Name: abbiategrasso brain bank protocol for collecting, processing and characterizing aging brains
Uploaded: 2020-06-03T13:00:00
Duration: 12 min 28 s
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我们愿把这项工作献给莎·米切拉·曼吉里博士。在她过早去世之前，她构思并开始了阿比亚特格拉索脑库项目。
我们感谢我们的脑力捐赠者，他们慷慨地为捐赠他们身体最崇高的器官的研究作出贡献;没有他们，这种研究是不可能的。
我们感谢瓦莱里亚·马尔扎加利在ABB项目中的宝贵工作。
作者感谢约翰内斯·阿滕斯教授、保罗·福西亚尼博士和乔治·贾科内博士的宝贵指导和明智的忠告。
我们要感谢萨·爱丽丝·西林乔内博士和朱利亚·博尔通小姐在整个项目中提供的宝贵帮助。 非常感谢特雷·卡萨尼夫人的支持，感谢"意大利老年痴呆症"的合作。 作者感谢帕维亚大学公共卫生、实验和法医学系的马特奥·莫雷蒂博士和安东尼奥·马可·玛丽亚·奥斯库拉蒂教授。

作者没有什么可透露的。

协议中的关键步骤 我们的目标是获得，特征和存储优质组织来自从纵向观察获得的详细历史。为了实现这一目标，需要处理以下关键方面。如上所述，议定书从征聘捐助者开始，这是第一个关键步骤。然后，捐赠者必须继续执行后续计划，并随着时间的推移保持对项目的粘附，直到实际捐赠大脑。在死亡时，ABB工作人员必须及时得到通知，以便在24小时内召开验尸小组会议，这对于足够的组织质量非常重要。脑半球的新鲜切割需要稳定的手和特定的训练。为了避免缓慢冷冻造成的细胞损伤，并获得低温和Omics的优质切片，重要的是它们被快速冷冻。考虑到甲醛溶液的渗透速度（1毫米/小时），为了保持组织抗原性，单片的浸泡时间保持在最低水平。
方法的故障排除 为了解决上述关键步骤，我们提供以下方法。捐赠者招募和坚持随从：有几个因素阻碍大脑捐赠，包括担心损害身体的身体，纯洁和完整，或死后感到疼痛的可能性。有些人甚至担心验尸可能在他们还活着的时候进行，他们70，71。,71此外，亦有72个关注，即丧葬安排中断及财政负担。此外，医务人员对验尸程序缺乏了解，无法解决潜在捐赠者或其NOK的关切，可能会阻碍登记。所有这些因素都可能导致意识水平低，登记参加人数减少，而且随着时间的推移，捐助者损失的可能性很大。事实上，捐助者征聘方案应有效地传播认识，灌输信任，并说服人们登记并保持高后续参与率。根据我们的经验，这是通过仔细选择潜在的捐赠者和透彻解释BB的目的。我们提供教育活动和同情的方法，解决健康人和那些患有神经退行性疾病的人及其家庭的恐惧和需求。我们发现，当与人接触时，潜在捐助者更有可能表示同意。面对面的方法创造了一种基于相互信任和尊重的关系，这对实现对大脑捐赠和后续评估的高注册比例至关重要。训练有素的员工具有强烈的道德意识，首先接近潜在的捐赠者，讨论死后捐献大脑的可能性，解释人脑组织对神经科学研究的价值，并澄清任何有关验尸程序的疑问。有利的口碑同样重要。大脑采集后，适当注意和护理重新组合尸体。重要的是要通过温柔地对待尸体来表示对死者的尊重和感激。几个月后，只要家庭成员提出要求，就安排开会，传达神经病理学分析的结果。
死亡和大脑采集的时间：当患者接受时，他们成为捐赠者，并获得一个身份证，号码为24小时/天，每天7天/周联系（与我们相连的AP Golgi-Redaelli老年医院的接待号码）。此外，在住院时，还给亲属贴上胶粘剂标签。该地区的葬礼机构先前被告知将尸体带到ABB设施，在那里传唤了验尸小组。验尸小组由一名病理学家、一名神经科医生和/或神经生物学家以及解剖室技术员组成，他们每天从上午6时至晚上11时就应到;一些受训学生也经常来帮忙和拍照。
新的切割程序的精度和一致性由同一两个操作者（神经学家和病理学家）的参与得到保证，他们开发了这种方法，并在神经病理学方面拥有数年的经验。冷冻切片时，它们被放在预冻结的铝托盘上，并覆盖着一个联锁的铝板，以保持它们平整。紧接着，它们被放入液氮3分钟，然后将它们储存在-80°C。 要固定的切片单独包裹在纱布中，浸泡在10%磷酸盐缓冲的甲醛溶液中，一天后被替换。随后，他们被正式保留不超过5天;然而，考虑到形式溶液渗透在1毫米/天，我们想进一步缩短浸泡时间。
