Name: imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Yazarlar uzman teknik yardım için Claudia Roderigo ve Simone Durry teşekkür etmek istiyorum. Dr. Niklas J. Gerkau ve M.Sc. Joel Nelson'a organotipik dilim kültürlerin hazırlanmasında yardımcı olan yardımcılarından dolayı teşekkür ederiz. Yazarın laboratuvarındaki araştırmalar Alman Araştırma Birliği (DFG) tarafından finanse edildi; 2795 İçİn: Ro 2327/13-1 ve SPP 1757: Ro 2327/8-2 CRR için; ve SPP 1757: Genç Glia Start-Up rl finansman).

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan. Yazarlar, video makalesinde kullanılan araçları üreten Nikon Microscope Solutions, Düsseldorf, Almanya tarafından açık erişimli yayın sağlayan mali destek aldı. Şirket ne burada sunulan deneylerin tasarımında, ne yürütülmesinde, ne veri işlemede, ne de el yazması yazıda yer aldı.

Burada, ATeam1.03YEMKhücre tipi özel ifade için bir prosedür göstermek , bir FRET tabanlı, genetik olarak kodlanmış nanosensor14, fare beyninin organotipik doku dilimi kültürlerde astrosit veya nöronlarda ATP düzeylerinde değişikliklerin ölçümü için15. Örnek kayıtlarda, hücre dışı potasyum konsantrasyonundaki artışın nöronlardaki ATP konsantrasyonlarında bir değişikliğe yol açmadığını, astrositik ATP düzeylerinin ise bu manipülasyona yanıt olarak yükseldiğini gösteriyoruz. Ayrıca, sonuçlarımız hücre metabolizmasının inhibisyonu üzerine, ATeam1.03YEMK FRET oranının her iki hücre tipinde de hızla düştüğünü ve hücre içi ATP'de hızlı bir düşüş olduğunu göstermektedir.
Organotipik dilim kültürlerinde ATeam1.03YEMK ifadesi en az 7-10 gün kontrollü koşullarda kültürde doku bakımı gerektirir. Alternatif olarak, ATeam1.03YEMK da akut izole beyin dokusu dilimleri ve farelerin optik sinirlerde ATP ölçümü için istihdam edilebilir13,15. Ancak akut izole dokudaki ölçümler, transgenik hayvanların neslini veya viral vektörlerin beyne stereotaktik bir şekilde uygulanmasını, hayvan deneyleri ve sıkı hayvan bakım protokollerini içerir. Bu bağlamda, organotipik doku dilimi kültürlerde ATeam1.03YEMK ifadesi yararlı ve değerli bir alternatif22,23temsil eder. Uzun yıllardır, organotipik doku dilimi kültürleri nöral özellikleri, bağlantı ve geliştirme24,25,26çalışma için kurulmuş bir model sistemi olarak hizmet vermektedir. Onlar sadece genel doku mimarisi ve laminasyon korumak değil(Şekil 1),aynı zamanda üstün erişilebilirlik ve deneysel koşulların doğrudan kontrolü gibi hücre kültürlerinin tercihli özellikleri ev sahipliği. Organotipik doku dilimi kültürleri de rutin viral vektörler27kullanarak yabancı genleri ifade etmek için istihdam edilmektedir. Viral vektörler çeşitli beyin dokusu içine transgenler teslim bildirilmiştir16,28. Adenoviral vektörler glial hücrelerde yüksek ekspresyon indükler, ama hipokampal nöronlar16değil , ve glial reaktivite üretebilir17. Burada kullanılan Adeno ilişkili viral vektörler iyi bir alternatif olarak ortaya15, ve bunların etkinliği de in vivo29gösterilmiştir .
Esas olarak nöronal özelliklerin incelenmesinde kullanılırken, son çalışmalar da astrositlerin analizi için organotipik doku dilimi kültürleri istihdam edilebilir olduğunu ortaya kurduk. Kültürlü dilimler genellikle reaktif astrositler bir tabaka ile kaplıdır19,30 (Şekil 5),ancak astrositler daha yerli, non-reaktif morfoloji ve sitomimari daha derin katmanlarda sergiler19,30 ( Şekil5). Bu çalışmada, dış glial skar mekanik kaldırma için bir prosedür tarif, hangi uygun organotipik doku katmanları içinde yerli astrositlerin daha iyi deneysel ve optik erişilebilirlik ile sonuçlanır. Ayrıca, kaldırılması organotipik dilimlerin daha derin katmanlarında ifade etkinliğini artırır; glial yara izi çıkarılmazsa, AEV'lerin transdüksiyonu yüzeysel hücre tabakaları ile sınırlı olabilir.
Doku dilimleri üzerinde deneyler yaparken çeşitli dış mekanik faktörlerin göz önünde bulundurulması gerekir. Banyo perfüzyon hızındaki bir değişim tüm hazırlık hareketlerini tetikleyebilir ve/veya odak değişikliklerine neden olabilir ve sensör sinyalinin yapay geçici değişikliklerine neden olabilir. Ayrıca, hem astrositler ve nöronlar gibi yüksek perfüzyon oranları 32 tarafından empoze mekanik deformasyona yanıt bildirilmiştir32,33. Elimizde, güvenilir bir peristaltik pompa kullanarak, doku ve amaç (menisküs) arasında tuzlu küçük ve kararlı hacimleri korumak ile birlikte burada kullanılan perfüzyon hızı (1.5-2.5 mL/dk) temel koşullar altında istikrarlı bir FRET sinyali ile sonuçlanır; Şekil 8).
