Name: abbiategrasso brain bank protocol for collecting, processing and characterizing aging brains
Uploaded: 2020-06-03T13:00:00
Duration: 12 min 28 s
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Diese Arbeit möchten wir Dr.ssa Michela Mangieri widmen. Bevor sie vorzeitig starb, konzipierte und gründete sie das Abbiategrasso Brain Bank Project.
Wir sind unseren Hirnspendern dankbar, die großzügig zur Forschung beitragen, die das edelste Organ ihres Körpers spendet; ohne sie wäre diese Forschung nicht möglich.
Wir danken Valeria Marzagalli für ihre wertvolle Arbeit im ABB-Projekt.
Die Autoren danken Prof. Johannes Attems, Dr. Paolo Fociani und Dr. Giorgio Giaccone für ihre wertvolle Beratung und klugen Rat.
Wir danken Dr.ssa Alice Cirrincione und Miss Giulia Bortone für ihre wertvolle Hilfe während des gesamten Projekts. Vielen Dank an Frau Tere Cassani für ihre Unterstützung und an "Federazione Alzheimer Italia" für die Zusammenarbeit. Die Autoren danken Dr. Matteo Moretti und Prof. Antonio Marco Maria Osculati, Institut für Öffentliche Gesundheit, Experimentelle und Rechtsmedizin, Universität Pavia.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Nach Angaben der WHO leiden derzeit etwa 50 Millionen Menschen an Demenz, eine Zahl, die sich bis 2050 voraussichtlich verdreifachen wird. Die Alzheimer-Krankheit ist die Hauptursache für Demenz, gefolgt von zerebrovaskulären Erkrankungen und anderen altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen. Im Jahr 2017 entwickelte die WHO das Global Dementia Observatory, um das Bewusstsein für Demenz zu schärfen und einen globalen Aktionsplan gegen demenz zu fördern1. Jeder Mensch hat seine eigene Gehirnalterungsbahn, daher kann die Suche nach der Heilung aufgrund der Komplexität der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen schwierig sein. Vielleicht besitzt jede Person ihre eigene Pathogenese, die im Gehirngewebe geschrieben ist und einen personalisierten Ansatz erfordert. So wird die Untersuchung von Hirngewebe der Schlüssel zum Verständnis der Mechanismen der Neurodegeneration sein.
Wenn wir auf die Geschichte der Neurowissenschaften zurückblicken, erkennen wir, dass die beeindruckendsten und bahnbrechenden Entdeckungen ohne die direkte Untersuchung des menschlichen Gehirns niemals hätten passieren können. Im Laufe der Zeit hat sich die Quelle des zu untersuchenden Hirngewebes von groben Sezierungen, zufälligen "Chance-Begegnungen" und in einigen Fällen illegalem Handel zu organisierten Gehirnsammlungen und strategischen modernen Gehirnbanken gewandelt. Die Berücksichtigung vieler ethischer Aspekte ist einer der Hauptfaktoren, die moderne Gehirnbanken von den Hirnsammlungen der Vergangenheit unterscheiden. Die ersten echten modernen Brain Banks (BBs) wurden in der zweiten Hälfte des20. Jahrhunderts eingeführt. Nicholas Corsellis und Wallace Tourtelotte können als Pioniere des modernen Brain Banking sanieren. Im Vereinigten Königreich hat Corsellis eine Sammlung mit über 1000 gut dokumentierten Gehirnen zusammengestellt, die mit verschiedenen psychischen und neurologischen Erkrankungen betroffen sind2. Darüber hinaus half Corsellis, die Notwendigkeit zu offenbaren, frisches Gehirngewebe im Eis für biochemische Tests zu erhalten3. In den USA führte Wallace Tourtelotte unterdessen antemortem Gehirnspendenprogramme ein, um die Anwerbung potenzieller Hirnspender zu erleichtern und sicherzustellen, dass die gesammelten Gehirne von einer vollständigen medizinischen und neurologischen Geschichte begleitet werden4,5. Einen historischen Überblick über Hirnsammlungen und moderne BBs finden Sie unter Carlos et al. 6.