方法的限制 此处描述的研究方法仅涵盖有限的地理区域，参与捐赠计划的个人具有不完全代表一般人群的特征。虽然不能接受，验尸间隔长达24小时可能会产生改变的蛋白质结构，酶和RNA的脑组织。AFS 和 pH 的测定可能不完全足以确定组织质量73，我们正在开发基于 RNA 完整性的组织质量验证的其他方法。
关于微切切程序，虽然对重建解剖关系非常有用，但应该指出，使用大切量并不简单，并存在一些技术困难。我们的方法具有挑战性和耗时。成本相当高，资金筹措并不总是容易的。资金主要来自公共（ASP Golgi-Redaelli老年医院）和私人资源（Golgi-Cenci基金会）、私人捐款、非营利组织（如"意大利老年痴呆症"）和赠款参与。
ABB方法对现有/替代方法的意义 一开始，我们的脑力捐赠计划针对参与 InveCe.Ab 纵向研究的个人。因此，捐赠的大脑伴随着多年来收集的详细的临床、生物和社会信息。ABB的实力正是源于这一独特的起源。事实上，研究一组具有共同生物特征和环境接触的社会和基因相关的人可以加强统计分析。此外，该研究还包括以下好处：1） 照顾和满足社区的需要（"先问前给予"的行为）：人们接受免费定期检查，并告知全科医生，提供我们秘书的电话号码进行咨询，并在家里看望严重残疾的人;2） 通过定期举办研讨会（与大脑健康、大脑捐赠和一般健康有关）和规划专题课程（例如为老年人使用信息技术设备），使参与者、具有公共角色的人和全科医生参与教育活动;3） 与人会面，采取面对面的方式。所有这些因素构成了ABB项目的优势。此外，该项目提高了相关人员的临床能力，因为他们在产前评估和死后神经病理学评估方面获得了经验。在这方面，我们要提及"少数民族老龄化研究"的非常特殊的经验。这项研究涉及居住在芝加哥地区的非洲裔美国人人数有限和选定的人数（在1，357个合格受试者中，有784人：回答率为57%）。参与者每年在家参观，并被要求参加大脑捐赠计划。这项研究是基于一个不寻常的方法，一些类似的，我们获得高比例的正面反应，大脑捐赠计划（352捐赠者在784名参与者中登记：44%），虽然验尸率不太令人满意（53%）74。就像《少数民族老龄研究》一样，我们提供教育活动和感同身受的方法，取得了优异的成绩。特别是我们的回复率为93%，注册率为28.7%，验尸率为67%。这些比率表明，直接吸引人们参与的项目在捐款中所占的比例较高。其他脑力捐赠计划，较少注意建立与潜在的捐赠者的关系，一般有一个较低的注册率，是大约10-15%或更少的73，75。,75
以前很少有队列研究以神经病理学分析结束。此外，大多数脑库和储存库都以疾病为中心，与"患病"大脑的数量相比，健康捐赠者的"控制"大脑稀缺。只有有限的BB是基于人口研究，涉及疾病和正常科目，以研究老化轨迹73，74，76，77，78，79，80。73,74,76,77,78,79,80一些研究，如"少数民族老龄化研究"在美国74和"Vantaa 85+研究"在芬兰76类似于我们的，但他们往往用完与队列的终止。相反，ABB的捐赠计划预计在未来很长一段时间内继续，争取潜在的捐赠者，甚至在 InveCe.Ab 纵向研究结束后也安排后续工作。这种方法使我们的招聘方法类似于"太阳健康研究所（SHRI）脑捐赠计划"，该计划针对的是一个退休社区73。SHRI 脑捐赠协议非常有效，平均验尸间隔在世界上最短（3.92 小时）。与世界上最大的BB类似，SHRI协议只是将中线（下垂平面）的脑、小脑和脑干切开，然后一半被解剖新鲜并冷冻用于生化研究，而另一半则固定在形式中进行组织病理学评估。然而，SHRI 解剖协议的优点之一是固定单个切片而不是整个半球。事实上，固定一个半球作为一个整体并不是最佳的，因为表面和核心之间的固定梯度不同。此外，皮质蛋白可能受到长期接触甲蛋白溶液的影响。因此，我们决定修复单个切片的原因。
决定哪一方是固定的或冻结的，取决于单一银行（总是相同的，随机分配或分配取决于解剖日是奇数还是偶数）31，32，33，34，35。31,32,33,34,35因此，每个半球分别进行生化和组织病理学分析。由于许多神经系统疾病是不对称的，我们的BB提供了一个独特的协议，切片新鲜标本：从脑干和从小脑和大脑的每个半球的替代部分保留为固定或冷冻材料;一个半球上的固定切片对应于另一个半球上的冻结切片。我们的方法使有机会获得所有冷冻材料的完整组织学特征，并比较双方所有领域的结果。如导言所述，所述方法使我们能够从脑组织中获取尽可能多的信息。此外，ABB的方法产生了一个基本但完整的神经病理学特征，包括几乎所有已知的脑蛋白病和血管病理学。由于血管损伤在确定认知障碍方面的争议作用，我们决定使用双分的血管负担30，53。30,