Bu çalışmada, aTeam1.03YEMK ile FRET tabanlı görüntüleme nöronlar ve astrositlerde ATP düzeylerini izlemek için istihdam edilebilir olduğunu göstermektedir. Hücresel ATP ölçümü için daha önce tanıtılan alternatif bir araç sözde luciferin-luciferase assay34,35,36,37. Bu yaklaşım, ancak, biyolüminesans görüntüleme dayanmaktadır ve sadece kısmen yüksek arka plan gürültü düzeyleri nedeniyle oldukça düşük zamansal ve mekansal çözünürlük sağlar. Son yıllarda rutin olarak kullanılan bir diğer yöntem de iyona duyarlı florofor magnezyumyeşili 38,39,40kullanarak hücre içi magnezyum konsantrasyonundaki değişikliklerin görüntülenmesiydi. Bu yaklaşım, ATP tüketiminin ortak faktörlü magnezyumsalınımına yol açan gözlemle ilgilidir. Magnezyum yeşili ile görüntüleme, atp düzeylerindeki değişikliklerin sadece ikincil bir tahminini sağlar. Ayrıca, magnezyum yeşili de hücre içi kalsiyum değişikliklere duyarlı, bu yöntem ile elde edilen sonuçları yorumlarken başka bir zorluk tanıtAn.
Hücresel metabolitlerin doğrudan görüntüleme için genetik kodlanmış nanosensörlerin son gelişme, bu nedenle, ileriye doğru büyük bir adım temsil11,12. Hücre içi ATP36,41,42,43ölçümü için kullanılabilir birkaç farklı sensörler oluşturuldu. Bunlar arasında oranmetrik floresan ATP göstergesi "QUEEN"41 yanı sıra PercevalHR, hangi ATP algılar:ADP oranı42. İkinci sonda hücrelerin enerji durumunun incelenmesi için değerli bir araç olsa da, pH42'dekideğişikliklerin eşzamanlı olarak ölçülmesini gerektirir.
ATeam çeşitli varyantları var olan bir nanosensor, hangi - diğerleri arasında - ATP14için bağlayıcı yakınlık farklıdır. In vitro, ATeam1.03YEMK 37 °C'de 1.2 mM Kd sergiler, hipotalamus ve serebellum 34 hipokampus37 arasında değişen farklı nöronal hücre tiplerinde belirlenen hücresel ATP düzeylerine yakın, hipotalamus37,44,45. Cuvette ölçümlerinde sıcaklığın 10 °C düşürülmesi, ATeam1.03YEMK'ın ATP'ye olan bağlanma yakınlığında önemli bir azalmaya yol açarak,14numaralı oda sıcaklığında hücresel görüntüleme için ideal olmayabileceğini düşündürmektedir. Daha önceki çalışmamız15,ancak, davranış ve yanıt ATeam1.03YEMK farklı manipülasyonlar nöronlar ve astrositler ifade benzer fizyolojik ve oda sıcaklığında, sensör her iki koşulda hücre içi ATP düzeylerinin güvenilir belirlenmesine olanak sağladığını gösteren gösterdi. Buna ek olarak, daha önceki deneylerimizde ATeam1.03YEMK'ın pH duyarlılığıelealınmıştır. Düşük mM aralığındaKi Kd bir sorun sayılsa, alternatif ATeam varyantları14kullanılabilir , bunların arasında ATeam'in kırmızı vitesli varyantları ("GO-ATeam")43.
ATeam1.03YEMK kullanarak yapılan deneyler, ekstrasellüler potasyum konsantrasyonunda sadece birkaç mM (3-8 mM) artış, organotipik dilim kültüründeki astrositlerde ATeam1.03YEMK oranında geçici bir artışa yol açtığını göstermektedir. Bu gözlem önceki çalışmalarda doğrular15,46 ve açıkça astrositler aktif nöronlar tarafından atp üretiminde bir artış ile potasyum salınımına yanıt gösterir, çoğunlukla Na bir uyarılma sonucu muhtemel+/ -ATPase ve Na+/ HCO3- cotransporter, sırasıyla47,48. Bunun aksine, nöronlar bir yanıt göstermedi, hangi önceki çalışma ile uyumlu da15. Her iki hücre tipi, ancak, hızlı ve güçlü hücresel glikoliz ve mitokondriyal solunum inhibisyonu için tepki15önce gösterildiği gibi . Kimyasal iskemi koşulları altında, ATeam FRET oranları hücresel ATP nominal tükenmesi gösteren, yeni bir istikrarlı seviyeye düştü. İkinci sonuç hem nöronlar hem de astrositler de sinaptik aktivasyon veya nörotransmitterlerin uygulanması ile ek uyarılma olmadan sabit devlet koşulları altında ATP ilgili bir tüketim sergilemek düşündürmektedir. Birlikte ele alındığında, genetik olarak kodlanmış nanosensörler ile FRET tabanlı görüntüleme, aralarında ATeam1.03YEMK,farklı koşullar altında hücre içi ATP düzeyleri ve hücresel ATP tüketimi değişiklikleri sorumlu hücresel süreçleri açıklamak için değerli bir yaklaşım sağlayacaktır sonucuna varıyoruz.