Warum brauchen wir also noch menschliche Gehirne? Hirnerkrankungen können erst nach neuropathologischer Untersuchung eine definitive Diagnose gestellt werden. Die Neuropathologie stellt die klinische Diagnose in Frage und ist der Schlüssel zu einer korrekten Interpretation der klinischen Symptome und zur Entdeckung der histologischen Grundlagen neuer syndromischer Varianten. Tatsächlich kann die Diagnose anhand des pathologischen Bildes neu definiert werden. Dennoch ist die Autopsierate in den letzten Jahrzehnten aufgrund der jüngsten Entwicklung innovativer Neuroimaging-Techniken zurückgegangen. Durch die Bildgebung des Gehirns können die morphologischen, funktionellen und metabolischen Veränderungen im Gehirn sowie das Ausmaß der Proteinfehlfaltung in vivobewertet werden. In vivo-Neuroimaging und andere Biomarker-Studien können jedoch nur eine "Schätzung" des pathologischen Bildes ergeben, da sie nicht in der Lage sind, subtile zelluläre und molekulare Veränderungen zu erkennen. Fortschritte in der molekularen Bildgebung und die Entdeckung neuer Biomarker, Zielmoleküle und Tracer7 (z. B. Amyloid, TAU, mikrogliale Tracer) machen das menschliche Gehirn für die Interpretation von Daten aus klinischen Auswertungen und Biomarkertests noch unverzichtbarer. Darüber hinaus sind die Omics-Technologien (Genomik, Epigenomik, Transkriptomik, Metabolomik, Proteomik, Lipidomik, etc.), durchgeführt auf frischem und gefrorenem Hirngewebe, eröffnete neue Möglichkeiten zum Verständnis von Krankheitsmechanismen und zur Entdeckung von Risikogenen, neuartigen diagnostischen und17,prognostischen Markern und potenziellen Wirkstoffzielen8,9,10,11,12,15,15,,17,,18,1919,20,21,22,23.
Zu diesem Zweck archivieren moderne BBs gut charakterisierte, hochwertige Hirngewebe, die sie der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung stellen3,24. Die von BBs gelieferten Gehirne sollten von einer vollständigen klinischen Vorgeschichte begleitet werden. Die Tätigkeit eines BB umfasst Folgendes: (1) Anerkennung und Rekrutierung von erkrankten und gesunden Personen für Gehirnspendenprogramme; die ideale Voraussetzung wäre, eine multidisziplinäre Nachbeobachtung der Spender im Laufe des Lebens zu erreichen, um eine vollständige klinische, Lebensstil- und Sozialgeschichte sowie Biomarkerprofile zu erhalten; in der Tat hängen kognitive Reserve und Gehirnstruktur von Lebensstil und sozio-pädagogischen Faktoren25,26ab, so dass diese Informationen die gesamtdaten bereichern. (2) Erwerb des Gehirns (bestehend aus Großhirn, Kleinhirn und Hirnstamm) und verwandten Geweben (z. B. Rückenmark, Hirnnerven und Ganglien usw.) nach dem Tod des Spenders, wobei standardisierte rechtliche und ethische Vorschriften beachtet werden. (3) Angemessene Verarbeitung (Zerlegung, Fixierung, Einfrieren) des Gehirns im Sinne eines standardisierten operativen Protokolls, um hochwertiges Gewebe zu erhalten und eine zukünftige Verwendung in der multidisziplinären Forschung zu ermöglichen. (4) Detaillierte neuropathologische Charakterisierung mit einer endgültigen definitiven Diagnose. (5) Lagerung und Verteilung von Gewebematerial an die Forschungsgemeinschaft27,28.
Alle BBs speichern sowohl gefrorene als auch formalinfixierte Paraffingewebe. Jede BB hat ihr eigenes Protokoll. Mit Ausnahme bestimmter Studien, wie dem bihemisphärischen Schnittprotokoll des Biomedical Research Institute (New Jersey)29 und der Deramecourt-Studie zur zerebrovaskulären Pathologie30, schneiden die größten BBs der Welt einfach das Großhirn, Kleinhirn und Hirnstamm entlang der Mittellinie (sagittale Ebene). Die eine Hälfte wird frisch seziert und dann für biochemische Studien eingefroren, während die andere für die histopathologische Bewertung formalin fixiert ist. So werden biochemische und histopathologische Analysen getrennt auf jeder Hemisphäre durchgeführt. Die Entscheidung, welche Seite fixiert oder eingefroren ist (Lateralität), hängt von der Singularbank31,32,33,34,35ab. Da viele neurologische Erkrankungen asymmetrisch sind, bietet unser BB ein einzigartiges Protokoll zum Schneiden frischer Gehirne: benachbarte Abschnitte des Hirnstamms und jeder Hemisphäre sind abwechselnd fixiert und eingefroren; eine feste Scheibe auf einer Hemisphäre entspricht einer gefrorenen auf der anderen Hemisphäre. Durch diese Methode wird die Verwendung von Hirngewebe optimiert, und eine vollständige histologische Charakterisierung des gesamten gefrorenen Materials kann mit der Möglichkeit erreicht werden, histologische und biochemische Informationen aus allen Bereichen beider Hemisphären zu erhalten und zu vergleichen.