如协议所述，我们使用多学科方法。虽然这是一个耗时和费力的方法，我们相信它为研究提供了几个优势。例如，在之前的一些工作中，我们证明了与APOE-+4等位基因相关的高thFR C677T TT本身可能与执行功能障碍有关，而不是与记忆丧失81有关。因此，在神经病理学层面上评估具有此特定遗传特征的受试者可能很有趣。这是一个例子，说明这种深入的后续行动如何有助于创造新的研究假设，通过调查我们银行收集的生物材料来验证。我们方法的另一个优点是将 QEEG 纳入我们例行执行的评估中，因为它的独创性和相对易用性。事实上，EEG通过记录属于皮质金字塔神经元82的树突的电位来检测大脑皮层的突触活动。QEEG可被视为估计皮质突触活动的生物标志物，这与认知83有关。特别是，大脑后部的α节律减少，频率普遍增加（泰塔和三角洲节律）与皮质连接分解有关。应当考虑的是，大多数诊断相关性研究都是基于临床诊断，而临床诊断只是一种可能而不是明确的诊断84、85、86、87。84,85,86,87只有很少的针对性研究将QEG数据与神经病理学图进行比较，以研究QEG和LTS变种88、89之间的相关性，以及FTLD和AD83之间的区别。88,通过以神经病理学诊断的定义结束我们的研究，可以正确地解释对脑电活动的观察。此外，在每个学科中执行串行QEG，我们可以跟踪个体脑电图波内轨迹及其与神经病理学图的相关性。随着时间的推移，皮质电活动经过个别修改后，可以更好地了解其作为初期痴呆症的生物标志物的含义。
方法的未来应用和方向 实施组织分布是我们的主要目标之一。为此，我们成立了一个科学委员会，其中包括GC基金会（老年病学家）的主任，帕维亚大学神经学的学者，神经学家和病理学家，都来自GC基金会和老年医院ASP Golgi-Redaelli。在分发脑组织、组织学幻灯片和其他生物样本时，重要的是要记住，捐赠者为了研究而同意捐赠。因此，材料的分配应谨慎进行，正如 BNE 行为准则40 中所述。提交材料请求的任何一方都应指明所需样品的类型和数量，提供研究项目的描述以及如何使用样品，并尽可能提供以前出版物的证据（关于转让协议， 见图9）。脑库不为经济利益而工作。因此，研究人员支付的费用应只支付组织采购、加工、储存和分配的费用。
开始使用外显组测序和Omics技术（如蛋白质组学和转录组学）开始分析案例的计划正在启动中。我们的替代采样方法将允许对来自两个半球的组织学定义明确的组织进行奥米学研究。通过这种方法，可以比较同一半球的不同大脑区域和其他半球相应区域的基因活化模式，并能够将基因激活与组织病理学关联。在这个领域，深度学习应用将具有极大的兴趣，包括组织学幻灯片的计算机化分析以及临床、组织学和奥米学数据的前沿相关性。可以识别许多不同的变量之间的其他相关性以及其他可能的技术应用。两个半球的冷冻材料的可得性将允许对基因活化和蛋白质分布进行准确的地形。考虑到大脑功能和某些疾病都是不对称的，这甚至对健康受试者也特别感兴趣。
此外，我们可以从具有良好特征的脑捐赠者获得细胞培养。事实上，收获大脑的细胞培养物提供活细胞，可用于进一步研究疾病或衰老机制，通过诱导多能干细胞（iPSCs）技术，包括重新编程钩端细胞细胞，并在高级模型90中将它们分化成神经细胞。
随着大脑老化，在分子、细胞和组织水平上可能会发生不同的变化轮廓。每个大脑都是独一无二的。每个国家都有自己的应对内部和外部压力的方式;有些人抵抗， 而其他人屈服， 并显示不同的病理。临床表现和神经病理学图之间的差异通常存在，因为病变的地形，而不是其分子性质，决定了临床表现。只有将临床综合征与神经病理学发现相结合，才能正确和明确的诊断，而神经病理学的发现往往为解开疾病的发病机制而增加重要的病因线索。在欧洲，人们努力创建一种神经病理学诊断的标准方法。我们的诊断方案几乎完全遵循最近发布的关于脑科91神经病理学诊断的指南。这将使我们能够收集和分享有据可查的脑组织，并有望建立第一个意大利脑库。事实上，在意大利有大脑储存库，但没有基于队列研究的脑库。我们的目标是开发一种脑组织采集方法，可以在意大利广泛实施，建立一个使用共同协议并共享可比材料的网络。为此，其他研究中心的参与和建立一个具体的网站是今后的主要目标之一。
创新技术不断用于神经退行性疾病的分子性质分析和生物标志物识别。在此背景下，对大脑的需求将日益增加，同时需要通过纵向研究获得的认知和衰老轨迹信息，强调神经病理学验证流行病学方法92的重要性。