Nöronların uyarıcı elektriksel aktivitesi büyük ölçüde plazma zarları arasında sodyum (Na+) ve potasyum (K+)gibi katyonların akı dayanmaktadır. Bu nedenle sinyalizasyon için bu iki iyonun elektrokimyasal degradelerinin bakımı gereklidir. Bu hücresel Na+/ K+-ATPase (NKA), her yerde ifade elektrojenik transmembran pompa tarafından gerçekleştirilir, hangi ekstrüzyon 3 Na+ hücre dışıuzaydan karşılığında hücre den extrudes , taşımadöngüsü1 başına ATP bir molekülün tüketimini gerektiren 1 . NKA ek olarak, plazma membran Ca2 +-ATPase, hücre içi Ca2 + homeostaz ve aktivite kaynaklıakını2 aşağıdaki ihracat için hayati önem taşımaktadır dahil olmak üzere birkaç diğer ATP tüketen iyon taşıyıcıları vardır. Presinaptik veziküllerde, bir vakuoler tip H+-ATPaz (v-ATPAz) bu bölmeye nörotransmitter alımı için gerekli proton gradyanı oluşturur3.
Nöronların aktivitesi böylece ATP önemli miktarda gerektirir iken4, onlar enerji depolama için önemli bir kapasite sergilemez. Bunun yerine, onlar komşu astrositler ile metabolik etkileşimleri güvenmek gibi görünüyor, beyinde büyük glikojen depoları5. Bu astrositik glikojen gerçekten nöronal enerji ihtiyaçlarının desteklenmesinde önemli bir rol oynadığı ileri sürülmüştür; ve iki hücre türleri arasında bu önerilen nöro-metabolik bağlantı önemli bir fenomen nöronal aktivite ye yanıt olarak ATP üretimini artırmak için astrositkapasitesi6,7,8. Bu hipotez, astrosit-nöron laktat mekiği olarak bilinen (ANLS), diğer çalışmalar da uyarılma yanıt olarak glikolikendi oranını artırabilir kanıt sağlamıştır çünkü9,10, nöro-glia etkileşimi çalışma için daha fazla yöntem ve yaklaşımların gerekliliğini yansıtan.
Nöro-glia metabolik etkileşimleri açıklamak için nöronlar ve astrositlerde hücresel enerji metabolizması ve ATP düzeylerinin araştırılması uzun beyin dokusunda yaşayan hücrelerde metabolit konsantrasyonlarında değişikliklerin tespiti için uygun probların eksikliği tarafından engel olmuştur. Son on yılda, ancak, atp, laktat, pirüuvat ve diğerleri için sensörler de dahil olmak üzere farklı metabolitleri için yeni araçlar ve yeni genetiği kodlanmış floresan probların geliştirilmesinde bir dalgalanma sağlamıştır11,12. Bu araçları kullanarak, hücresel ATP tüketimi ve tek hücre düzeyinde hücresel enerji düzeylerindeki değişiklikler ve bozulmamış beyindokusu13hücre tipi özel bir şekilde ilgili sorulara doğrudan hitap etmek mümkündür.
Bu çalışmada, kültürlü organotipik beyin dilimlerinin nöronlar ve astrositleri üzerinde sitosolik ATP dinamiklerini görselleştirmek için bir prosedür açıklıyoruz. Biz genetik olarak kodlanmış ATP-nanosensor ATeam1.03YEMK (14) nöronlar ve birkaç hafta hücre kültüründe hücre kültüründe tutulabilir fare beyin dilimleri astrositler hücre tipi özel ifade için adeno ilişkili viral vektörler (AAV) nasıl istihdam göstermek15. Kültürlü doku dilimlerini kapsayan glial yaranın nasıl giderilenin bir prosedürü tanımlanmıştır, bu da altındaki organotipik doku katmanlarındaki hücrelerin optik erişilebilirliğini ve görüntülenmesini geliştirir. Son olarak, ATeam1.03YEMK'nin bu hazırlıkta hücresel ATP düzeylerindeki değişikliklerin FRET tabanlı görüntülemesini gerçekleştirmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Bu yöntem cerrahi beyin prosedürleri gerektirmez önemli avantajları barındırır, kültürlü beyin dilimleri sensör ve hücre tipi özgüllük yüksek düzeyde sağlar, diğer viral vektörler ile elektroporasyon veya transdüksiyon ile transfeksiyon gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında hücrelerde invazivlik veya stresi azaltarak10,16,17. Buna ek olarak, bu protokol atp14için daha düşük bağlama afinitesi sağlayan ATeam1.03 türevleri arasında diğer FRET tabanlı nanosensörler uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxyglucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L07338</td>
			<td>Non-metabolizable glucose analog</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-IMA-410-019 Argon laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>488 nm wavelength argon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3525.1</td>
			<td>Antioxidant, Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 483/32</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band pass filters 542/27</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter compatible emmision filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 455 LP</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter T 505 LPXR</td>
