Name: migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי פרסים מן המכון הלאומי לבריאות הנפש (R01MH110438) והמכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ (R01NS100808) ל AV.

1. תרבות ואחסנה של תאים אנושיים בעלי המוח האנושי
<ol><li>שמור על התאים האנושיים בעלי המוח האנושי על ממברדת המרתף מצופה (ראה טבלת חומרים) 6-צלחות היטב בינונית התא הפריטאלי (E6 medium המכיל 50 Ng/Ml-A, 100 Ng/mL FGF2 ו 5 ΜM נגבה) ב 37 ° צ' ו 5% CO2. . שנה בינונית כל יום חלופי</li>
	<li>הפשרת מטריצת קרום המרתף ב ...

<ol>
	<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+From+Physiology+to+Disease+and+Back.">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).</li><li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain.">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).</li><li>Won, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain.">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nature Communications. 4, 2149 (2013).</li><li>Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+VEGF+sculpts+cortical+cytoarchitecture.">Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-derived+GABA+signaling+modulates+neuronal+migration+and+postnatal+behavior.">Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior.</a> Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).</li><li>Lewis, D. A., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+as+a+disorder+of+neurodevelopment.">Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).</li><li>Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibitory+neurons+and+schizophrenia.">Cortical inhibitory neurons and schizophrenia.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).</li><li>Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+dysfunction+in+psychiatric+disorders.">Interneuron dysfunction in psychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).</li><li>Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neocortical+interneuron+development+and+the+implications+for+neurodevelopmental+disorders.">Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders.</a> Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).</li><li>Treiman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+mechanisms+in+epilepsy.">GABAergic mechanisms in epilepsy.</a> Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).</li><li>Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+forebrain+endothelial+cells+for+cell-based+therapy+of+neuropsychiatric+disorders.">Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders.</a> Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , (2018).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient?.">Induced pluripotent stem cells: the new patient?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modelling+neurodevelopmental+disorders.">Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).</li><li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development.">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).</li><li>Vissapragada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+crosstalk+between+periventricular+endothelial+cells+and+neural+progenitor+cells+promotes+the+formation+of+a+neurovascular+unit.">Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit.</a> Brain Research. 1565, 8-17 (2014).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology.+The+Transwell+Migration+Assay.">Cell Biology. The Transwell Migration Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Renaud, J., Martinovic, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact.">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).</li><li>Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+chemotaxis+using+the+Dunn+direct-viewing+chamber.">Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber.</a> Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).</li><li>Kim, B. J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+mammalian+cell+chemotaxis.">Microfluidics for mammalian cell chemotaxis.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).</li></ol>

כאן, תיארנו שלושה בתוך מבחנה שאומרת שביחד מספקים הערכה כמותית של המאפיינים הייחודיים לתא האנושי. מאמר זה יהיה בעל ערך בהשגת תובנות מכניסטיות לאינטראקציה של תאים אנושיים המוח האנושי עם האינטרנוירונים האנושיים. ניסויים באמצעות ליגרים, מעכבי, או תאים עם האתר הספציפי של הגן או ביטוי יתר יזהה ...