据世卫组织说，目前约有5 000万人患有痴呆症，预计到2050年这一数字将增加两倍。阿尔茨海默病是痴呆症的主要病因，其次是脑血管疾病和其他与年龄相关的神经退行性疾病。2017年，世卫组织开发了全球痴呆症观察站，以提高对痴呆症的认识，并鼓励制定全球行动计划。每个人都有自己的大脑老化轨迹，因此，由于神经退行性疾病的发病机制的复杂性，寻找治疗方法可能具有挑战性。也许，每个人都拥有他或她自己的发病机制写在脑组织需要个性化的方法。因此，脑组织的研究将是理解神经退化机制的关键。
回顾神经科学的历史，我们意识到，如果没有人类大脑的直接检查，最令人印象深刻和突破性的发现是不可能发生的。一直，要研究的脑组织来源从粗糙的解剖、随机的"偶然相遇"，在某些情况下，非法交易，到有组织的脑收集和战略性的现代脑库。许多伦理方面的考虑是现代脑库与过去大脑集合不同的主要因素之一。第一个真正的现代脑库（BBs）是在20世纪下半叶建立。尼古拉斯·科塞利斯和华莱士·图尔特洛特可以被认为是现代脑库的先驱。在英国，Corsellis收集了一个集合，收藏了1000多个有据可查的大脑，这些大脑受到各种精神和神经疾病的影响。此外，科塞利斯帮助揭示需要保存新鲜脑组织在冰，以生化测试3。与此同时，在美国，华莱士·图尔特洛特推出了前脑捐赠计划，以促进潜在的大脑捐赠者的征集，并确保收集的大脑伴随着完整的医学和神经史4,4，5。有关大脑集合和现代 BB 的历史概述，请参阅 Carlos等人。6.
那么，为什么我们仍然需要人类的大脑呢？脑病只有在神经病理学检查后才能得到明确的诊断。神经病理学挑战临床诊断，是正确解释临床症状和发现新合成变异的组理基础的关键。事实上，诊断可以根据病理图片重新定义。然而，由于最近创新的神经成像技术的发展，验尸率在最近几十年中有所下降。通过脑成像，可以评估大脑的形态、功能和代谢变化，以及蛋白质错折叠的程度。然而，体内神经成像和其他生物标志物研究只能给出病理图的"估计"，因为它们无法检测到微妙的细胞和分子变化。分子成像和发现新的生物标志物、靶分子和示踪剂7（如淀粉样体、TAU、微胶痕示踪剂）的进步使得人脑对临床评估和生物标志物测试获得的数据的解释更加不可或缺。此外，基因组技术（基因组学，表观基因组学，转录组学，代谢组学，蛋白质组学， 唇部疾病等），在新鲜和冷冻脑组织上进行，为了解疾病机制和发现风险基因、新的诊断和预后标记以及潜在的药物靶点,,,,,8,8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23开辟了新的可能性。9,10,1112,13,14,15,16,17,20,21181922
为了这些目的，现代BB存档良好的特点，高质量的脑组织，使他们提供给科学界3,3，24。BB 提供的大脑应附有完整的临床史。BB的活动包括：（1） 确认和招募患病和健康的人参加脑捐赠计划;理想的条件是实现捐赠者一生多学科的随从，以获得完整的临床、生活方式和社会历史，以及生物标志物特征;事实上，认知储备和大脑结构取决于生活方式和社会教育因素25，26，所以这些信息丰富了手头的总数据。25,（2） 在捐赠者死亡后获得大脑（包括脑、小脑和脑干）和相关组织（如脊髓、颅神经和神经神经等），同时遵守标准化的法律和道德规范。（3） 适当的处理（解剖，固定，冻结）的大脑，如标准化的手术协议定义，以获得高质量的组织，并允许将来用于多学科研究。（4） 详细的神经病理表征提供最终的诊断。（5） 组织材料的储存和分发到研究界27，28。27,
所有 BB 都存储冷冻和形式固定石蜡嵌入组织。每个 BB 都有自己的协议。除了特定的研究，如生物医学研究所（新泽西州）29和德拉梅科特的脑血管病理学30的研究，世界上最大的BB只是削减脑，脑和脑干沿中线（盐面）。一半被解剖新鲜，然后冷冻进行生化研究，而另一半被固定在形式素组织病理学评估。因此，每个半球分别进行生化和组织病理学分析。决定哪一方是固定的或冻结的（横向），取决于单一银行31，32，33，34，35。31,32,33,34,35由于许多神经系统疾病是不对称的，我们的BB提供了一个独特的协议，切开新鲜的大脑：脑干和每个半球的相邻部分交替固定和冻结;一个半球上的固定切片对应于另一个半球上的冻结切片。通过这种方法，优化了脑组织的使用，并实现了所有冷冻物质的完整组织学特征，并有可能从两个半球的所有区域获取和比较组织学和生化信息。
我们脑库项目的框架是阿比亚特格拉索镇。Abbiategrasso 是意大利北部米兰市西南约 22 公里处的一个小镇。它的人口约为32，600人。它是戈尔吉-森奇（GC）基金会的家。GC基金会是大型康复老年医院（ASP Golgi-Redaelli）的一部分，是一个专注于老年人老龄化和护理研究的研究所。特别是研究精神老化、影响心理老化的社会和行为因素，以及影响年龄依赖性神经认知障碍（NCDs）的生物学和病理学。2009年，GC基金会对1321名参与者（在1644个合格科目中：初始答复率为80.3%）开展了一项新的纵向研究1935年至1939年（70-75岁）之间出生，白种人，居住在同一小地理区域。这项研究被称为InveCe.Ab （Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso;在英语中： 脑老化 Abbiategrasso， ClinicalTrials.gov， NCT01345110）， 目前正在进行中。InveCe.Ab计划获得一个同质性最大、变异性最小的队列，以评估痴呆症的发病率、患病率和自然史，以及可能的风险或保护因素，包括行为、社会心理、临床和生物变量36。队列的特征如图1 和表 1 所示。流行病学数据符合欧洲37、38,38和 InveCe.Ab人群的痴呆症趋势，具有同质的遗传和环境特征，是研究从正常衰老到神经认知障碍的轨迹的一个很好的模型。事实上，同质种群需要较少的受试者才能达到足够的统计能力。InveCe.Ab 方法已经在其他地方报告过 36，但重要的是，使用同一组评估（包括：血液采样（代谢面板、同型半胱氨酸和维生素，DNA提取到配置文件Apolipo蛋白E（APOE）和其他与认知和衰老有关的遗传多态性，人体测量（体重，身高和腰部），边走边说话测试（双重任务测试），评估生活方式（地中海饮食坚持，身体活动和认知参与水平）和社会因素（社会参与，孤独），神经心理学评估和临床一般检查。将这种纵向数据与死后神经病理学数据进行比较对研究至关重要。因此，我们的团队，特别是米切拉·曼吉里博士设想了上述神经病理学方法。自2014年以来，在第二次随从中，InveCe.Ab参与者被要求捐献他们的大脑，从而诞生了Ab;avegrasso脑库（ABB）。ABB的核心捐赠者是 InveCe.Ab 的参与者，但 ABB 现在向其他志愿者捐赠者开放。他们是来自 ASP Golgi-Redaelli 的患者，那里是几个患有不同神经系统疾病的患者或成人志愿者的家，他们了解 ABB 项目，属于同一地理区域（Abbiategrasso 和环境）。所有捐助者都接受相同的评价协议。
作者提出了一种方法，跟踪正常衰老的个体轨迹和可能的进展到非传染性疾病，并准确地管理，处理和描述从这些捐赠者获得的大脑纵向跟随。此外，我们的目标是与个人会面，让他们参与有关大脑健康情况的定期神经评估、研讨会和教育活动，并提高他们对为研究目的捐赠大脑的认识。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>50ml polypropilene conical tube 30x115mm</td>
			<td>BD</td>