			<td>AHF Analysentechnik AG</td>
			<td></td>
			<td>Splitter dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scannig microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit)</td>
			<td>OriginLab corporation</td>
			<td></td>
			<td>Scientific graphing and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Caelo</td>
			<td>2580-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td>Perfusion chamber for live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394</td>
			<td>With Phenol Red for pH monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator HERAcell &#174; 150 with decontamination routine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAsafe KS/KSP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>26050088</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td>SVI Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.52i</td>
			<td>Wayne Rasban national Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software available in the public domain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP serie peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>High-precisionmulti-channel pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout software, Illustrator CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO/Life</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage</td>
			<td>custom build</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 16</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software for basic data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture insert</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7278</td>
			<td>Synthetic cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator Polychrome V</td>
			<td>Thermo Scientific/FEI</td>
			<td></td>
			<td>Ultra fast switching monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3 (Sodium Azide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &#8734;/0 WD 2.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Water Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements 4.50 advanced Research</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software. Upgraded version for FRET imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Pro Liquid GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS 6 Version 13.0</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71718-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v244</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td>
			<td>ETH Z&#252;rich</td>
			<td>v307</td>
			<td>Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WVIEW GEMINI optic system</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Emission Image Splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of intracellular atp in organotypic tissue slices of the mouse brain using the fret-based sensor ateam1.03yemk

Merkezi sinir sisteminde nöronal aktivite (CNS) adenozin trifosfat (ATP) dökümü tarafından sağlanan hücresel enerji yüksek bir talep çağrıştırıyor. Nöronların elektriksel sinyalizasyonu ile bozulan plazma membranları arasında iyon gradyanları yeniden yüklemek için ATP'nin büyük bir kısmı gereklidir. Astrositlerin - hızlı elektrik sinyalleri üretmeseler de - nöronal aktiviteye yanıt olarak ATP üretiminin arttığını ve onlara enerji metabolitleri sağlayarak aktif nöronları desteklediklerine dair kanıtlar vardır. Farklı metabolitler için genetik olarak kodlanmış sensörlerin son gelişimi artık nöronlar ve astrositler arasındaki bu tür metabolik etkileşimlerin incelenmesini sağlamaktadır. Burada, adeno ile ilişkili viral vektörler (AAV) kullanılarak fare hipokampus ve korteksin organotipik doku dilimi kültürlerinde ATP'ye duyarlı Floresan Rezonans Enerji Transferi(FRET-) sensörü ATeam1.03YEMK'ın hücre tipi spesifik ekspresyonu için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, bu sensörün hücre dışı potasyumdaki artışlar üzerine ve kimyasal iskemiin indüksiyonunu takip ederek nöronlar ve astrositlerdeki hücresel ATP düzeylerindeki değişikliklerin dinamik ölçümü için nasıl istihdam edilebildiğini (yani hücresel enerji metabolizmasının inhibisyonu) nasıl kullanabileceğini gösteriyoruz.

