning. Byt pipetten och överför skivorna till den andra odlingsskålen. Upprepa processen fem gånger totalt.Överför så lite HBSS som möjligt till följande odlingsplattor. Med hjälp av en pipett, försiktigt placera en skiva i taget på toppen av kulturinsatsen. Undvik turbulenser i pipetten, och vänta tills skivan sjunker till spetsen av Pasteurpipett.Upprepa processen för varje segment. Placera två skivor på ett membran. Ta försiktigt bort eventuellt överflödig Hank-lösning från insatsens överkant genom att använda en fin spets.Håll kulturerna i en befuktad inkubator på 5%koldioxid och 37 grader Celsius tills dagen för experimentet. Byt ut mediet varannan till var tredje dag. Utan att vidröra vävnaden, applicera 0,5 mikroliter av den utspädda vektorn direkt på toppen av varje skiva.Slutligen, placera skivorna tillbaka i inkubatorn och underhålla dem där i minst sex dagar. Strax innan du startar ett experiment, överför ett skär som innehåller odlade skivor i den sterila huven, och placera den i en 30 millimeters maträtt som innehåller en milliliter organotypisk skiva kultur medium, eller minimalt essentiellt medium. Placera skålen under stereoskopet och fokusera på skivans yta.Använd två sterila injektionsnålar för att göra en kort korsskuren höger på de smala kanterna på en vald skiva, och i det övre lagret utan att skada vävnaden under. För att ta bort den förberedda skiva från skäret, håll kanterna på membranet med pincett och använda en steril skalpell för att göra raka, parallella skärningar till membranet, bildar en kvadrat eller en triangel med skiva i mitten. Om insatsen är värd för ytterligare skivor, överför den tillbaka till den ursprungliga plattan och in i inkubatorn.Mediets ytspänning kommer att förhindra dess läckage på membranets yta. Förbered experimentell ACSF och få ett pH-värde på 7,4 genom att bubbla det med 95%syre och 5%koldioxid genom ett infogat slangar som är anslutet till karbogentillförseln i minst trettio minuter. Håll saltlösningen bubblad under hela experimentet.Slå därefter på monokronometerns fluorescerande ljuskälla. Överför den organotypiska skiva kulturen i den experimentella kammaren. Placera ett rutnät ovanpå den organotypiska skiva kulturen med ramen ner, inte röra kulturen, och trådarna upp, röra vid membranet.Placera kammaren på mikroskopet scenen och anslut den till perfusion systemet. Slå på peristaltiska pumpen vid ett flöde på 1,5 till 2,5 milliliter per minut. Kontrollera att det inte finns någon läcka av perfusionssystemet.Med hjälp av transmissionsljus, för den odlade skivan i fokus och identifiera det område där experiment ska utföras. Innan du startar bildexperiment ska du vänta i minst 15 minuter så att skivorna kan anpassas till saltlösningsförhållandena och slå sedan på kameran och bildhanteringsprogrammet. Excitera givaren fluorescerande protein vid 435 nanometer.Ställ in exponeringstiden på mellan 40 till 90 millisekunder. Sätt sedan in den dichroiska spegeln och filtren i strålklystnadsenheten. Dela fluorescensutsläppet vid 500 nanometer med en avgasbildsdelare och använd bandpassfilter vid 482 plus eller minus 16 och 542 plus eller minus 13,5 nanometer för att ytterligare isolera givaren och acceptorfluorescensen.Välj en region av intresse som uppenbarligen saknar cellulär fluorescens för bakgrund subtraktion. Cirkel enstaka strukturer av märkt vävnad i bilden på skärmen för att skapa ROIs. Ställ in frekvensen för bildförvärv och den totala inspelningstiden.För experiment som är längre än 30 minuter rekommenderas en förvärvsfrekvens på 0,2 till 0,5 Hertz för att förhindra fototoxicitet. Därefter startar inspelningen. För att framkalla förändringar i intracellulär ATP, växla perfusionsröret från standard ACSF till en saltlösning som innehåller metaboliska hämmare, till exempel, kemisk ischemilösning.Alternativt, använd en saltlösning med förhöjd kaliumkoncentration vid åtta