			<td>405253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN (A60)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho TAU (AT8)</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>MN1020</td>
			<td>monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2)</td>
			<td>CosmoBio</td>
			<td>TIP-PTD-P02</td>
			<td>policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-SYN (KM51)</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-ASYN</td>
			<td>monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;amyloid (4G8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>800703</td>
			<td>monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting board</td>
			<td>BD</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>FA30WL0101500</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical saw with 5d blade</td>
			<td>CEA</td>
			<td>06.06.14/06.00.16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode pH measure surface 12mm</td>
			<td>CEA</td>
			<td>70064.250 HHH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode pH needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11796338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+System-HRP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K4001</td>
			<td>secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+System-HRP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K4003</td>
			<td>secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylether</td>
			<td>SMI</td>
			<td>8401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather safety trimming knife blade 14cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11749798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>FA30WS1810500</td>
			<td>medium supplement; dilution = 20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 15cm surgical or anatomical</td>
			<td>Uvex</td>
			<td>500XG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>CEA</td>
			<td>01.28.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>Arcobaleno</td>
			<td>2624000800002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head supporter</td>
			<td>Lacor</td>
			<td>60456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>FA30WX0550100</td>
			<td>medium supplement; dilution = 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring tape</td>
			<td>CEABIS</td>
			<td>CEATA34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non adsorbable monofilament black polyamide</td>
			<td>UHU Bostik</td>
			<td>8000053131470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td>medium supplement; dilution = 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strept Solution (100X)</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>FA30WL0022100</td>
			<td>medium supplement; dilution = 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm</td>
			<td>CEA</td>
			<td>03.06.16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpel with n&#176;21 blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical basin</td>
			<td>Olcelli Farmaceutica</td>
			<td>A930857255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical mallet and surgical cisel</td>
			<td>CEA</td>
			<td>79.68.88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>CEA</td>
			<td>27.08.45/79.68.64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Feather</td>
			<td>M130RC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