AAV vektörleri, canlı doku içindeki hücrelerdeki yabancı genleri seçici olarak ifade etmek için güvenilir bir araçtır16. ATeam1.03YEMK'ın sıralı kasetini ve belirli bir organizatörü içeren ATV'lerin doğrudan uygulanması, seçilen hücre tipinde sensörün yüksek bir şekilde ifade edilebilmelidir. DIV 14'te (transdüksiyondan ~10 gün sonra), insan sinapsin organizatörü altında ATeam'i ifade eden nöronlar, dilim yüzeyinin 50 μm altında, kültürlü doku dilimlerinin neokorteksinde yüksek yoğunlukta bulunurlar(Şekil 5A). Hipokampusta karşılaştırılabilir sonuçlar elde edilebilir (Şekil 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg"> Şekil 5: Kültürlü parasagittal organotipik beyin dilimlerinde ATeam1.03YEMK'yi ifade eden nöronların görselleştirilmesi. Soldaki görüntüler, kortikal dokunun43optik kesitinin (her biri 1,05 μm) ve(B)70 optik kesitinin (her biri 0,6 μm) genişletilmiş odak projeksiyonlarına karşılık gelmektedir. Sağdaki görüntüler aynı projeksiyonun ses görünümünü temsil eder. Hücreler, sağdaki renk skalası ile belirtildiği gibi dilim yüzeyine göre derinliklerine göre renk kodludur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Astrositlerde ATP düzeylerinin ölçülmesi için, ATeam1.03YEMK insan glial fibrillary asidik protein (GFAP) organizatörü kontrolü altında ifade edilir. Bu da hem neokortekste hem de kültürlü doku dilimlerinin hipokampusundaki hücrelerin etkin transdüksiyonuna yol açar(Şekil 6). Özellikle, dilim preparatlarının yüzeyine göre derinliğe bağlı olarak iki farklı morfolojik fenotip ayırt edilebilir. Birinci yüzeysel tabakada hücreler, ağırlıklı olarak yüzeye paralel olarak düzenlenmiş kalın birincil süreçler ile karakterize edilir. Bu hücreler güçlü bir şekilde örtüşen etki alanları sergilerler ve görünüşe göre reaktif astrositlerden oluşan yoğun bir örgü oluştururlar(Şekil 6). Daha derin katmanlarda (yüzeyden 30-60 μm), transduced astrositler büyük ölçüde küresel etki alanları oluşturan ince hücresel süreçler sergilerler ve morfolojileri daha önce bildirilen19,20,21 (Şekil 6)yerinde astrositlere benzer. Derin tabaka astrositlerin daha iyi transdüksiyonu ve bu derin katmanlara daha iyi optik erişim elde etmek için, glial skar dokusu Adım 4'te açıklandığı gibi çıkarılabilir.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg"> Şekil 6: Kültürlü parasagittal organotipik beyin dilimlerinde ATeam1.03YEMK'yi ifade eden astrositlerin görselleştirilmesi. Soldaki görüntü, 191 optik kesitten (her biri 0,45 μm) oluşan genişletilmiş bir odak projeksiyonuna karşılık gelir. İllüstrasyon amacıyla, glial yara astrositprojeksiyon dışında tutuldu. Sağdaki görüntüler, glial yaranın çıkarılmasından önce ve sonra aynı projeksiyonun ses görünümünü temsil eder. Hücreler, sağdaki renk ölçeklerinde belirtildiği gibi dilim yüzeyine göre derinliklerine göre renk kodludur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
ATeam1.03YEMK'ın başarılı bir şekilde ifade edileb1/400r, kullanılan organizatöre bağlı olarak nöronveya astrositlerdeki ATP düzeylerindeki değişikliklerin dinamik ölçümüne olanak tanır (yukarıya bakın). Deneyler sürekli E-ACSF ile perfüzyonlu deneysel bir banyoda yapıldı (%95 O2/5%CO2ile kabarmış). Hipokampal nöronlarda ATeam1.03YEMK'yi ifade eden organotipik dilimlerde, kayda başlamadan önce ilgi bölgeleri (ROI) seçilmiştir ve piramidal hücrelerin somata'sını temsil eder(Şekil 7A). Ayrıca, arka plan çıkarma için bir bölge seçilmiştir (Şekil 7A). Venüs'ün emisyon ve eCFP floresansı bu ROI'ların her biri için ayrı ayrı toplanmış ve zaman içinde floresan emisyon düzeyi olarak gösterilmiştir(Şekil 7B). Floresan'ı kontrol koşulları altında birkaç dakika boyunca kontrol altında kaydettikten sonra, hücre metabolizması dilim preparatını glikozsuz saline maruz bırakarak inhibe edildi ve 5 mM sodyum azid (NaN3)bir dakika süreyle eklendi (Şekil 7B). Bu manipülasyon, Venüs 'ün (527 nm) azalması ve eCFP (475 nm) emisyon artışı ile FRET çiftinin emisyon yoğunluğunda(Şekil 7B, sol paneller) zıt değişikliklere yol açarak, bu yönde bir artışa neden oldu. Venüs'ün floresan emisyonunu eCFP (FVenüs/FeCFP)ile bölerek FRET oranının hesaplanması, hücre içi ATP düzeylerindeki göreceli değişiklikleri yansıtan sinyallerle sonuçlandı, sözde "ATeam FRET oranı"(Şekil 7B, sağ panel). Kaydedilen tüm nöronlarda (N = 5 dilimdeki n = 70 hücre), NaN3 ATeam FRET oranında geri dönüşümlü bir azalmaya neden olarak hücre içi ATP düzeylerinde hücre içi atp düzeylerinde hücresel metabolizmanın inhibisyonu sırasında geri dönüşümlü bir düşüşe neden oldu.