Name: migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons at JoVE.com

Este trabalho contou com o apoio de premiações do Instituto Nacional de Saúde Mental (R01MH1110438) e do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (R01NS100808) à AV.

1. Cultura e Armazenamento de Células Endoteliais Periventriculares Humanas
<ol><li>Mantenha células endoteliais periventriculares humanas na membrana do porão revestida saciada (ver Tabela de Materiais) placas de 6 poços em meio de células endoteliais periventriculares (médio E6 contendo 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 e 5 μM GABA) a 37 °C e 5% CO2. Mude o meio todos os dias alternativos.</li>
	<li>Descongele a matriz de membrana do porão em 4 °C, e faça uma solução de 1:100 di...

<ol>
	<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+From+Physiology+to+Disease+and+Back.">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).</li><li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain.">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).</li><li>Won, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain.">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nature Communications. 4, 2149 (2013).</li><li>Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+VEGF+sculpts+cortical+cytoarchitecture.">Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-derived+GABA+signaling+modulates+neuronal+migration+and+postnatal+behavior.">Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior.</a> Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).</li><li>Lewis, D. A., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+as+a+disorder+of+neurodevelopment.">Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).</li><li>Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibitory+neurons+and+schizophrenia.">Cortical inhibitory neurons and schizophrenia.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).</li><li>Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+dysfunction+in+psychiatric+disorders.">Interneuron dysfunction in psychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).</li><li>Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neocortical+interneuron+development+and+the+implications+for+neurodevelopmental+disorders.">Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders.</a> Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).</li><li>Treiman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+mechanisms+in+epilepsy.">GABAergic mechanisms in epilepsy.</a> Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).</li><li>Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+forebrain+endothelial+cells+for+cell-based+therapy+of+neuropsychiatric+disorders.">Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders.</a> Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , (2018).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient?.">Induced pluripotent stem cells: the new patient?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modelling+neurodevelopmental+disorders.">Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).</li><li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development.">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).</li><li>Vissapragada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+crosstalk+between+periventricular+endothelial+cells+and+neural+progenitor+cells+promotes+the+formation+of+a+neurovascular+unit.">Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit.</a> Brain Research. 1565, 8-17 (2014).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology.+The+Transwell+Migration+Assay.">Cell Biology. The Transwell Migration Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Renaud, J., Martinovic, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact.">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).</li><li>Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+chemotaxis+using+the+Dunn+direct-viewing+chamber.">Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber.</a> Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).</li><li>Kim, B. J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+mammalian+cell+chemotaxis.">Microfluidics for mammalian cell chemotaxis.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).</li></ol>

Aqui, descrevemos três ensaios in vitro que, juntos, fornecem avaliação quantitativa de propriedades específicas de células endoteliculares periventriculares humanas. Esses ensaios serão valiosos para obter insights mecanicistas sobre a interação de células endoteliais periventriculares humanas com interneurônios humanos. Experimentos usando ligands, inibidores ou células com knockdown ou superexpressão específicas de genes identificarão ou validarão jogadores moleculares que mediam a migração interneur?...

