Name: migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen des National Institute of Mental Health (R01MH110438) und des National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) an AV unterstützt.

1. Kultur und Lagerung menschlicher periventrikulärer Endothelzellen
<ol><li>Bewahren Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen auf Kellermembranmatrix-beschichtet (siehe Materialtabelle) 6-Well-Platten in periventrikulärem Endothelzellmedium (E6-Medium mit 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 und 5 'M GABA) bei 37 °C und 5%CO2. Wechseln Sie das Medium jeden alternativen Tag.</li>
	<li>Kellermembranmatrix in 4 °C auftauen und eine 1:100-Lösung herstellen, indem man sie in kaltem DMEM/...

<ol>
	<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+From+Physiology+to+Disease+and+Back.">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).</li><li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain.">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).</li><li>Won, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain.">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nature Communications. 4, 2149 (2013).</li><li>Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+VEGF+sculpts+cortical+cytoarchitecture.">Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-derived+GABA+signaling+modulates+neuronal+migration+and+postnatal+behavior.">Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior.</a> Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).</li><li>Lewis, D. A., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+as+a+disorder+of+neurodevelopment.">Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).</li><li>Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibitory+neurons+and+schizophrenia.">Cortical inhibitory neurons and schizophrenia.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).</li><li>Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+dysfunction+in+psychiatric+disorders.">Interneuron dysfunction in psychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).</li><li>Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neocortical+interneuron+development+and+the+implications+for+neurodevelopmental+disorders.">Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders.</a> Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).</li><li>Treiman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+mechanisms+in+epilepsy.">GABAergic mechanisms in epilepsy.</a> Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).</li><li>Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+forebrain+endothelial+cells+for+cell-based+therapy+of+neuropsychiatric+disorders.">Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders.</a> Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , (2018).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient?.">Induced pluripotent stem cells: the new patient?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modelling+neurodevelopmental+disorders.">Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).</li><li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development.">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).</li><li>Vissapragada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+crosstalk+between+periventricular+endothelial+cells+and+neural+progenitor+cells+promotes+the+formation+of+a+neurovascular+unit.">Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit.</a> Brain Research. 1565, 8-17 (2014).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology.+The+Transwell+Migration+Assay.">Cell Biology. The Transwell Migration Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Renaud, J., Martinovic, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact.">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).</li><li>Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+chemotaxis+using+the+Dunn+direct-viewing+chamber.">Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber.</a> Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).</li><li>Kim, B. J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+mammalian+cell+chemotaxis.">Microfluidics for mammalian cell chemotaxis.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).</li></ol>

Hier haben wir drei In-vitro-Assays beschrieben, die zusammen eine quantitative Bewertung der periventrikulären endothelialen zellspezifischen Eigenschaften des Menschen ermöglichen. Diese Assays werden wertvoll sein, um mechanistische Einblicke in die Wechselwirkung menschlicher periventrikulärer Endothelzellen mit menschlichen Interneuronen zu gewinnen. Experimente mit Liganden, Inhibitoren oder Zellen mit genspezifischem Knockdown oder Überexpression werden molekulare Akteure identifizieren oder validieren, die en...