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg"> Şekil 7: Zaman atlamalı ATeam FRET oranı görüntüleme gösterimi. (A) Sol üst: Nöronlarda ATeam1.03YEMK ifade kültürlü bir organotypic hipokampal dilim in ca1 bölgesinin piramit tabaka ve stratum radiatum geniş alan floresan görüntüsü. Sağ üst: Solda belirtildiği gibi kutulu bölümün genişletilmiş görünümü. Beyaz çizgiler ilgi bölgeleri (ROI) 1-3 ca1 piramidal nöronların hücre organları temsil eden(B)analiz için seçilen. BG, arka plan düzeltmesi için seçilen YG'yi temsil eder. Alt: Venüs floresan emisyon (yeşil), eCFP (mor) ve Venüs/eCFP oranını temsil eden sözde renkli görüntüler. (B) RoIs 1-3'te nöronal hücre cisimlerini temsil eden zaman atlamalı kayıt (bkz. A). Soldaki izler Venüs (yeşil) ve eCFP (macenta) floresan emisyonnormalize göstermektedir. Sağdaki izler ilgili ATeam FRET oranını gösterir. 1 dakika boyunca ekstrasellüler glikoz yokluğunda 5 mM NaN3 ile perfüzyonun ATeam FRET oranında geri dönüşümlü bir azalmaya neden olduğunu ve hücre içi ATP konsantrasyonunda bir düşüş olduğunu unutmayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Uzun süreli deney koşullarında preparatın ve sensörün stabilitesini sağlamak için, nöronlarda veya astrositlerde ATeam'i ifade eden dilimler uzun süre ACSF ile sürekli olarak perfüzyona maruz kalmıştır (>50 dk; n = 12 hücre, Her biri 3 beyinden N = 3 OTC). Bu koşullar altında, ATeam FRET oranı değişmedi (Şekil 8). Preparatların metabolik inhibitörler içeren BDT'ye teşhir edilmesi ("Kimyasal iskemi", tablo 1'ebakınız), buna karşılık, yukarıda da görüldüğü gibi ATeam FRET oranında beklenen düşüşe yol açmıştır.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg"> Şekil 8: ATeam kullanan temel deneyler. Nöronlarda (üstte) ve astrositlerde (altta) temel koşullar altında 14 farklı hücrede uzun süreli ATeam FRET oranı görüntüleme. Veriler diğer deneysel verilerle karşılaştırılabilir koşullar altında alınmıştır. Her ölçümün sonunda, okla belirtildiği gibi BDT ile perfüzyon ile kimyasal iskemi ortaya çıkarıldı. NOT: Temel ATeam FRET oranları, temel koşullar altında zaman içinde sabittir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Daha sonra, ateam1.03YEMK ifade nöronve astrositlerin yanıtlarını ekstrasellüler potasyum konsantrasyonundaki artışa analiz ettik. Stabil bir bazin oluşturduktan sonra nöronlar potasyum konsantrasyonu 3 dakika boyunca 3 ila 8 mM'ye yükseltildiği bir tuzlu luk la perfüzyona bünyemiştir(Şekil 9A). Ancak bu manipülasyon, ATeam FRET oranında (N = 5 diliminden 56 hücre) saptanabilir bir değişikliğe yol alamayabilir bir durumdur. Sensörün ATP düzeylerindeki bir değişikliğe tepki göstermesini sağlamak için, dilimler BDT tarafından E-ACSF'nin değiştirilmesiyle ortaya çıkan sürekli bir kimyasal iskemi dönemine tekrar maruz kalmıştır. Kimyasal iskemi, ATeam FRET oranında yeni, kararlı bir seviyeye doğru hızlı bir düşüşe yol açarak ATP'nin 2-3 dakika sonra nominal olarak tükendiğını gösterir(Şekil 9A).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg"> Şekil 9: Nöronlar ve astrositlerdeki ATP düzeylerindeki değişiklikleri gösteren temsili deneyler. (A,B): Soldaki görüntüler, organotipik dilimlerin hipokampal CA1 bölgesinde bulunan nöron ve astrositlerden Gelen ATeam floresansını göstermektedir. Sağdaki izler, tek bir hücre gövdesi üzerinde konumlandırılmış bir Yatırım Getirisi'nden elde edilen ATeam FRET oranının zaman atlamalı kayıtlarını temsil eder. Her iki deneyde de, dilimler ilk olarak 3 dakika boyunca hücre dışı potasyum konsantrasyonunda bir artışa maruz kalındı (bkz. bar), ardından kimyasal iskemiye son maruz ilerler. Nöronlar ekstrasellüler potasyum yüksekliğine yanıt vermezken(A),astrositler ATP bir artış ile reaksiyona (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Aynı deneysel protokol, ATeam1.03YEMK'nin astrositlerle ifade edildiği dilimlerle gerçekleştirilmiştir. Nöronlarda gözlenenin aksine, astrositler ATeam FRET oranında geri dönüşümlü bir artış la hücre dışı potasyum artışına tepki göstererek hücre içi ATP düzeylerinde bir artış olduğunu (N = 5 dilimdeki n = 70 hücre)(Şekil 9B). Kimyasal iskemi sonraki maruz kalma sonuçlandı, beklendiği gibi, ATeam FRET oranında büyük bir düşüş, hücre içi ATP nominal tükenmesi göstergesi(Şekil 9B).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK at JoVE.com

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Fare ön beyninin organotipik dilim kültürlerinde genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı sensör ATeam1.03YEMK'ın hücre tipi spesifik ekspresyonu için bir protokol tanımladık. Ayrıca, nöronlar ve astrositlerde hücresel ATP düzeylerinin dinamik görüntülemeiçin bu sensörünasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