As células endoteliais formam o revestimento dos vasos sanguíneos e mediam funções importantes que incluem manutenção da permeabilidade da parede do vaso, regulação do fluxo sanguíneo, agregação de plaquetas e formação de novos vasos sanguíneos. No cérebro, as células endoteliais fazem parte de uma barreira cerebral-cérebro crítica que controla firmemente a troca de materiais entre o cérebro e a corrente sanguínea1. Nossos estudos na última década identificaram novos papéis neurogênicos de células endoteliais cerebrais que têm implicações significativas para o desenvolvimento e comportamento cerebral2,3,4,5. Mostramos que o cérebro embrionário do camundongo é vascularizado por dois subtipos distintos de vasos, os vasos pial e os vasos periventriculares, que diferem em anatomia, origem e perfil de desenvolvimento2. Células endoteliais que revestem esses dois subtipos de vasos mostram diferenças distintas em seus perfis de expressão genética. Enquanto as células endoteliais pial expressam principalmente genes relacionados à inflamação e à resposta imune, as células endoteliais periventriculares são enriquecidas exclusivamente na expressão de genes comumente associados à neurogênese, migração neuronal, quimiotaxe e orientação de axôon3. Células endoteliais periventriculares também abrigam um novo caminho de sinalização GABA que é distinto do tradicional caminho de sinalização neuronal GABA5. Concomitante com sua expressão genética, células endoteliais periventriculares foram encontradas para regular a migração e distribuição de interneurônios gabaergicos no neocórtex em desenvolvimento. Durante o desenvolvimento embrionário, as células endoteliais periventriculares sofrem migração de longa distância ao longo de um gradiente ventral-dorsal para estabelecer a rede vascular periventricular2,3. Esta rota migratória é espelhada um dia depois por interneurônios. Os interneurônios migratórios interagem fisicamente com a rede vascular periventricular pré-formada e a usam como um guia para chegar ao seu destino final no neocórtex. Além de atuarem como substrato físico, as células endoteliais periventriculares servem como fonte de sinais de navegação para neurônios migratórios. Gaba endotelicular endotelial de células periventriculares guia a migração interneurônios e regula seus padrões finais de distribuição4. Defeitos na migração e distribuição interneurônios estão associados a transtornos neuropsiquiátricos como autismo, epilepsia, esquizofrenia e depressão6,7,8,9,10. Portanto, o estudo das funções endoteliais endoteliais periventriculares e sua influência na migração interneurônio no contexto humano torna-se fundamental para abordar a patogênese desses transtornos.
Geramos células endoteliais periventriculares humanas a partir de células-tronco embrionárias humanas em nosso laboratório11, usando tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)12,13. Para validar se as células endoteliais periventriculares humanas imitam fielmente células endoteliais periventriculares do camundongo e para avaliar quantitativamente sua influência na migração interneurônios, desenvolvemos três ensaios in vitro: um ensaio migratório de longa distância, um ensaio migratório de cocultura e um ensaio de atração de quimioterapia. Aqui descrevemos protocolos para esses ensaios em detalhes. Todos os três ensaios são baseados no uso de pastilhas de cultura de silicone para criar um pequeno retangular de células (de dimensões fixas) cercadas por espaço livre de células. A distância migratória é avaliada medindo a distância entre as posições finais das células da fronteira do patch retangular que foi delineado no dia 0. No ensaio de migração de longa distância, as células endoteliais periventriculares humanas são semeadas como um remendo no centro de uma antena de 35 mm, e as distâncias percorridas pelas células ao longo de um longo período de tempo são calculadas. No ensaio de migração da cocultura, as células endoteliais periventriculares humanas são co-semeadas com interneurônios humanos como um remendo em um prato de 35 mm. Esta configuração permite examinar o efeito das interações físicas diretas desses dois tipos de células na taxa de migração de interneurônios. O ensaio quimio-atração mede a migração de interneurônios em resposta a pistas quimio-atraentes secretadas por células endoteliais periventriculares humanas. Os interneurônios são semeados como um remendo retangular, com células endoteliais periventriculares humanas e controlam células endoteliais não periventriculares semeadas como remendos de tamanho semelhante em ambos os lados. Cada uma das manchas de células são separadas por uma lacuna livre de células de 500 μm. A resposta dos interneurônios é avaliada por quantificar o número de células que migraram para células endoteliais periventriculares em comparação com o controle de células endoteliais não periventriculares.
Esses ensaios fornecem uma avaliação robusta das funções endoteliais eendteliculares humanas e sua influência na migração interneurônios. A nova configuração de ensaio saque de longa distância e ensaio de migração de co-cultura fornece espaço livre de células na faixa de centímetros (~1-1,5 cm) para permitir a detecção da migração de longa distância. Um resumo das características de nossos ensaios em comparação com outros ensaios populares é apresentado na Tabela 1. Coletivamente, os ensaios descritos aqui servirão como uma plataforma para avaliar células endoteliais endoteliais eendrâneos periventriculares "doentes" e interneurônios gerados a partir de iPSCs de distúrbios cerebrais como esquizofrenia, autismo ou epilepsia. Esses ensaios também podem ser usados para determinar como diferentes condições (por exemplo, inibidores, ligands, RNAi) afetam a migração celular. Finalmente, esses ensaios podem ser otimizados para outros tipos de células para medir a migração de longa distância, a atração de quimioterapia ou a migração mediada por células.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase dissociation solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human &#946;-Tubulin antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>802001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD31 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CBL468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- MAP2 antibody</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>CH22103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-active Caspase 3 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB3623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control human endothelial cells</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control endothelial Cells Medium Supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEMF/12 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E6 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons base medium</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neuron Neural supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-ornithin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td>Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>Lifeline Cell Technologies</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>Component of control human endothelial cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FSX-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons

O papel da vasculatura cerebral no desenvolvimento do sistema nervoso e na etiquetação de distúrbios cerebrais está ganhando cada vez mais atenção. Nossos estudos recentes identificaram uma população especial de células vasculares, as células endoteliais periventriculares, que desempenham um papel crítico na migração e distribuição de interneurônios gabaergicos do cérebro anterior durante o desenvolvimento embrionário. Isso, juntamente com suas funções autônomas de células, alude a novos papéis de células endoteliais periventriculares na patologia de doenças neuropsiquiátricas como esquizofrenia, epilepsia e autismo. Aqui, descrevemos três ensaios in vitro diferentes que avaliam coletivamente as funções das células endoteliais periventriculares e sua interação com interneurônios gabaergicos. O uso desses ensaios, particularmente em um contexto humano, nos permitirá identificar a ligação entre células endoteliais periventriculares e distúrbios cerebrais. Esses ensaios são simples, de baixo custo e reprodutíveis, e podem ser facilmente adaptados a qualquer tipo de célula aderente.

