Name: migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons at JoVE.com

Detta arbete stöddes av utmärkelser från National Institute of Mental Health (R01MH110438) och National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) till AV.

1. Kultur och lagring av mänskliga periventricular endotelceller
<ol><li>Håll humana periventricular endotelceller på matrisbelagda källaren membran (se Materialförteckning)6-brunnsplattor i periventricular endotelcellmedium (E6 medium som innehåller 50 ng/ml VEGF-A, 100 ng/ml FGF2 och 5 μM GABA) vid 37 °C och 5% CO2. Byt medium varje annan dag.</li>
	<li>Tina källaren membran matris i 4 °C, och gör en 1:100 lösning genom att späda ut den i kallt DMEM/F12 medium. Coat varje brun...

<ol>
	<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+From+Physiology+to+Disease+and+Back.">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).</li><li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain.">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).</li><li>Won, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain.">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nature Communications. 4, 2149 (2013).</li><li>Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+VEGF+sculpts+cortical+cytoarchitecture.">Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-derived+GABA+signaling+modulates+neuronal+migration+and+postnatal+behavior.">Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior.</a> Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).</li><li>Lewis, D. A., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+as+a+disorder+of+neurodevelopment.">Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).</li><li>Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibitory+neurons+and+schizophrenia.">Cortical inhibitory neurons and schizophrenia.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).</li><li>Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+dysfunction+in+psychiatric+disorders.">Interneuron dysfunction in psychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).</li><li>Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neocortical+interneuron+development+and+the+implications+for+neurodevelopmental+disorders.">Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders.</a> Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).</li><li>Treiman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+mechanisms+in+epilepsy.">GABAergic mechanisms in epilepsy.</a> Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).</li><li>Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+forebrain+endothelial+cells+for+cell-based+therapy+of+neuropsychiatric+disorders.">Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders.</a> Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , (2018).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient?.">Induced pluripotent stem cells: the new patient?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modelling+neurodevelopmental+disorders.">Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).</li><li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development.">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).</li><li>Vissapragada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+crosstalk+between+periventricular+endothelial+cells+and+neural+progenitor+cells+promotes+the+formation+of+a+neurovascular+unit.">Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit.</a> Brain Research. 1565, 8-17 (2014).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology.+The+Transwell+Migration+Assay.">Cell Biology. The Transwell Migration Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Renaud, J., Martinovic, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact.">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).</li><li>Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+chemotaxis+using+the+Dunn+direct-viewing+chamber.">Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber.</a> Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).</li><li>Kim, B. J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+mammalian+cell+chemotaxis.">Microfluidics for mammalian cell chemotaxis.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).</li></ol>

Här beskrev vi tre in vitro-analyser som tillsammans ger kvantitativ bedömning av mänskliga periventricular endotel cell-specifika egenskaper. Dessa analyser kommer att vara värdefulla för att få mekanistiska insikter i samspelet mellan mänskliga periventricular endotel celler med mänskliga interneurons. Experiment med ligand, inhibitorer eller celler med genspecifik knockdown eller överuttryck kommer att identifiera eller validera molekylära aktörer som medla endotel cell-guidad interneuron migration eller l?...