millimolar för att efterlikna frisättning av kaliumjon från aktiva nervceller. Direkt efter inspelningarna, utbyte den experimentella ACSF med högar-buffrade ACSF. Överför sedan inspelningskammaren som innehåller skivakulturen till det konfokala laserskanningsmikroskopet.Ta Z stack bilder på högsta Z-upplösning möjligt vid den givna optiska konfigurationen. I detta protokoll, tio dagar efter en transduktion, nervceller uttrycker ATeam 1.03 YEMK hittades vid hög densitet i neocortex av odlade vävnad skivor på djup av upp till 50 mikrometer under skiva yta. Jämförbara resultat uppnåddes i hippocampus.För astrocyter, ATeam 1.03 YEMK uttrycktes under kontroll av den mänskliga glialt fibrolary sura protein promotor, och organotypic skivor uttrycker ATeam 1.03 YEMK i hippocampus nervceller valts ROIs representerar somata av pyramidala celler. Efter att ha exponerat skiva till 5 millimolar natriumazid i avsaknad av extracellulära glukos i en minut, var motsatta förändringar induceras i utsläppsintensiteten av FRET paret. En reversibel minskning av ATeam FRET-kvoten observerades också.Långsiktiga ATeam FRET-förhållande i 14 olika celler under baslinjeförhållanden i nervceller och astrocyter visar att ATeam är en pålitlig och stabil sensor. Observera att den kemiska ischemin resulterade i den förväntade starka nedgången i ATeam-förhållandet i båda celltyperna i slutet av detta experiment. En ökning av den extracellulära kaliumkoncentrationen från tre till åtta millimolar i tre minuter resulterade inte i en detekterbar förändring av nervcellerna som uttrycker ATeam 1.03 YEMK.Däremot reagerade astrocyterna på ökningen av extracellulärt kalium genom en reversibel ökning av ATeam FRET-kvoten, vilket indikerar en ökning av intracellulära ATP-nivåer. Återigen orsakade kemisk ischemi en omedelbar minskning av ATeam-förhållandet, vilket visar att sensorn kan upptäcka förändringar i ATP. När man försöker FRET-baserad cellulär avbildning som beskrivs här, är det viktigt att tänka på att produktionen av högkvalitativa skivor i organotypiska kulturer är ett viktigt steg.Dessutom krävs noggrant avlägsnande av det gliala ärret och avbildning på expertnivå. Efter detta förfarande, man bör också kunna utföra experiment införliva olika andra FRET-baserade nanosensor för cellulära metaboliter. Till exempel, de för glukos eller laktat.Sist, men inte minst, måste det betonas att relevanta handlingar för skydd av djur alltid måste iakttas. Detta gäller också för de effektiva lagar som reglerar hanteringen av genetiskt modifierade organismer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse avbildning av Neuroblast Migration i akuta skivor av vuxen mus framhjärnan

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Kopplade Hela Cell Inspelningar i Organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselektiv Biolistic Inriktning i Organotypic Brain skivor med hjälp av en modifierad Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerga Fibrer i ryggmärgen hos möss med hjälp av CLARITY / CUBIC teknik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Djupgående fysiologisk analys av Bestämda cellpopulationer i akut vävnadssnitt av Mouse Vomeronasalorganet

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse-konfokalbildning av migrerande neuroner i organotypisk skivkultur av embryonalt mushinne<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering och levande avbildning av Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjärnan skivor med hjälp av Adeno-associerade Virus och konfokalmikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Två-foton avbildning av mikrogliala processerna attraktion mot ATP eller Serotonin i akut hjärnskada skivor

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Märkning och avbildning av amyloida plack i hjärnvävnad med hjälp av naturliga polyfenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...