Os passos para configurar uma inserção de cultura de um poço dentro de um prato de 35 mm são mostrados na Figura 1. Ensaio seleção de migração de longa distância e ensaio de migração de co-cultura usaram uma inserção de um poço para semear o número desejado de células no centro de uma antena poli-L-ornithine/laminin revestida de 35 mm. No dia 0, as células estavam presentes como um remendo retangular (Figura 2<st...

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Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Apresentamos três simples ensaios in vitro - o ensaio migratório de longa distância, o ensaio de migração de cocultura, e o ensaio de atração de quimioterapia - que avaliam coletivamente as funções das células-tronco humanas derivadas células endoteliais periventriculares e suas interação com interneurônios GABAergic.

Migração, Quimio-Atração e Ensaios de Cocultura para Células Endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios gabaergicos

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Este protocolo descreve três ensaios in vitro que avaliam coletivamente as funções das células endoteliais periventriculares humanas e sua interação com interneurônios gabaérgicos humanos. Os resultados desses ensaios fornecerão uma visão crítica sobre a ligação entre células endoteliais periventriculares e distúrbios cerebrais. Estes ensaios são simples, de baixo custo e permitem a medição da migração celular na faixa de centímetros, o que não é alcançado por outros ensaios existentes.Defeitos na migração e distribuição de interneurônios GABAérgicos estão associados a transtornos psiquiátricos, como autismo, epilepsia, esquizofrenia e depressão. Por isso, é fundamental estudar a interação das células endoteliais periventriculares com interneurônios GABAérgicos no contexto humano para enfrentar a patogênese desses transtornos. Comece preparando células humanas para o ensaio.Permitir que as células endoteliais periventriculares humanas atinjam 70 a 80% de confluência e dissociá-las de acordo com as instruções do manuscrito e contá-las usando o método de exclusão azul trypan. Para preparar interneurônios gabaérgicos humanos, solução de dissociação celular quente e uma alíquota de meio neuronal a 37 graus celsius por 10 minutos. Em seguida, aspire o meio de cada poço contendo células e lave-as com um milímetro de PBS por poço.Retire as células adicionando 0,5 mililitros de solução de dissociação pré-armada por poço e incubando-as a 37 graus celsius por cinco minutos. Após a incubação, adicione um mililitro de meio neuronal por poço e transfira a solução celular para um tubo cônico de 15 mililitros, triturando suavemente para dissociar aglomerados celulares. Centrifugar as células a 380 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente, aspirar o supernasal e resuspensar a pelota celular em um mililitro de meio neuronal.Em seguida, conte as células vivas usando a exclusão azul trypan. Prepare o controle das células endoteliais humanas aquecendo a solução de dissociação celular e uma alíquota de meio endotelial a 37 graus celsius, 10 minutos antes do uso. Aspirar o meio de cada poço e lavá-los com um mililitro de PBS por poço.Retire as células adicionando 0,5 mililitros da solução de dissociação pré-armada a cada poço e incubando a placa em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione um mililitro de meio celular endotelial por poço para neutralizar a solução de dissociação, e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar as células a 200 vezes G por cinco minutos, aspirar o supernasciente e resuspensar as células em um mililitro de meio celular endotelial.Em seguida, use o método de exclusão do tripano para contar as células. Prepare uma inserção de cultura bem,cortando três lados de um poço de uma inserção de cultura de silicone de dois poços com uma lâmina estéril. Remova a pastilha com pinças estéreis e coloque-a no centro de um prato poli-L-ornithine e laminin revestido, em seguida, pressione ao longo da borda da inserção para fixá-lo à superfície.Vire cuidadosamente o prato de cabeça para baixo para verificar se a inserção está firmemente aderida, e marque o limite do compartimento de inserção usando um mercado negro permanente com uma ponta ultra fina. Suspender interneurônios gabaérgicos humanos em células endoteliais periventriculares periventriculares periventriculares e humanas e meio de células endoteliais a uma concentração de 30.000 por 70 microlitadores, em seguida, sementes 70 microliters da solução celular dentro de cada inserção de cultura bem. Adicione um mililitro de meio neuronal ao prato do neurônio para preencher a área ao redor da pastilha e evitar que o revestimento seque.Da mesma forma, adicione um mililitro de meio celular endotelial ao prato de célula endotelial periventricular. Verifique as células sob um microscópio para verificar se elas não estão vazando do compartimento de inserção e, em seguida, incuba-as a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após a incubação, verifique novamente as células sob o microscópio para verificar se elas foram devidamente anexadas.48 horas após a semeadura, remova suavemente a inserção com pinças estéreis e verifique as células sob o microscópio para verificar se a camada celular permanece