abbiategrasso brain bank protocol for collecting, processing and characterizing aging brains

在人口不断老龄化的人群中，神经退行性疾病的患病率预计将上升。了解疾病机制是找到预防和治疗措施的关键。实现这一点最有效的方法是通过直接检查患病和健康的脑组织。作者提出了一个方案，以获得，处理，特征和存储优质的脑组织捐赠的个人捐赠的产前脑捐赠计划。捐赠计划包括面对面的感同身受的方法，收集互补的临床、生物、社会和生活方式信息，以及一段时间的连续多维评估，以跟踪正常衰老和认知衰退的个人轨迹。由于许多神经系统疾病是不对称的，我们的脑库提供了一个独特的协议，切片新鲜标本。两个半球的大脑部分交替冻结（在-80°C）或固定在形式中;一个半球上的固定切片对应于另一个半球上的冻结切片。通过这种方法，可以获得所有冷冻材料的完整组织学特征，并且可以对来自两个半球的组织学定义明确的组织进行奥米学研究，从而提供神经退行性疾病机制的更完整的评估。只有将临床综合征与神经病理学评价相结合，才能正确、明确地诊断这些疾病，这往往增加了解释发病机制所需的重要病因线索。此方法可能非常耗时、昂贵且有限，因为它只覆盖有限的地理区域。无论其局限性如何，它提供高度的表征可能是有益的。我们的最终目标是建立第一个意大利脑库，同时强调神经病理学验证流行病学研究的重要性。