Endothelzellen bilden die Auskleidung der Blutgefäße und vermitteln wichtige Funktionen, die die Aufrechterhaltung der Durchlässigkeit der Gefäßwand, die Regulierung des Blutflusses, die Thrombozytenaggregation und die Bildung neuer Blutgefäße umfassen. Im Gehirn sind Endothelzellen Teil einer kritischen Blut-Hirn-Schranke, die den Materialaustausch zwischen dem Gehirn und dem Blutkreislauf streng steuert1. Unsere Studien in den letzten zehn Jahren haben neue neurogene Rollen von Gehirn endothel Zellen identifiziert, die signifikante Auswirkungen auf die Entwicklung des Gehirns und Verhaltenhaben 2,3,4,5. Wir haben gezeigt, dass das embryonale Vorderhirn der Maus durch zwei verschiedene Subtypen von Gefäßen, die pialen Gefäße und die periventrikulären Gefäße, die sich in Anatomie, Herkunft und Entwicklungsprofilunterscheiden,vaskularisiert wird 2 . Endothelzellen, die diese beiden Gefäßsubtypen aussäumen, weisen deutliche Unterschiede in ihren Genexpressionsprofilen auf. Während piale Endothelzellen meist Gene exprimieren, die mit Entzündungen und Immunantwort zusammenhängen, sind periventrikuläre Endothelzellen einzigartig angereichert in der Expression von Genen, die häufig mit Neurogenese, neuronaler Migration, Chemotaxis und Axonführung assoziiert sind3. Periventrikuläre Endothelzellen beherbergen auch einen neuartigen GABA-Signalweg, der sich vom traditionellen neuronalen GABA-Signalweg5unterscheidet. Gleichzeitig mit seiner Genexpression, periventrikuläre Endothelzellen wurden gefunden, um Migration und Verteilung von GABAergen Interneuronen in der sich entwickelnden Neocortex zu regulieren. Während der embryonalen Entwicklung durchlaufen periventrikuläre Endothelzellen eine Fernmigration entlang eines ventral-dorsalen Gradienten, um das periventrikuläre Gefäßnetz2,3zu etablieren. Diese Migrationsroute wird einen Tag später von Interneuren gespiegelt. Migrierende Interneuroner interagieren physisch mit dem vorgebildeten periventrikulären Gefäßnetz und nutzen es als Leitlinie, um ihr endgültiges Ziel im Neocortex zu erreichen. Periventrikuläre Endothelzellen dienen nicht nur als physikalisches Substrat, sondern dienen auch als Quelle für Navigationshinweise für die Migration von Neuronen. Periventrikuläre endotheliale Zellsekretierte GABA leitet interneuron Migration und reguliert ihre endgültigen Verteilungsmuster4. Defekte in interneuron Migration und Verteilung sind mit neuropsychiatrischen Störungen wie Autismus, Epilepsie, Schizophrenie und Depression6,7,8,9,10verbunden. Daher wird die Untersuchung der periventrikulären Endothelzellfunktionen und ihres Einflusses auf die interneuronische Migration im menschlichen Kontext entscheidend für die Bekämpfung der Pathogenese dieser Störungen.
Wir haben menschliche periventrikuläre Endothelzellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen in unserem Labor11mit induzierter pluripotenter Stammzelltechnologie (iPSC)12,13erzeugt. Um zu validieren, ob menschliche periventrikuläre Endothelzellen die periventrikulären Endothelzellen der Maus originalgetreu imitieren und ihren Einfluss auf die interneuronische Migration quantitativ bewerten können, entwickelten wir drei In-vitro-Assays: einen Fernmigrationstest, einen Co-Kultur-Migrationstest und einen Chemo-Attraktions-Assay. Hier beschreiben wir Protokolle für diese Assays im Detail. Alle drei Assays basieren auf der Verwendung von Silikonkultureinsätzen, um einen kleinen rechteckigen Zellfleck (mit festen Abmessungen) zu erstellen, der von zellfreiem Raum umgeben ist. Der Migrationsabstand wird ausgewertet, indem der Abstand zwischen den endlaufenden Positionen von Zellen vom Rand des rechteckigen Patches gemessen wird, der am Tag 0 umrissen wurde. Im Fernwanderungstest werden menschliche periventrikuläre Endothelzellen als Pflaster in der Mitte einer 35-mm-Schale ausgesät, und die von den Zellen über einen langen Zeitraum zurückgelegten Entfernungen werden berechnet. Im Co-Kultur-Migrationstest werden menschliche periventrikuläre Endothelzellen mit menschlichen Interneuronen als ein Pflaster in einer 35-mm-Schale mitgesät. Diese Einrichtung ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen direkter physischer Wechselwirkungen dieser beiden Zelltypen auf die Migrationsrate von Interneuronen. Der Chemo-Attraktionstest misst die Migration von Interneuronen als Reaktion auf chemoattraktive Hinweise, die von menschlichen periventrikulären Endothelzellen sezerniert werden. Interneuronen werden als rechteckiges Pflaster mit menschlichen periventrikulären Endothelzellen gesät und kontrollieren nicht-periventrikuläre Endothelzellen, die als ähnlich große Pflaster auf beiden Seiten gesät werden. Jede der Zellpflaster wird durch einen zellfreien Spalt von 500 m getrennt. Die Reaktion von Interneuronen wird durch Quantifizierung der Anzahl der Zellen, die zu periventrikulären endothelialen Zellen gewandert sind, im Vergleich zur Kontrolle nicht-periventrikulärer endotheliale Zellen bewertet.
Diese Assays liefern eine robuste Bewertung der funktionen der humanen periventrikulären Endothelzellen und ihres Einflusses auf die interneuronische Migration. Die neuartige Einrichtung des Fernassays und des Co-Kultur-Migrations-Assays bietet zellfreien Raum im Bereich von Zentimetern (1-1,5 cm), um die Erkennung von Fernmigration zu ermöglichen. Eine Zusammenfassung der Merkmale unserer Assays im Vergleich zu anderen populären Assays ist in Tabelle 1dargestellt. Gemeinsam werden die hier beschriebenen Assays als Plattform für die Bewertung "kranker" periventrikulärer Endothelzellen und Interneuronen dienen, die aus iPSCs von Hirnerkrankungen wie Schizophrenie, Autismus oder Epilepsie erzeugt werden. Diese Assays können auch verwendet werden, um zu bestimmen, wie unterschiedliche Bedingungen (z. B. Inhibitoren, Liganden, RNAi) die Zellmigration beeinflussen. Schließlich können diese Assays für andere Zelltypen optimiert werden, um die Migration über die Ferne, die Chemo-Attraktion oder die zellzellvermittelte Migration zu messen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase dissociation solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human &#946;-Tubulin antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>802001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD31 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CBL468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- MAP2 antibody</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>CH22103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-active Caspase 3 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB3623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control human endothelial cells</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control endothelial Cells Medium Supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEMF/12 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E6 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons base medium</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neuron Neural supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-ornithin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td>Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>Lifeline Cell Technologies</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>Component of control human endothelial cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FSX-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons

Die Rolle der Gehirnvaskulatur bei der Entwicklung des Nervensystems und der Ätiologie von Hirnerkrankungen gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit. Unsere jüngsten Studien haben eine spezielle Population von Gefäßzellen identifiziert, die periventrikulären Endothelzellen, die eine entscheidende Rolle bei der Migration und Verteilung von Vorhirn GABAerge Interneurons während der embryonalen Entwicklung spielen. Dies, gepaart mit ihren zellautonomen Funktionen, spielt auf neue Rollen von periventrikulären Endothelzellen in der Pathologie neuropsychiatrischer Störungen wie Schizophrenie, Epilepsie und Autismus an. Hier haben wir drei verschiedene In-vitro-Assays beschrieben, die gemeinsam die Funktionen periventrikulärer Endothelzellen und deren Wechselwirkung mit GABAergen Interneuronen bewerten. Die Verwendung dieser Assays, insbesondere im menschlichen Kontext, wird es uns ermöglichen, den Zusammenhang zwischen periventrikulären Endothelzellen und Hirnerkrankungen zu identifizieren. Diese Assays sind einfach, kostengünstig und reproduzierbar und können leicht an jeden haftenden Zelltyp angepasst werden.

Die Schritte zum Einrichten eines Ein-Brunnen-Kultureinsatzes in einer 35-mm-Schale sind in Abbildung 1dargestellt. Der Fernmigrationstest und der Co-Kultur-Migrationstest verwendeten einen Ein-Gut-Einsatz, um die gewünschte Anzahl von Zellen in der Mitte einer Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten 35-mm-Schale auszusäen. Am Tag 0 waren Zellen als rechteckiges Pflaster vorhanden (Abbildung 2A,C). In Bildern des...

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Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Wir präsentieren drei einfache In-vitro-Assays – den Fernmigrations-Assay, den Co-Kultur-Migrations-Assay und den Chemo-Attraktions-Assay,der die Funktionen menschlicher Stammzell abgeleiteter periventrikulärer Endothelzellen und deren Interaktion mit GABAerge Interneurons.

Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Dieses Protokoll beschreibt drei In-vitro-Assays, die gemeinsam die Funktionen menschlicher periventrikulärer Endothelzellen und deren Wechselwirkung mit humanen GABAerge Interneuronen bewerten. Die Ergebnisse dieser Assays werden einen kritischen Einblick in den Zusammenhang zwischen periventrikulären Endothelzellen und Hirnerkrankungen geben. Diese Assays sind einfach, kostengünstig und ermöglichen die Messung der Zellmigration im Bereich von Zentimetern, was durch andere bestehende Assays nicht erreicht wird.Defekte in der Migration und Verteilung von GABAerge Interneurons sind mit psychiatrischen Störungen, wie Autismus, Epilepsie, Schizophrenie und Depression verbunden. Daher ist es wichtig, die Wechselwirkung von periventrikulären Endothelzellen mit GABAergen Interneuronen im menschlichen Kontext zu untersuchen, um die Pathogenese dieser Störungen anzugehen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung menschlicher Zellen für den Test.Lassen Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen 70 bis 80 % Konfluenz erreichen, dann dissoziieren Sie sie entsprechend den Anweisungen des Manuskripts und zählen Sie sie mit der Trypan-Blau-Ausschlussmethode. Zur Vorbereitung menschlicher GABAerge Interneurons, warmer Zelldissoziationslösung und einem Aliquot von neuronalen Medien bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Dann das Medium aus jedem Brunnen, der Zellen enthält, ansaugen und mit einem Millimeter PBS pro Brunnen waschen.Lösen Sie die Zellen, indem Sie 0,5 Milliliter vorgewärmte Dissoziationslösung pro Brunnen hinzufügen und sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation einen Milliliter neuronalen Mediums pro Brunnen hinzufügen und die Zelllösung in eine 15-Milliliter-Konustube übertragen, die sanft trituiert, um Zellklumpen zu dissoziieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 380 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter neuronalen Mediums wieder auf.Zählen Sie dann die lebenden Zellen mit Trypan-Blau-Ausschluss. Bereiten Sie die Kontrolle menschlicher Endothelzellen vor, indem Sie die Zelldissoziationslösung und ein Aliquot von endothelialem Medium bei 37 Grad Celsius, 10 Minuten vor der Anwendung, erwärmen. Von jedem Brunnen absaugen und mit einem Milliliter PBS pro Brunnen waschen.Lösen Sie die Zellen, indem Sie 0,5 Milliliter der vorgewärmten Dissoziationslösung zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie dann einen Milliliter Endothelzellmedium pro Brunnen hinzu, um die Dissoziationslösung zu neutralisieren, und übertragen Sie die Zellen in eine 15 Milliliter konische Röhre. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für fünf Minuten, aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Endothelzellmedium.Verwenden Sie dann die Trypan-Ausschlussmethode, um die Zellen zu zählen. Bereiten Sie einen Brunnen Kultureinsatz vor, indem Sie drei Seiten eines Brunnens eines zwei gut Silikonkultureinsatzes mit einer sterilen Klinge schneiden. Entfernen Sie den Einsatz mit einer sterilen Pinzette und legen Sie ihn in die Mitte einer Poly-L-Ornithin- und Laminin-beschichteten Schale, und drücken Sie dann entlang der Kante des Einsatzes, um ihn an der Oberfläche zu befestigen.Drehen Sie die Schale vorsichtig auf den Kopf, um zu überprüfen, ob der Einsatz fest verkrüppft ist, und markieren Sie die Grenze des Einsatzfachs mit einem permanenten Schwarzmarkt mit einer ultrafeinen Spitze. Suspend humane GABAerge Interneuronen in neuronalen medium und humanen periventrikulären Endothelzellen und Endothelzellmedium in einer Konzentration von 30.000 pro 70 Mikroliter, dann Samen 70 Mikroliter der Zelllösung in jedem Brunnen Kultureinsatz. Fügen Sie der Neuronenschale einen Milliliter neuronales Medium hinzu, um den Bereich um den Einsatz zu füllen und das Trocknen der Beschichtung zu verhindern.In ähnlicher Weise fügen Sie der periventrikulären endothelialen Zellschale einen Milliliter Endothelzellmedium hinzu. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob sie nicht aus dem Einsatzraum auslaufen, und bebrüten sie dann 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Überprüfen Sie nach der Inkubation die Zellen erneut unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob sie richtig befestigt sind.48 Stunden nach der Aussaat den Einsatz vorsichtig mit einer sterilen Pinzette entfernen und die Zellen unter dem Mikroskop überprüfen, um zu überprüfen, ob die Zellschicht ungestört bleibt. Entfernen Sie das Medium aus dem Neuron und den periventrikulären endothelialen Zellschalen, und fügen Sie jedem Gericht einen Milliliter frisches Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für fünf Tage.Entfernen Sie dann das Medium, fixieren Sie die Zellen mit 4%PFA für 10 Minuten