Endotelceller bildar slemhinnan i blodkärlen och förmedlar viktiga funktioner som inkluderar underhåll av kärlväggpermeabilitet, reglering av blodflödet, trombocytaggregation en och bildandet av nya blodkärl. I hjärnan, endotelceller utgör en del av en kritisk blod -hjärnbarriär som tätt kontrollerar utbyte av material mellan hjärnan och blodomloppet1. Våra studier under det senaste decenniet har identifierat nya neurogena roller hjärnan endotelceller som har betydande konsekvenser för hjärnans utveckling och beteende2,3,4,5. Vi har visat att musenembryonala framhjärnan är vascularized av två olika subtyper av fartyg, pial fartyg och periventricular fartyg, som skiljer sig åt i anatomi, ursprung och utvecklingsmässiga profil2. Endotelceller som kantar dessa två undertyper av kärl visar tydliga skillnader i deras genuttrycksprofiler. Medan pial endotelceller uttrycker mestadels gener relaterade till inflammation och immunsvar, periventricular endotel celler är unikt berikade i uttryck för gener som vanligen förknippas med neurogenes, neuronal migration, chemotaxis och axon vägledning3. Periventricular endotel celler också hus en ny GABA signalering väg som skiljer sig från den traditionella neuronala GABA signalering väg5. Samtidig t.ex. med dess genuttryck, periventricular endotel celler konstaterades reglera migration och distribution av GABAergic interneurons i utvecklings-neocortex. Under embryonal utveckling genomgår periventricular endotelceller långväga migration längs en ventral-rygglutning för att fastställa det periventricular vaskulära nätverket2,3. Denna migrationsväg speglas en dag senare av interneurons. Migrera interneurons interagerar fysiskt med det förbildade periventricular vaskulära nätverket och använda det som en guiderail för att nå sin slutdestination i neocortex. Förutom att fungera som ett fysiskt substrat, periventricular endotel celler fungera som källan till navigationssignaler för migrerande nervceller. Periventricular endotel cell-utsöndras GABA guider interneuron migration och reglerar deras slutliga distributionsmönster4. Defekter i interneuron migration och distribution är förknippade med neuropsykiatriska störningar såsom autism, epilepsi, schizofreni och depression6,7,8,9,10. Därför blir studier av periventricular endotel cell funktioner och deras inverkan på interneuron migration i mänskligt sammanhang kritisk för att ta itu med patogenesen vid dessa sjukdomar.
Vi har genererat mänskliga periventricular-liknande endotelceller från mänskliga embryonala stamceller i vårt laboratorium11,med inducerad pluripotent stamceller (iPSC) teknik12,13. För att validera om mänskliga periventricular endotel celler troget efterlikna mus periventricular endotel celler, och att kvantitativt bedöma deras inflytande på interneuron migration, utvecklade vi tre in vitro analyser: en långväga migration analys, en co-kultur migration analys, och en chemo-attraktion analys. Här beskriver vi protokoll för dessa analyser i detalj. Alla tre analyser är baserade på användningen av silikon kultur skär för att skapa en liten rektangulär fläck av celler (av fasta dimensioner) omgiven av cellfritt utrymme. Migreringsavstånd utvärderas genom att mäta avståndet mellan cellernas slutliga positioner från gränsen till den rektangulära patchsom har beskrivits dag 0. I långväga migration analys, mänskliga periventricular endotel celler är sådd som en patch i mitten av en 35 mm skålen, och de avstånd som färdas av cellerna över en lång tid beräknas. I co-kultur migration analys, mänskliga periventricular endotel celler är samseedade med mänskliga interneurons som en lapp i en 35 mm skålen. Denna inställning möjliggör undersökning av effekten av direkta fysiska interaktioner av dessa två celltyper på graden av migration av interneurons. Chemo-attraktion analysen mäter migration av interneurons som svar på kemo-attraktiva signaler utsöndras av mänskliga periventricular endotel celler. Interneurons är sådd som en rektangulär patch, med mänskliga periventricular endotel celler och kontroll icke-periventricular endotel celler sådd som liknande storlek fläckar på vardera sidan. Var och en av cellplåstren separeras av en cellfri lucka på 500 μm. Svar av interneurons bedöms genom att kvantifiera antalet celler som har migrerat till periventricular endotelceller jämfört med kontroll icke-periventricular endotelceller.
Dessa analyser ger robust bedömning av mänskliga periventricular endotel cell funktioner och deras inflytande på interneuron migration. Den nya installationen av långväga analys och co-kultur migration analys ger cellfritt utrymme i intervallet centimeter (~ 1-1,5 cm) för att möjliggöra upptäckt av långväga migration. En sammanfattning av funktionerna i våra analyser jämfört med andra populära analyser presenteras i tabell 1. Kollektivt, de analyser som beskrivs här kommer att fungera som en plattform för att bedöma "sjuka" periventricular endotel celler och interneurons genereras från iPSCs av hjärnsjukdomar som schizofreni, autism eller epilepsi. Dessa analyser kan också användas för att avgöra hur olika tillstånd (t.ex. hämmare, ligander, RNAi) påverkar cellmigrationen. Slutligen kan dessa analyser optimeras för andra celltyper för att mäta långväga migration, kemo-attraktion eller cell-cell medierad migration.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase dissociation solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human &#946;-Tubulin antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>802001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD31 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CBL468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- MAP2 antibody</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>CH22103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-active Caspase 3 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB3623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control human endothelial cells</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control endothelial Cells Medium Supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEMF/12 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E6 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons base medium</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neuron Neural supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-ornithin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td>Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>Lifeline Cell Technologies</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>Component of control human endothelial cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FSX-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons

Roll hjärnan vaskulatur i nervsystemet utveckling och etiologi av hjärnsjukdomar blir alltmer få uppmärksamhet. Våra nyligen genomförda studier har identifierat en speciell population av vaskulära celler, periventricular endotel celler, som spelar en avgörande roll i migration och distribution av forebrain GABAergic interneurons under embryonal utveckling. Detta, tillsammans med deras cell-autonoma funktioner, anspelar på nya roller periventricular endotel celler i patologi neuropsykiatriska störningar som schizofreni, epilepsi och autism. Här har vi beskrivit tre olika in vitro-analyser som tillsammans utvärderar funktionerna i periventricular endotelceller och deras interaktion med GABAergic interneurons. Användning av dessa analyser, särskilt i ett mänskligt sammanhang, kommer att tillåta oss att identifiera sambandet mellan periventricular endotel celler och hjärnsjukdomar. Dessa analyser är enkla, billiga och reproducerbara, och kan enkelt anpassas till någon vidhäftande celltyp.

Stegen för att sätta upp en enbrunnskulturinsats inuti en 35 mm-maträtt visas i figur 1. Långväga migration analys och co-kultur migration analys används en enbrunnsinsats för att så utsäde önskat antal celler i mitten av en poly-L-ornitin / laminin belagd 35 mm skålen. Dag 0 var cellerna närvarande som en rektangulär patch (figur 2A,C). I dag 0-bilder kan dag 0-linjen lätt identifieras av cellskikt...

Watch this Scientific Journal Video about Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons at JoVE.com

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Vi presenterar tre enkla in vitro analyser-långväga migration analys, co-kultur migration analys, och chemo-attraktion analys-som kollektivt utvärdera funktionerna i mänskliga stamceller härrör periventricular endotel celler och deras interaktion med GABAergic interneurons.

Migration, Chemo-Attraction och Co-Kultur Analyser för humanstamcells-härledda endotelceller och GABAergic nervceller