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Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

该协议描述了一种通过大脑捐献计划和大脑的适当表征来跟踪个体大脑老化轨迹的方法。脑捐献者参与长期纵向研究，包括连续的多维评估。该协议包含大脑处理的详细描述和准确的诊断方法。

Abbiategrasso 脑库协议，用于收集、处理和描述老化的大脑

In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find ...

由于神经认知障碍的患病率不断增加，我们的目标是获取、描述和储存高质量的脑组织样本，以实现准确的诊断，并揭示神经退行机制。考虑到大脑不对称，我们的采样方法允许所有元研究在两个半球的组织学定义明确的组织上进行，许多数据可以通过深度学习来收集和关联。经常观察到多种病理对脑损伤的增效。明确的诊断需要结合临床综合征与神经病理学的发现，以发现疾病发病机制，和可能的疗法。新的切割程序以及宏观部分管理是棘手的，但也是取得好成绩所必不可少的。一支训练有素、训练有素的团队对于克服这些困难至关重要。我们的协议包括一系列需要哺乳动物灵巧的步骤，因此视觉演示比希望掌握这些技术的研究人员的描述性文本更有用。确认比图成像后，使用锋利的手术刀，使头皮切口通过头发皮肤和皮下组织在日冕板从一侧的乳腺过程尖端到另一侧，通过顶点。小心地将头皮的两个褶皱从头骨中分离出来，然后继续切口，直到黄色超轨道脂肪变得可见。前部反射头皮，后拉组织的另一部分。使用手术刀和钳子，在头骨的每一侧采集一小些时间肌肉样本，将一个样本放入4%甲醛中，将另一个样本置于4摄氏度。用电锯在正面的 V 切口中切割头骨，并取下头骨盖。切毛素后，收获一片杜拉固定，另一块冷冻。插入一根 20 量 3.5 英寸的针头，通过气管卡洛苏姆连接到 10 毫升注射器，到达第三个心室并缩回柱塞以获得约 10 毫升的脑脊髓液。评估液体的外观颜色和浊度并测量pH值。轻轻拉上两个前叶，抬起大脑，切开两个视神经，内皮动脉和第三，第四，第五和第六颅神经。切开触角，到达后侧，切开椎动脉和下颅神经。然后插入手术刀尽可能深，通过前脑巨无霸切割最多的毛骨的麦地那部分，并小心地去除整个大脑。使用手术刀出现在梅克尔洞穴的骨头上，从每边收集加塞里安帮群进行固定和冻结。使用手术锤和凿子将骨性塞拉图西卡断裂，并去除垂体，用于固定4%甲醛。检查头骨和整个大脑从宏观变化和血管的变化。使用测量带测量大脑的横向和前部姿势直径，并测量大脑的量度。小心检索威利斯的圆圈，用于对解剖变异、病变或血管狭窄是否存在进行宏观评估。分离并检查脑、小脑和脑干，然后分别称量组织。从凸面中去除一至二至四厘米平方的钩端，并在四摄氏度下将样品保存在完全高葡萄糖DMEM培养基中。收获松果腺固定在4%甲醛，并删除嗅球和视神经固定和冻结每对之一。在摄氏四度的冰面上放置脑、脑和脑干。当所有感兴趣的组织都收获时，使用超级粘合胶重新连接骨骼，并使用手术针，以及不可吸收的缝合线缝合回头皮。对于脑库解剖使用解剖刀轴向切割脑干，并通过优越的合体在中脑水平进行第一次切割，以获得两片，以暴露的亚斯坦蒂格。将脑干切成10，8毫米的切片，注意包括通过靠近第四个心室的上级边缘的 rostral pons 的切口，以观察耳原，并通过低于声学的梅杜拉长方形，正高于第四个心室的劣质顶点，以获得切片，包括迷走者头部运动核。以旋转式脑筋标记所有切片为脑干的 BS，后跟阿拉伯数字。最后一个脑干部分后，使用脊髓的 SC 名称，后跟阿拉伯数字。切割下垂平面上的小脑以分离两个小半球，并在 vermis 级别执行下垂剖切，以便从每个半球获得五个切片。分别将 vermis 中的所有切片命名为右脑和左小脑的 CBR 或 CBL，并使用阿拉伯数字标识每个部分。接下来，通过下垂平面上的语料库将脑膜的两个半球分开，然后沿着光晕平面和母体之间通过前叶时间极、前角、前侧角、小细胞核、小细胞核和基底刚体，将半球切开为奇异的。做第二个切口约一厘米后通过妈妈的身体，并暴露基底神经节，前塔拉穆斯亚，和杏仁核。