Der Rahmen unseres Brain Bank Projekts ist die Stadt Abbiategrasso. Abbiategrasso ist eine kleine Stadt etwa 22 km südwestlich der Stadt Mailand in Norditalien. Es hat eine Bevölkerung von etwa 32.600 Menschen. Hier befindet sich die Golgi-Cenci (GC) Stiftung. Die GC Foundation ist Teil eines großen Rehabilitation Geriatric Hospital (ASP Golgi-Redaelli) und ist ein Institut, das sich auf die Erforschung des Alterns und der Altenpflege konzentriert. Insbesondere konzentriert es sich auf die Untersuchung des mentalen Alterns, der sozialen und Verhaltensfaktoren, die es beeinflussen, und der Biologie und Pathologie, die altersabhängigen neurokognitiven Störungen (NCDs) zugrunde liegt. Im Jahr 2009 startete die GC Foundation eine neue Längsgenerationsstudie mit 1321 Teilnehmern (von 1644 förderfähigen Probanden: Erstansprechrate von 80,3%). geboren zwischen 1935 und 1939 (im Alter zwischen 70 und 75 Jahren), kaukasischer Ethnie, die in demselben kleinen geographischen Gebiet lebt. Die Studie hieß InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; auf Deutsch: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) und ist derzeit im Gange. InveCe.Ab ist geplant, eine Kohorte mit maximaler Homogenität und geringster Variabilität zu erhalten, um die Inzidenz, Prävalenz und natürliche Geschichte von Demenz zu bewerten, zusammen mit ihren möglichen Risiko- oder Schutzfaktoren, einschließlich Verhaltens-, psychosozialen, klinischen und biologischen Variablen36. Die Merkmale der Kohorte sind in Abbildung 1 und Tabelle 1dargestellt. Die epidemiologischen Daten stimmen mit dem Demenztrend in der europäischen Bevölkerung37,38 und InveCe.Ab Teilnehmer haben homogene genetische und ökologische Eigenschaften, die ein gutes Modell darstellen, um den Verlauf von normalen Alterung zu neurokognitiven Störungen zu studieren. Tatsächlich benötigen homogene Populationen weniger Probanden, um eine angemessene statistische Leistung zu erreichen. Die InveCe.Ab-Methodik wurde bereits an anderer Stelle berichtet36, aber es ist wichtig, ihren mehrdimensionalen Ansatz durch regelmäßige Kontrollen (alle 2–3 Jahre) unter Verwendung der gleichen Bewertung zu unterstreichen, einschließlich: Blutentnahme (metabolisches Panel, Homocystein und Vitamine, DNA-Extraktion zum Profil Apolipoprotein E (APOE) und andere genetische Polymorphismen im Zusammenhang mit Kognition und Alterung), anthropometrische Messungen (Gewicht, Höhe und Taille), Talking While Walking Test (Dual Task Test), ein Interview zur Bewertung des Lebensstils (mediterrane Diät-Adhärenz, Niveau der körperlichen Aktivität und kognitiven Engagements) und soziale Faktoren (soziales Engagement, Einsamkeit), eine neuropsychologische Bewertung und eine klinische allgemeine Untersuchung. Ein Vergleich solcher Längsdaten mit postmortalen neuropathologischen Daten wäre für die Forschung von entscheidender Bedeutung. Daher hat unser Team und insbesondere Dr. Michela Mangieri den oben genannten neuropathologischen Ansatz konzipiert. Seit 2014 und während der zweiten Nachbereitung wurden die Teilnehmer von InveCe.Ab gebeten, ihr Gehirn zu spenden und damit die Geburt der Abbiategrasso Brain Bank (ABB) herbeizuführen. Die Kernspender von ABB sind die InveCe.Ab-Teilnehmer, aber ABB ist jetzt offen für andere ehrenamtliche Spender. Es handelt sich um Patienten von ASP Golgi-Redaelli, wo mehrere Patienten mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen leiden, oder erwachsene Freiwillige, die über das ABB-Projekt erfahren und zum selben geografischen Gebiet gehören (Abbiategrasso und Umgebung). Alle Spender durchlaufen das gleiche Bewertungsprotokoll.