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Detta protokoll beskriver tre in vitro-analyser som kollektivt bedöma funktionerna hos mänskliga periventricular endotelceller och deras interaktion med mänskliga GABAergic interneurons. Resultat från dessa analyser kommer att ge kritisk insikt i sambandet mellan periventricular endotelceller och hjärnsjukdomar. Dessa analyser är enkla, billiga och möjliggör mätning av cellmigration i centimeters intervall, vilket inte uppnås genom andra befintliga analyser.Defekter i migration och distribution av GABAergic interneurons är associerade med psykiatriska sjukdomar, såsom autism, epilepsi, schizofreni och depression. Därför är det kritiskt att studera samspelet mellan periventricular endotelceller med GABAergic interneurons i mänskliga sammanhang att ta itu med patogenesen vid dessa störningar. Börja med att förbereda mänskliga celler för analysen.Låt mänskliga periventricular endotelceller att nå 70 till 80%confluency sedan dissociate dem enligt manuskriptets anvisningar och räkna dem med hjälp av metoden trypan blå uteslutning. För att förbereda mänskliga GABAergic interneurons, varm cell dissociation lösning och en alikvot av neuronal medium vid 37 grader celsius i 10 minuter. Därefter aspirera mediet från varje brunn som innehåller celler och tvätta dem med en millimeter PBS per brunn.Lösgör cellerna genom att lägga till 0,5 milliliter av förvärmd dissociationslösning per brunn och inkubera dem vid 37 grader celsius i fem minuter. Efter inkubationen, tillsätt en milliliter neuronal medium per brunn och överföra celllösningen i en 15 milliliter koniska röret, försiktigt triturating att dissociate cell klumpar. Centrifugera cellerna vid 380 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur, aspirera supernatant och resuspend cellpelleten i en milliliter neuronal medium.Räkna sedan de levande cellerna med hjälp av trypan blå uteslutning. Förbered kontroll mänskliga endotelceller genom att värma cellen dissociation lösning och en alikvot av endotel medium vid 37 grader celsius, 10 minuter före användning. Aspirera medium från varje brunn och tvätta dem med en milliliter PBS per brunn.Lösgör cellerna genom att tillsätta 0,5 milliliter av den förvärmda dissociationslösningen till varje brunn och inkubera plattan i rumstemperatur i fem minuter. Tillsätt sedan en milliliter encellcellsmedium per brunn för att neutralisera dissociationlösningen och överför cellerna till ett 15 milliliter koniskt rör. Centrifugera cellerna vid 200 gånger G i fem minuter, aspirera supernatanten och resuspend cellerna i en milliliter av endotelcellsmedium.Använd sedan metoden för trypan-uteslutning för att räkna cellerna. Förbered en brunnskulturskär genom att skära tre sidor av en brunn av en två brunnssiliskulturskär med ett sterilt blad. Ta bort insatsen med steril pincett och placera den i mitten av en poly-L-ornitin och laminin-belagda skålen, tryck sedan längs kanten av insatsen för att fixera den till ytan.Vänd försiktigt skålen upp och ner för att kontrollera att skäret är fast vidhäftat, och markera gränsen för insatsutrymmet med hjälp av en permanent svart marknad med en ultrafin spets. Suspend human GABAergic interneurons i neuronala medium och mänskliga periventricular endotelceller och endotelcellsmedium vid en koncentration av 30, 000 per 70 mikroliter, sedan utsäde 70 mikroliter av celllösningen inuti varje en väl kultur infoga. Lägg till en milliliter neuronal medium till neuron skålen för att fylla området runt skäret och förhindra beläggningen från torkning.På samma sätt, lägg till en milliliter av endotelcellsmedium till periventricular endotelcellsskålen. Kontrollera cellerna under mikroskop för att kontrollera att de inte läcker från skärutrymmet, sedan inkubera dem på 37 grader celsius och 5%koldioxid i 24 timmar. Efter inkubationen, kontrollera cellerna igen under mikroskopet för att kontrollera att de har ordentligt fäst.48 timmar efter sådd ska du försiktigt ta bort insatsen med sterila pincetter och kontrollera cellerna under mikroskopet för att kontrollera att celllagret förblir ostört. Ta bort mediet från både neuron och periventricular endotel cell rätter, och tillsätt en milliliter färskt medium till varje maträtt. Inkubera cellerna vid 37 grader celsius och 5%koldioxid i fem dagar.Ta sedan bort mediet, fixera cellerna med 4%PFA i 10 minuter och tvätta dem tre gånger med PBS. För att utföra den co-kultur analysen, avbryta 30, 000 GABAergic interneurons och 30, 000 mänskliga periventricular endotelceller i 70 mikroliter av co-kultur medium, sedan utsäde denna cell lösning inuti