תאי האנדותל יוצרים את הציפוי של כלי הדם ומתווכים בתפקודים חשובים הכוללים תחזוקה של חדירות הקיר, רגולציה של זרימת הדם, צבירת טסיות דם והיווצרות כלי דם חדשים. במוח, תאי האנדותל מהווים חלק ממכשול מוחי קריטי ששולט בחוזקה על חילופי חומרים בין המוח לבין מחזור הדם1. המחקרים שלנו בעשור האחרון זיהו תפקידים נוירוגניים הרומן של תאים אנדותל המוח כי יש השלכות משמעותיות על התפתחות המוח והתנהגות2,3,4,5. הראינו כי העכבר מתחלקים מראש המוח הוא vascularized על ידי שני סוגי המשנה ברורים של כלי, כלי הקיבול ואת כלי הקיבול, כי שונים באנטומיה, מקור, ופרופיל התפתחותי2. תאים אנדותל בטנה תת אלה שני כלי הקיבול להראות הבדלים שונים פרופילים גנים שלהם ביטוי. בעוד בתאי האנדותל המהירה ביותר לבטא גנים הקשורים דלקת ותגובה חיסונית, תאים אנדותל המוח מועשר באופן ייחודי ביטוי של גנים הקשורים בדרך כלל נוירוגנזה, הגירה עצבית, כימוטווניות, ו אקסון הדרכה3. תאים המוח הבין-חדרית גם הבית הספר מסלול מאותת הרומן, כי הוא נבדל מתוך מסורתית עצביים המסורתית נגבה מסלול5. במקביל עם הביטוי הגנטי שלה, תאי האנדותל החדרית נמצאו כדי לווסת הגירה והפצה של הביננוירונים GABAergic בקליפת המוח המתפתח. במהלך פיתוח עובריים, תאי האנדותל החדרית עוברים הגירה למרחקים ארוכים לאורך מעבר-הדרגתי של הבנגאני-על כדי להקים את רשת כלי הדם הפריחדרית2,3. מסלול נדידה זה משתקף יום מאוחר יותר על ידי האינטרנוירונים. הגירה האינטרנוירונים אינטראקציה גופנית עם הרשת מראש בנוי כלי דם periventricular ולהשתמש בו כמו מחבל להגיע ליעד הסופי שלהם בקליפת המוח. בנוסף למשחק כמצע פיזי, תאי האנדותל החדרית משמשים כמקור לאותות הניווט לצורך העברת נוירונים. מדריכי הגירה של התאים הבין-מנחים להגירה ומסדיר את דפוסי ההפצה הסופיים4. פגמים בהגירה והפצה משויכים להפרעות נוירופסיכיאטריות כגון אוטיזם, אפילפסיה, סכיזופרניה ודיכאון6,7,8,9,10. לכן, לימוד של פונקציות תא אנדותל המוח והשפעתם על הגירה הבין-תאית בהקשר האנושי הופך קריטי לטיפול בפתוגנזה של הפרעות אלה.
יצרנו תאים אנושיים בעלי כדוריות המוח האנטי-חדרית מתאי גזע עובריים אנושיים במעבדה שלנו11, באמצעות תא גזע המושרה pluriפוטנטי (ipsc) טכנולוגיה12,13. כדי לאמת אם תאי הגוף האנושי הפריבאלי מחקים בנאמנות את תאי האנטי-בתים של העכבר, ועל מנת לאמוד את השפעתם על הגירה בין-חדרית, פיתחנו שלושה בתוך מבחנה: שיטת הגירה ארוכת שנים, שיטת הגירה של תרבות שותפה, ושיטת הכימותרפיה-אטרקציה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים עבור אלה שאומר בפרוטרוט. כל שלושת התוספות מבוססים על השימוש בתוספים לתרבות הסיליקון כדי ליצור טלאי מלבני קטן של תאים (של ממדים קבועים) מוקפים בשטח נטול תאים. מרחק ההעברה מוערך על-ידי מדידת המרחק בין המיקומים הסופיים של תאים מהגבול של התיקון המלבני שהותווה ביום 0. בתוך שיטת ההגירה ארוכת הטווח, תאי האנדותל האנושיים הקיימים מתפעינים כטלאי במרכז המנה 35 מ"מ, והמרחקים שבהם התאים מחושבים במשך זמן ארוך. בשנת שיתוף תרבות הגירה התיקון, תאים אנושיים המוח האנושי שיתוף הזרע עם interneurons אנושיים כמו תיקון אחד בצלחת 35 mm. התקנה זו מאפשרת בדיקה של ההשפעה של אינטראקציות פיזיות ישירות של שני סוגי תאים אלה על שיעור ההגירה של האינטרנוירונים. שיטת הכימותרפיה-אטרקציה מודדת את הגירה של האינטרנוירונים בתגובה לרמזים אטרקטיביים לכימותרפיה המופרשים על-ידי תאי האנדותל האנושיים. האינטרנוירונים הם שנזרע כטלאי מלבני, עם תאי האדם הפריתאלי האנושי ושליטה בתאי האנדותל שאינם הפריקיים שנזרע כטלאים בגודל דומה בכל צד. כל אחד מתיקוני התא מופרדים על-ידי פער ללא תא של 500 μm. תגובה של האינטרנוירונים מוערך על ידי כימות מספר התאים שהועברו לעבר תאים אנדותל החדרית לעומת שליטה בתאי אנדותל שאינם הפריחדרית.
הספק האלה מספקים הערכה איתנה של פונקציות התא האנושי הפריציאלי והשפעתם על הגירה בין-תאית. כיוונון הרומן של שיטת העברת היקף ושיתוף תרבות בינעירוניות מספק שטח פנוי לתא בטווח סנטימטרים (~ 1-1.5 ס מ) כדי לאפשר זיהוי של הגירה למרחקים ארוכים. סיכום של התכונות של בחני שלנו לעומת הפופולרי אחרים בחני מוצגת בטבלה 1. באופן קולקטיבי, בחני המתואר כאן ישמש פלטפורמה להערכת "חולה" תאים אנדותל המוח הביננוירונים שנוצר מ iPSCs של הפרעות בראש כמו סכיזופרניה, אוטיזם או אפילפסיה. מספר זה יכול לשמש גם כדי לקבוע כיצד תנאים שונים (למשל, מעכבי, ליגנדס, RNAi) משפיעים על העברת תאים. לבסוף, מספר זה יכול להיות ממוטב עבור סוגי תאים אחרים כדי למדוד הגירה למרחקים ארוכים, כימותרפיה-הגירה או תא התא ההגירה מתווכת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase dissociation solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human &#946;-Tubulin antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>802001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD31 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CBL468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- MAP2 antibody</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>CH22103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-active Caspase 3 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB3623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control human endothelial cells</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control endothelial Cells Medium Supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEMF/12 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E6 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons base medium</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neuron Neural supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-ornithin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td>Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>Lifeline Cell Technologies</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>Component of control human endothelial cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FSX-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons

תפקידה של ואסילטורה המוח בפיתוח מערכת העצבים והאטיולוגיה של הפרעות במוח הוא צובר יותר ויותר תשומת לב. המחקרים האחרונים שלנו זיהו אוכלוסייה מיוחדת של תאים כלי דם, תאי האנדותל החדרית, כי לשחק תפקיד קריטי בהגירה והפצה של האינטרנוירונים במוח הקדמי של GABAergic במהלך פיתוח עובריים. זה, ביחד עם הפונקציות האוטונומיות שלהם הסלולר, מרמז על תפקידים חדשניים של תאי המוח הנוירותל בפתולוגיה של הפרעות נפשיות כמו סכיזופרניה, אפילפסיה, ואוטיזם. כאן, תיארנו שלושה שונים בתוך מבחנה מחוץ לספר כי באופן קולקטיבי להעריך את הפונקציות של תאי האנדותל החדרית והאינטראקציה שלהם עם משולבת GABAergic. השימוש באלה אומר, במיוחד בהקשר אנושי, יאפשר לנו לזהות את הקשר בין תאי האנדותל החדרית והפרעות במוח. מאמר זה הם פשוט, עלות נמוכה, הניתנים לצפיה, וניתן להתאים בקלות לכל סוג תא חסיד.

השלבים להגדרת הכנסת התרבות האחת בתוך מנה של 35 מ"מ מוצגים באיור 1. שיטת ההעברה למרחקים ארוכים ושיתוף העברת התרבות המשותף השתמשו בתוספת אחת היטב כדי לזרע את מספר התאים הרצוי במרכז פולי-אל-כלים/למינציה בציפוי 35 מ"מ. ביום 0, התאים היו נוכחים כטלאי מלבני (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons at JoVE.com

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

אנו מציגים שלושה פשוטים מחוץ לגוף הרחב, שיטת ההגירה למרחקים ארוכים, שיטת ההגירה של תרבות השיתוף, והטיפול בטיפול בכימותרפיה-הערכת באופן קולקטיבי את התפקודים של תאי גזע אנושיים שמקורם בתאים אנדותקיים וה אינטראקציה עם האינטרנוירונים הבינכולינרגיות.