intacta. Remova o meio tanto do neurônio quanto dos pratos celulares endoteliais periventriculares, e adicione um mililitro de meio fresco a cada prato. Incubar as células a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco dias.Em seguida, remova o meio, fixe as células com 4%PFA por 10 minutos e lave-as três vezes com PBS. Para realizar o ensaio de cocultura, suspenda 30.000 interneurônios GABAérgicos e 30.000 células endoteliais periventriculares humanas em 70 microlitrais de meio de co-cultura, em seguida, semeou esta solução celular dentro de um compartimento de inserção de um poço. Após 48 horas, remova a inserção.Incubar a cocultura a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco dias. Após a incubação, remova o meio, fixe as células com 4%PFA e lave-as três vezes com PBS. Para realizar o ensaio de quimio-atração, coloque uma inserção de três poços de cultura no centro de um prato de 35 milímetros revestido de poli-L e laminina, vire o prato de cabeça para baixo e marque o limite ao redor do compartimento médio da inserção usando um marcador permanente com uma ponta ultra fina.Sementes 30.000 interneurônios GABAérgicos em 70 microliters de meio neuronal no compartimento médio, depois sementes 10.000 células endoteliais periventriculares e 10.000 células endoteliais de controle e 70 microliters de seu respectivo meio nos dois compartimentos externos. Adicione um mililitro de meio de co-cultura ao longo do lado do prato para evitar que o revestimento no prato seque. Após 48 horas, remova a inserção e incubar as células a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por 36 horas.Após a incubação, remova o meio, fixe as células e lave-as três vezes com PBS. Ensaios migratórios de longa distância e cocultura foram utilizados para investigar as interações entre células endoteliais periventriculares e neurônios GABAérgicos. No ensaio de migração de longa distância, as células começaram como um patch retangular no dia zero, mas por 48 horas, elas migraram para o espaço livre de células.A coloração imunocitoquímica com anticorpo Caspase-3 anti-ativo, um marcador de apoptose, não mostrou sinal apoptótico nos neurônios semeados. No ensaio de migração da cocultura, quando os interneurônios foram co-semeados com células endoteliais periventriculares humanas, os neurônios percorreram distâncias mais distantes em comparação com quando os interneurônios eram semeados sozinhos ou quando co-semeados com células endoteliais de controle. No ensaio de quimio-atração, um número significativamente maior de interneurônios migraram para células endoteliais periventriculares em comparação com células endoteliais de controle, confirmando que os interneurônios GABAérgicos respondem seletivamente a pistas quimio-atraentes secretadas por células endoteliais periventriculares.Esses ensaios podem ser modificados usando ligantes, inibidores ou arenes de ensaio para obter insights mecanicistas sobre interações de células endoteliais periventriculares humanas com interneurônios humanos. Eles também podem ser usados para estudar a interação das células endoteliais periventriculares humanas com outras células neurais, como relatado pelo nosso grupo e outros. Ao tentar este procedimento, é importante fixar a inserção firmemente no prato e mantê-lo intacto durante todo o ensaio, caso contrário, pode levar a vazamento celular, descolamento celular ou desalinhamento da inserção com o limite desenhado.Nosso trabalho indicou papel autônomo celular das células endoteliais periventriculares humanas em patogênese de transtornos psiquiátricos como esquizofrenia, epilepsia e autismo. Esses ensaios permitirão, portanto, a avaliação de células endoteliais periventriculares doentes derivadas de pacientes com esses transtornos usando a tecnologia IPSC.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-cultura de neurônios de rato Primária Cortical e Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Neurociência

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Formação Sinapse Inibitória em uma co-cultura-tipo que comportem GABAérgicos espinhosos médios neurônios e células HEK293 expressando estavelmente GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptores

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia neurônios e células-tronco diferenciadas adiposo-derivados: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultura modelo para estudar a regeneração do nervo periférico

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Enumeração de células-tronco neurais Usando clonais Ensaios

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelagem de infecção de vírus Zika do desenvolvimento cérebro humano In Vitro usando células-tronco derivadas de Organoids Cerebral

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Método para alta velocidade lesão de estiramento de humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de neurônios em um formato de 96 poços

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Compartimentalização de neurônios derivados de células-tronco humanas dentro de chips de plástico Microfluídico pré-montados

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Derivação, Expansão, Criopreservação e Caracterização de Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...