继续切片以解剖前区域和后区域，直到每个半球获得 15 到 21 厘米的切片。将切片放在平面上，因为它们是按照其从正面到前后向的原始位置到达的，部分与前面的幻灯片朝上是连续的。放置所有切片后，选择要固定用于组织病理学的主要部分，包括先前获得的截面和海马、面体和腹皮部分，并标记切片为 L 或 R，后跟阿拉伯数字，包括指示切片是固定的还是冻结的标签。当所有组织都已分割和标记后，在固定或冻结之前获取每个系列部分的图像。要冻结样品，请将保留的备用组织部分放在预冷冻铝托盘上，并用联锁铝板覆盖这些部分，以保持其平整。然后将冷冻样品冷冻在液氮中三分钟，然后将冷冻样品放入标有相应识别码和切片编号的塑料袋中，以在 80 摄氏度下将切片储存在适当的低温箱中。要固定样品，将保留的备用组织部分放在单独的纱布片中，并在 4 摄氏度的冷室中将切片放在 10%磷酸盐缓冲的甲醛溶液中五天。在采集的27个大脑中，有24个获得了完整的神经病理特征，并进行了明确的临床病理诊断。对36名脑捐献者进行的初步定量脑电图分析表明，主要神经认知障碍的主要阿尔法节律百分比明显低于正常老年人轻度神经认知障碍。这里显示了一个不对称病理学的例子，与右侧萎缩明显宏观与严重的心室扩张观察到的右冠部分相比，左边。另一个病例显示右半球的梗塞，而另一个标本显示右千米身体的明显萎缩。宏部分可以染色，以确定米林损失或免疫反应在半球内的分布。这些样本来自双胞胎，由于表观遗传和环境因素，他们在不同的时间范围内有阿尔茨海默氏症的临床发病。然而，微观分析揭示了一个非常相似的神经病理学图片，表明高阿尔茨海默氏症病理学和淀粉样动物病。然而，在两名患者中，对阿尔茨海默病的相同临床诊断并不完全符合神经病理学特征，这揭示了多种病因中的痴呆症二重奏。事实上， 第一个案件提出了莱维的身体在陀螺单谎言和征服尼格拉。第二个病例显示，在杏仁核和未成年人核中，Lewy的身体与Lewy的中性细胞有关。在微观分析过程中，仔细观察切片照片，以便准确识别解剖区域。单片的固定和冷冻对于保存组织微观结构奥米学基因活化和蛋白质分布的地形，以及将这些数据与组织病理学关联也非常重要。细胞培养物来自特征良好的组织，也是对疾病发病机制的调查。始终穿戴足够的个人防护设备，因为既得脑组织被认为具有潜在的传染性，并且需要使用危险工具，如锋利的仪器和液氮。

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Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

低聚β-淀粉样蛋白的制备 1-42和突触可塑性损伤诱导海马脑片

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

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TMS：使用的Theta突发协议，以探索个人与脆性X综合征与孤独症的可塑性Mechasnism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

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整个老鼠大脑与光共聚焦显微镜板微米级分辨率光学层析成像

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一个简单的一步解剖协议成人全安装准备<em&gt;果蝇</em&gt;脑

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Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

斑马鱼脑幼虫神经元、巨噬细胞和小胶质的分离和 RNA 提取

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

矩阵辅助激光去离子成像质谱法显示人脑中的淀粉样β矿床

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...