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

פרוטוקול זה מתאר שלוש אשויות במבחנה המעריכות באופן קולקטיבי את הפונקציות של תאי אנדותל פריונטריקולריים אנושיים ואת האינטראקציה שלהם עם interneurons GABAergic אנושי. תוצאות מ- assays אלה יספקו תובנה קריטית על הקשר בין תאי אנדותל periventricular והפרעות מוחיות. תנאים אלה הם פשוטים, בעלות נמוכה ומאפשרים מדידה של הגירת תאים בטווח של סנטימטרים, אשר אינו מושגת על ידי משגים קיימים אחרים.פגמים בהגירה ובהפצה של מתמחים GABAergic קשורים להפרעות פסיכיאטריות, כגון אוטיזם, אפילפסיה, סכיזופרניה ודיכאון. לכן, זה קריטי כדי ללמוד את האינטראקציה של תאים אנדותל periventricular עם interneurons GABAergic בהקשר האנושי כדי לטפל בפתוגנזה של הפרעות אלה. התחל בהכנת תאים אנושיים להתרגם.אפשר לתאי אנדותל פריונטריקולריים אנושיים להגיע ל-70 עד 80% קונפלונציה ואז נתק אותם בהתאם להוראות כתב היד וספיר אותם בשיטת ההדרה הכחולה trypan. כדי להכין INTERNEURons GABAergic אנושי, פתרון דיסוציאציה תאים חמים aliquot של מדיום עצבי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן שאפו את המדיום מכל תא המכיל היטב ושטפו אותם עם מילימטר אחד של PBS לגם.נתק את התאים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של פתרון דיסוציאציה לפני המלחמה לבא ודגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום עצבי ל הבאר ומעבירים את תווי התא לצינור חרוטי 15 מיליליטר, בעדינות triturating כדי לנטרל גושים התא. צנטריפוגה התאים ב 380 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, שאף את supernatant ו resuspend גלולת התא במיליליטר אחד של מדיום עצבי.לאחר מכן ספור את התאים החיים באמצעות אי-הכללה כחולה של trypan. הכן שליטה בתאי אנדותל אנושיים על ידי חימום פתרון הדיסוציאציה של התא ועלות של מדיום אנדותל ב 37 מעלות צלזיוס, 10 דקות לפני השימוש. שאפו מדיום מכל באר ושטפו אותם עם מיליליטר אחד של PBS לגם.נתק את התאים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של פתרון הדיסוציאציה לפני המלחמה לכל באר ודגירה של הצלחת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של תא אנדותל בינוני ל הבאר כדי לנטרל את פתרון הדיסוציאציה, ולהעביר את התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים G במשך חמש דקות, שאפו את העל-טבעי והתינו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום תא אנדותל.לאחר מכן השתמש בשיטת אי-הכללת trypan כדי לספור את התאים. הכינו הכנס תרבות אחת היטב על ידי חיתוך שלושה צדדים של באר אחת של שתי תרבות סיליקון היטב להוסיף עם להב סטרילי. מוציאים את התוסף עם פינצטה סטרילית ומכניסים אותו למרכז של צלחת פולי-L-ornithine ו laminin מצופה, ולאחר מכן לחץ לאורך קצה של הכנס כדי לתקן את זה על פני השטח.בזהירות להפוך את המנה במהופך כדי לוודא כי הכנס הוא דבק בחוזקה, ולסמן את הגבול של תא הכנס באמצעות שוק שחור קבוע עם קצה דק במיוחד. להשעות interneurons GABAergic האנושי בתאי אנדותל בינוניים ואנושיים עצביים ובינוני תא אנדותל בריכוז של 30, 000 לכל 70 microliters, ואז זרע 70 microliters של פתרון התא בתוך כל אחד גם תרבות להוסיף. מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום עצבי לצלחת הנוירון כדי למלא את האזור סביב הכנס ולמנוע את הציפוי מלהיות ייבוש.באופן דומה, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום תא אנדותל לצלחת התא ה אנדותל periventricular. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהם לא דולפים מהתא הכנס, ולאחר מכן דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. לאחר הדגירה, בדוק שוב את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהם מחוברים כראוי.48 שעות לאחר הזריעה, להסיר בעדינות את הכנס עם פינצטה סטרילית ולבדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא כי שכבת התא נשאר באין מפריע. מוציאים את המדיום הן מהנוירון והן ממנות התאים האנדותל הצפיים, ומוסיפים מיליליטר אחד של מדיום טרי לכל מנה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך חמישה ימים.