FRET tabanlı Sensör ATeam1.03YEMK kullanılarak Fare Beyninin Organotipik Doku Dilimlerinde Hücre İçi ATP'nin Görüntülenmesi

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Burada, organotipik kültüre duyarlı fare hipokampal dilimlerinde nöronal ve astrositik ATP düzeylerindeki değişikliklerin dinamik ölçümleri için ATP'ye duyarlı FRET sensörü ATeam 1.03 YEMK'ı nasıl çalıştırabileceğimizi gösteriyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı, kişinin canlı beyin dokusunda enerji metabolizmasını kontrollü bir ortamda, yüksek sensör ifade seviyelerine sahip bir ortamda inceleyebilmektir. Bu teknik patomekanizmaları, altta yatan hastalıklar, ya da beyin hasarı, örneğin, enerji yoksunluğu neden, iskemik inme gibi anlayışlar kazanmaya yardımcı olabilir.Bu, ilke olarak, ATP düzeyleri çalışmak için kullanılabilir, sadece beyin dokusunda, ama diğer organlarda da. Başarılı bir şekilde bu deneyi çalıştırmak için, son derece dikkatli doku culturing dahil tüm adımları gerçekleştirmek ve sterilite korumak için gereklidir. Ayrıca, hücresel floresan görüntüleme bazı bilgi gereklidir.Doku işleme en sofistike yaklaşım ve bir görselleştirme uygun prosedürleri anlamak için hayati önem taşımaktadır. Aynı görüntüleme deneyleri için de geçerlidir. Prosedürü gösteren Rodrigo Lerchundi, bir postdoc ve Na Huang, laboratuvardan bir Master öğrenci olacaktır.ACSF ile dolu buz gibi petri kabında, beyni bir filtre zarına yerleştirin. Hemisferleri ayırın ve 45 derecelik bir açıyla parasagittal kesim yapın. Vibratome doku aşamasında bir yarımküreyi süper yapıştırıcı ile düzeltin ve doku bloğunu hemen %5 karbondioksit ve %95 oksijen le kabardırılmış buz gibi ACSF içeren Vibratome banyosuna aktarın.Vibratome banyosundaki dokuyu hizala. Dilimleme kadar buz gibi ACSF ikinci yarımkürede tutun. Vibratomu 250 ila 400 mikrometrelik dilimler kesecek şekilde ayarlayın.Dilim kestikten sonra, tipik morfolojik görünüme göre hipokampal oluşumunu belirlemek ve hipodermik iğneler kullanarak izole, hipokampus bitişik serebral korteks parçası tutmak. Tüm dilimler toplanana kadar 34 santigrat dereceye ısıtılan ve %5 karbondioksit ve %95 oksijen ile kabarmış acsf bir örgü üzerine dilim yerleştirin. Dilimleri steril koşullarda devam etmek için laminar akış kabinine aktarın.Ters, steril, cam pasteur pipetile, acsf'deki dilimleri steril Hanks'tuz çözeltisi ile doldurulmuş önceden ısıtılmış Petri kaplarından birine nazikçe aktarın. Pipetdeğiştirin ve dilimleri ikinci kültür yemeğine aktarın. İşlemi genel olarak beş kez tekrarlayın.Mümkün olduğunca az HBSS'yi aşağıdaki kültür plakalarına aktarın. Pipet kullanarak, kültür kesici ucunun üstüne bir seferde bir dilimi nazikçe yerleştirin. Pipetteki türbülanslardan kaçının ve dilim Pasteur pipetinin ucuna inene kadar bekleyin.Her dilim için işlemi tekrarlayın. Bir membran üzerine iki dilim yerleştirin. İnce bir ipucu kullanarak fazla Hank çözeltisini kesici ucun üstünden dikkatlice çıkarın.Deney gününe kadar kültürleri %5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde tutun. Orta yı her 2-3 günde bir değiştirin. Dokuya dokunmadan seyreltilmiş vektörün 0,5 mikrolitresini doğrudan her dilimin üstüne uygulayın.Son olarak, dilimleri kuvöze geri yerleştirin ve en az altı gün daha orada saklayın. Bir deneye başlamadan hemen önce, kültür lüzumlu dilimleri içeren bir kesici ucu steril kaputa aktarın ve bir mililitre lik organotipik dilim kültür ortamı veya en az gerekli ortamı içeren 30 milimetrelik bir tabağa yerleştirin. Tabağı stereoskopun altına yerleştirin ve dilimin yüzeyine odaklanın.Seçilen dilimin dar kenarlarında ve üst tabakada altındaki dokuya zarar vermeden kısa bir çapraz kesim yapmak için iki steril hipodermik iğne kullanın. Uçtan hazırlanan dilimi çıkarmak için, cımbızla membranın kenarlarını tutun ve zara düz, paralel kesimler yapmak için steril bir neşter kullanın, ortada dilimle bir kare veya üçgen oluşturarak. Kesici uçek dilimler barındırıyorsa, orijinal plakaya ve kuluçka makinesine geri aktarın.Ortamın yüzey gerilimi membran yüzeyine sızmasını önleyecektir. Deneysel ACSF hazırlayın ve en az otuz dakika boyunca karbogen kaynağına bağlı bir eklenmiş boru ile% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit ile köpüren 7,4 bir pH elde. Tüm deney boyunca tuzlu yu kabarcıklı tutun.Sonra monokromatör floresan ışık kaynağı açın. Organotipik dilim kültürünü deneysel odaya aktarın. Çerçeve aşağı, kültür dokunmadan ve dikiş iplikleri yukarı, membran dokunmadan organotipik dilim kültürünün üstüne bir ızgara yerleştirin.Odayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve perfüzyon sistemine bağlayın. Peristaltik pompayı dakikada 1,5 ila 2,5 mililitre akış hızında açın. Perfüzyon sisteminin sızdırmazlık olmadığından emin olun.