en en väl infoga fack. Efter 48 timmar, ta bort insatsen.Inkubera samkulturen vid 37 grader celsius och 5%koldioxid i fem dagar. Efter inkubationen, ta bort mediet, fixera cellerna med 4%PFA och tvätta dem tre gånger med PBS. För att utföra chemo-attraktion assay, placera en tre väl kultur infoga i mitten av en poly-L-ornitin och laminin-belagda 35 millimeter skålen, vända skålen upp och ner, och markera gränsen runt mitten facket i skäret med hjälp av en permanent markör med en ultra fin spets.Frö 30, 000 GABAergic interneurons i 70 mikroliter av neuronal medium i mitten fack, sedan utsäde 10, 000 periventricular endotelceller och 10, 000 kontroll endotelceller och 70 mikroliter av deras respektive medium i de två yttre facken. Tillsätt en milliliter av samkultur medium längs sidan av skålen för att förhindra beläggningen på skålen från torkning. Efter 48 timmar, ta bort skäret och inkubera cellerna vid 37 grader celsius och 5%koldioxid i 36 timmar.Efter inkubationen, ta bort mediet, fixa cellerna och tvätta dem tre gånger med PBS. Långa avstånd och co-kultur migration analyser användes för att undersöka samspelet mellan periventricular endotelceller och GABAergic nervceller. I den långväga migrationsanalysen började cellerna som ett rektangulärt plåster på dag noll, men med 48 timmar hade de migrerat ut i det cellfria utrymmet.Immuncytokemiska färgning med Anti-Active Caspase-3 antikropp, en markör för apoptos, visade ingen apoptotisk signal i de seedade nervceller. I den samkultur migration analysen, när interneurons var co-seedade med mänskliga periventricular endotelceller, nervceller reste längre avstånd jämfört med när interneurons var seedade ensam eller när co-seedade med kontroll endotelceller. I chemo-attraktion assay, ett betydligt högre antal interneurons migrerade mot periventricular endotelceller jämfört med kontroll endotelceller, bekräftar att GABAergic interneurons svara selektivt på chemo-attraktiva cues utsöndras av periventricular endotelceller.Dessa analyser kan modifieras med hjälp av ligander, hämmare eller analys arenes att få mekanistiska insikter i interaktioner av mänskliga periventricular endotelceller med mänskliga interneurons. De kan också användas för att studera samspelet mellan mänskliga periventricular endotelceller med andra neurala celler som rapporterats av vår grupp och andra. Vid försök med detta förfarande är det viktigt att fixera insatsen ordentligt på skålen och hålla den ostörd under hela analysen, annars kan det leda till cellläckage, cellavlossning eller feljustering av skäret med den dragna gränsen.Vårt arbete har indikerat cellen autonoma roll mänskliga periventricular endotelceller i patogenes av psykiska störningar som schizofreni, epilepsi och autism. Dessa analyser kommer därför att möjliggöra bedömning av sjuka periventricular endotelceller som härrör från patienter med dessa störningar med hjälp av IPSC-tekniken.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-kultur Primär Rat kortikala neuron och Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Hämmande Synapse Formation i en Co-kultur Modell Införliva GABAergiska Medium Spiny neuron och HEK293 celler som stabilt uttrycker GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptorer

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsalrotsganglier Neuroner och differentierade Fett-härledda Stem Cells: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-kultur modell för att studera perifera nerver Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Räkning av neurala stamceller Använda Klon Analyser

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion av utveckla mänskliga hjärnan In Vitro med stamceller härstammar Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metod för hög hastighet Stretch skada av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived nervceller i en 96-väl Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Uppdelning av mänskliga stamceller-härledda neuroner inom förmonterade plast Microfluidic chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Efter differentiering Replating av mänskliga pluripotenta stamceller-härledda nervceller för hög innehåll screening av Neuritogenes och synapsen mognad

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysera mitokondriell transport och morfologi i mänskliga inducerad pluripotent stamcell-härledda nervceller i ärftliga spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Härledning, expansion, kryopreservation och karakterisering av hjärnans mikrovaskulära endotelceller från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...