und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Um den Co-Kultur-Assay durchzuführen, setzen Sie 30.000 GABAerge Interneurons und 30.000 menschliche periventrikuläre Endothelzellen in 70 Mikroliter Co-Kulturmedium aus, säen Sie dann diese Zelllösung in einem einbrunnen insert-Fach. Entfernen Sie nach 48 Stunden den Einsatz.Inkubieren Sie die Co-Kultur bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für fünf Tage. Nach der Inkubation entfernen Sie das Medium, fixieren Sie die Zellen mit 4%PFA und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Um den Chemo-Attraktions-Assay durchzuführen, legen Sie einen drei Brunnenkultureinsatz in die Mitte einer Poly-L-Ornithin- und Laminin-beschichteten 35-Millimeter-Schale, drehen Sie die Schale auf den Kopf und markieren Sie die Grenze um das mittlere Fach des Einsatzes mit einem permanenten Marker mit einer ultrafeinen Spitze.Samen 30 000 GABAerge Interneurons in 70 Mikroliter neureszenumsimim, dann Samen 10.000 periventrikuläre Endothelzellen und 10.000 Kontroll-Endothelzellen und 70 Mikroliter ihres jeweiligen Mediums in den beiden Äußeren. Fügen Sie einen Milliliter Co-Kulturmedium entlang der Seite der Schale hinzu, um zu verhindern, dass die Beschichtung auf der Schale trocknet. Nach 48 Stunden entfernen Sie den Einsatz und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 36 Stunden.Nach der Inkubation entfernen Sie das Medium, fixieren Sie die Zellen und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Langstrecken- und Co-Kultur-Migrations-Assays wurden verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen periventrikulären Endothelzellen und GABAergen Neuronen zu untersuchen. Im Fernmigrationstest begannen Zellen als rechteckiger Patch am Tag Null, aber um 48 Stunden waren sie in den zellfreien Raum hinausgewandert.Immunzytochemische Färbung mit Anti-Active Caspase-3 Antikörper, ein Marker der Apoptose, zeigte kein apoptotisches Signal in den gesäten Neuronen. Im Co-Kultur-Migrationstest, als Interneuronen mit menschlichen periventrikulären Endothelzellen ko-saatiert wurden, legten Neuronen weiter entfernt ezielflich als bei interneuronen, die allein ausgesät wurden oder wenn sie mit Kontrollendothelzellen ausgesät wurden. Im Chemo-Attraktionstest wanderte eine signifikant höhere Anzahl von Interneuren in periventrikuläre Endothelzellen im Vergleich zu Kontrollen von Endothelzellen, was bestätigt, dass GABAerge Interneuronen selektiv auf chemoattraktive Cues reagieren, die von periventrikulären Endothelzellen sezerniert werden.Diese Assays können mit Liganden, Inhibitoren oder Assay-Arenen modifiziert werden, um mechanistische Einblicke in Wechselwirkungen menschlicher periventrikulärer Endothelzellen mit menschlichen Interneuronen zu erhalten. Sie können auch verwendet werden, um die Interaktion von menschlichen periventrikulären Endothelzellen mit anderen neuronalen Zellen zu untersuchen, wie von unserer Gruppe und anderen berichtet. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, den Einsatz fest auf der Schale zu fixieren und ihn während des gesamten Testes ungestört zu halten, da es sonst zu Zelllecks, Zellablösung oder Fehlausrichtung des Einsatzes mit der gezogenen Grenze führen kann.Unsere Arbeit hat eine zellautonome Rolle menschlicher periventrikulärer Endothelzellen bei der Pathogenese von psychiatrischen Störungen wie Schizophrenie, Epilepsie und Autismus gezeigt. Diese Assays ermöglichen daher die Beurteilung von erkrankten periventrikulären Endothelzellen, die von Patienten mit diesen Störungen mit der IPSC-Technologie abgeleitet wurden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Forschung

Neurowissenschaften

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Hemmende Synapse Formation in einer Co-Kultur Modell mit GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen und HEK293-Zellen, die GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellierung der Zika-Virus-Infektion des entwickelnden menschlichen Gehirns In Vitro mit Stammzellen abgeleitet zerebrale Organellen

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Methode für High-Speed Strecke Verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen in einem 96-Well-Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Unterteilung menschlicher Stammzellen-abgeleiteter Neuronen in vormontierte Mikrofluidchips aus Kunststoff

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-Differenzierung Replating von Human Pluripotent Stem Cell abgeleiteten Neuronen für High-Content Screening von Neuritogenese und Synapse Reifung

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyse von mitochondrialem Transport und Morphologie bei humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen bei erblicher spastischer Paraplegie

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...