לאחר מכן, להסיר את המדיום, לתקן את התאים עם 4%PFA במשך 10 דקות ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS. כדי לבצע את ההתמדה התרבותית-שותף, להשעות 30, 000 INTERNEURons GABAergic ו 30, 000 תאים אנדותל periventricular אנושי ב 70 microliters של מדיום שיתוף תרבות, ואז לזרוע פתרון תא זה בתוך תא אחד גם להוסיף. לאחר 48 שעות, הסר את ההוספה.הדגירה את התרבות השיתוף ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך חמישה ימים. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום, לתקן את התאים עם 4%PFA ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS. כדי לבצע את ההקפאה של הכימותרפיה, מניחים במרכז תבשיל 35 מילימטר מצופה פולי-L-ornithine ו- laminin, הופכים את המנה ומנמינים את הגבול סביב התא האמצעי של התוסף באמצעות סמן קבוע עם קצה דק במיוחד.זרעים 30, 000 INTERNEURons GABAergic ב 70 microliters של מדיום עצבי בתא האמצעי, ואז זרע 10, 000 תאים אנדותל periventricular ו 10, 000 תאי אנדותל שליטה ו 70 microliters של המדיום שלהם בהתאמה בשני התאים החיצוניים. מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום שיתוף תרבות לאורך הצד של המנה כדי למנוע את הציפוי על המנה מלהיות ייבוש. לאחר 48 שעות, להסיר את הכנס ותגרור את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 36 שעות.לאחר הדגירה, להסיר את המדיום, לתקן את התאים ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS. תריסי הגירה למרחקים ארוכים ותרבותית שותף שימשו לחקירת האינטראקציות בין תאי אנדותל פריאונטריים לבין נוירונים GABAergic. בהקדמה להגירה למרחקים ארוכים, התאים התחילו כתיקון מלבני ביום אפס, אבל ב-48 שעות, הם היגרו החוצה לחלל נטול התאים.כתמים אימונוציטוכימיים בנוגדן קפסה-3 אנטי-אקטיבי, סמן של אפופטוזיס, לא הראו אות אפופטוטי בנוירונים הזורעים. בתרבות השיתוף של ההגירה, כאשר interneurons היו זרעו במשותף עם תאים אנדותל periventricular אנושי, נוירונים נסעו מרחקים רחוקים יותר בהשוואה כאשר interneurons נזרעו לבד או כאשר זרעו במשותף עם תאי אנדותל שליטה. בהבטחה הכימותרפית-אטרקציה, מספר גבוה משמעותית של interneurons היגרו לכיוון תאי אנדותל periventricular בהשוואה לתאי אנדותל שליטה, המאשר כי interneurons GABAergic להגיב באופן סלקטיבי רמזים כימותרפיים אטרקטיביים המופרשים על ידי תאים אנדותל periventricular.ניתן לשנות את התשדורות הללו באמצעות ליגנדים, מעכבים או אסימונים כדי לקבל תובנות מכניסטיות על אינטראקציות של תאי אנדותל פריונטריקולריים אנושיים עם מתמחים אנושיים. הם יכולים לשמש גם כדי ללמוד את האינטראקציה של תאים אנדותל periventricular אנושי עם תאים עצביים אחרים כפי שדווח על ידי הקבוצה שלנו ואחרים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לתקן את הכנס בחוזקה על המנה ולשמור אותו באין מפריע לאורך כל הבדיקה, אחרת זה עלול להוביל דליפת תאים, ניתוק תאים או חוסר התאמה של הכנס עם הגבול שצויר.העבודה שלנו הצביעה על תפקיד אוטונומי בתאים אנדותל אנושיים בפתוגנזה של הפרעות פסיכיאטריות כמו סכיזופרניה, אפילפסיה ואוטיזם. לכן, הערכה זו תאפשר הערכה של תאי אנדותל פריונטריקולריים חולים הנגזרים מחולים עם הפרעות אלה באמצעות טכנולוגיית IPSC.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

היווצרות הסינפסה מעכבת בשיתוף תרבות נוירונים דגם שילוב GABAergic בינוני קוצניים וHEK293 תאים ביציבות להביע GABA<sub&gt;</sub&gt; רצפטורים

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

ספירת בתאי גזע עצביים באמצעות מבחני המשובטים

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

דגמי Zika בנגיף של ה בפיתוח המוח האנושי במבחנה באמצעות תאי גזע נגזר Organoids מוחי

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

שיטת עבור מהירות גבוהה מתיחה פציעתו של האדם המושרה נוירונים נגזר תאי גזע Pluripotent בתבנית 96-ובכן

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

מידור של תאי גזע האדם הנגזרים בתוך שבבי מיקרופלואידיג פלסטיק מורכבים מראש

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

לאחר בידול מחדש של תא גזע האדם Pluriפוטנטי-הנוירונים הנגזרים עבור הקרנת תוכן גבוה של Neuritogenesis והתבגרות סינפסה

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בתאי גזע בעלי השפעה של האדם המושרה בנוירונים

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...