İletim ışığını kullanarak, kültürlü dilimi odak noktası haline getirin ve deneylerin yapılacağı alanı belirleyin. Görüntüleme denemelerine başlamadan önce, dilimlerin tuzlu koşullara uyum sağlaması için en az 15 dakika bekleyin, ardından kamerayı ve görüntüleme yazılımını açın. Donör floresan proteini 435 nanometrede heyecanlandırın.Pozlama süresini 40 ila 90 milisaniye arasında ayarlayın. Sonra dikroik ayna ve filtreleri ışın ayırıcı ünitesine takın. Floresan emisyonuna emisyon farkını emisyon görüntü ayırıcısıyla 500 nanometreye bölün ve donör ve alıcı floresanını daha fazla izole etmek için 482 artı veya eksi 16 ve 542 artı veya eksi 13,5 nanometre bant geçiş filtreleri uygulayın.Arka plan çıkarma için hücresel floresan yoksun görünen bir ilgi bölgesi seçin. RoI'lar oluşturmak için ekrandaki görüntüdeki etiketli dokunun tek yapılarını daire içine alın. Görüntü edinme sıklığını ve genel kayıt süresini ayarlayın.30 dakikadan uzun deneylerde fototoksisiteyi önlemek için 0,2 ila 0,5 Hertz elde etme sıklığı önerilir. Daha sonra, kaydı başlatın. Hücre içi ATP'de değişiklikler emdirmek için perfüzyon tüpünü standart ACSF'den metabolik inhibitörler içeren bir tuzlu tüpe, örneğin kimyasal iskemi çözeltisine geçirin.Alternatif olarak, aktif nöronlardan potasyum iyon salınımını taklit etmek için sekiz milimolar yüksek potasyum konsantrasyonu ile bir salin kullanın. Kayıtlardan hemen sonra, deneysel ACSF'yi yığınlarla arabelleğe alan ACSF ile değiştirin. Daha sonra dilim kültürünü içeren kayıt odasını konfokal lazer taramalar mikroskobuna aktarın.Verilen optik yapılandırmada mümkün olan en yüksek Z çözünürlüğünde Z yığını görüntülerini alın. Bu protokolde, transdüksiyondan on gün sonra, ATeam 1.03 YEMK'yi ifade eden nöronlar, dilim yüzeyinin 50 mikrometre altında, kültürlü doku dilimlerinin neokorteksinde yüksek yoğunlukta bulunmuştur. Hipokampusta karşılaştırılabilir sonuçlar elde edildi.Astrositler için, ATeam 1.03 YEMK insan glial fibrolary asidik protein organizatörü kontrolü altında ifade edildi, ve hipokampal nöronlar ATeam ifade organotipik dilimler 1.03 YEMK seçilen ROI piramidal hücrelerin somata temsil. Bir dakika boyunca ekstrasellüler glikoz yokluğunda 5 milimolar sodyum azit etüt sonra, ters değişiklikler FRET çiftinin emisyon yoğunluğu nda indüklenen edildi. ATeam FRET oranında da geri dönüşümlü bir düşüş gözlendi.Nöronlar ve astrositlerde temel koşullar altında 14 farklı hücrede uzun süreli ATeam FRET oranı ATeam'in güvenilir ve kararlı bir sensör olduğunu göstermektedir. Kimyasal iskemi, bu deneyin sonunda her iki hücre tipinde de ATeam oranında beklenen güçlü düşüşe neden olduğunu lütfen unutmayın. Hücre dışı potasyum konsantrasyonundaki üç ila sekiz dakika arasında bir artış ATeam 1.03 YEMK ifade nöronlarda tespit edilebilir bir değişiklik neden olmadı.Buna karşılık, astrositler ATeam FRET oranında geri dönüşümlü bir artış ile ekstrasellüler potasyum artışına tepki, hücre içi ATP düzeylerinde bir artış gösteren. Yine, kimyasal iskemi ATeam oranında hemen bir azalmaya neden, sensör ATP değişiklikleri algılayabilir gösteren. Burada açıklandığı gibi FRET tabanlı hücresel görüntüleme çalışırken, organotipik kültürlerde yüksek kaliteli dilim üretimi önemli bir adım olduğunu akılda tutmak önemlidir.Ayrıca glial yaranın dikkatli bir şekilde çıkarılması ve uzman düzeyinde görüntüleme gerekmektedir. Bu prosedürü takiben, bir de hücresel metabolitleri için farklı diğer FRET tabanlı nanosensor içeren deney yapmak gerekir. Örneğin, glikoz veya laktat için olanlar.Son olarak, hayvanların korunması için ilgili eylemlerin her zaman gözönünde ruyulması gerektiği vurgulanmalıdır. Bu aynı zamanda genetiği değiştirilmiş organizmaların işlenmesiyöneten etkili yasalar için de geçerlidir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioseçici Biolistik Modifiye Gen Tabancası kullanarak Organotipik Beyin Dilimleri Hedefleme

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Doğal Polifenol Curcumin Kullanarak Beyin Dokusunda Amiloid Plakların Etiketlenmesi ve Görüntülenmesi

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...