Die Autoren schlagen eine Methode vor, um einzelne Bahnen des normalen Alterns und den möglichen Fortschritt zu nichtübertragbaren Stellen zu verfolgen und gehirn, das von solchen Spendern erworben wurde, genau zu verwalten, zu verarbeiten und zu charakterisieren, gefolgt von Längs). Darüber hinaus ist es unser Ziel, Menschen in regelmäßigen neurologischen Bewertungen, Seminaren und pädagogischen Aktivitäten zum Wohlbefinden des Gehirns zu treffen und zu engagieren und ihr Bewusstsein für Hirnspenden für Forschungszwecke zu schärfen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>50ml polypropilene conical tube 30x115mm</td>
			<td>BD</td>
			<td>405253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN (A60)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho TAU (AT8)</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>MN1020</td>
			<td>monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2)</td>
			<td>CosmoBio</td>
			<td>TIP-PTD-P02</td>
			<td>policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-SYN (KM51)</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-ASYN</td>
			<td>monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;amyloid (4G8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>800703</td>
			<td>monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting board</td>
			<td>BD</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>FA30WL0101500</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical saw with 5d blade</td>
			<td>CEA</td>
			<td>06.06.14/06.00.16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode pH measure surface 12mm</td>
			<td>CEA</td>
			<td>70064.250 HHH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode pH needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11796338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+System-HRP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K4001</td>
			<td>secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+System-HRP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K4003</td>
			<td>secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylether</td>
			<td>SMI</td>
			<td>8401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather safety trimming knife blade 14cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11749798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>FA30WS1810500</td>
			<td>medium supplement; dilution = 20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 15cm surgical or anatomical</td>
			<td>Uvex</td>
			<td>500XG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>CEA</td>
			<td>01.28.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>Arcobaleno</td>
			<td>2624000800002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head supporter</td>
			<td>Lacor</td>
			<td>60456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>FA30WX0550100</td>
			<td>medium supplement; dilution = 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring tape</td>
			<td>CEABIS</td>
			<td>CEATA34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non adsorbable monofilament black polyamide</td>
			<td>UHU Bostik</td>
			<td>8000053131470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td>medium supplement; dilution = 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strept Solution (100X)</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>FA30WL0022100</td>
			<td>medium supplement; dilution = 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm</td>
			<td>CEA</td>
			<td>03.06.16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpel with n&#176;21 blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical basin</td>
			<td>Olcelli Farmaceutica</td>
			<td>A930857255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical mallet and surgical cisel</td>
			<td>CEA</td>
			<td>79.68.88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>CEA</td>
			<td>27.08.45/79.68.64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Feather</td>
			<td>M130RC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

abbiategrasso brain bank protocol for collecting, processing and characterizing aging brains

In einer ständig alternden Bevölkerung wird mit einem Anstieg der Prävalenz neurodegenerativer Erkrankungen gerechnet. Das Verständnis von Krankheitsmechanismen ist der Schlüssel, um präventive und heilende Maßnahmen zu finden. Der effektivste Weg, dies zu erreichen, ist durch direkte Untersuchung von krankem und gesundem Hirngewebe. Die Autoren präsentieren ein Protokoll, um qualitativ hochwertiges Gehirngewebe zu erhalten, zu verarbeiten, zu charakterisieren und zu speichern, das von Personen gespendet wird, die in einem Antemortem-Gehirnspendeprogramm registriert sind. Das Spendenprogramm umfasst einen persönlichen, empathischen Umgang mit Menschen, eine Sammlung ergänzender klinischer, biologischer, sozialer und Lifestyle-Informationen und serielle multidimensionale Bewertungen im Laufe der Zeit, um individuelle Bahnen des normalen Alterns und kognitiven Verfalls zu verfolgen. Da viele neurologische Erkrankungen asymmetrisch sind, bietet unsere Gehirnbank ein einzigartiges Protokoll zum Schneiden frischer Proben. Hirnabschnitte beider Hemisphären sind abwechselnd eingefroren (bei -80 °C) oder in Formalin fixiert; eine feste Scheibe auf einer Hemisphäre entspricht einer gefrorenen auf der anderen Hemisphäre. Mit diesem Ansatz kann eine vollständige histologische Charakterisierung des gesamten gefrorenen Materials erreicht und Omics-Studien an histologisch gut definierten Geweben aus beiden Hemisphären durchgeführt werden, was eine vollständigere Bewertung neurodegenerativer Krankheitsmechanismen ermöglicht. Eine korrekte und eindeutige Diagnose dieser Krankheiten kann nur durch die Kombination des klinischen Syndroms mit der neuropatologisch-evaluation erreicht werden, die oft wichtige ätiologische Hinweise hinzufügt, die notwendig sind, um die Pathogenese zu interpretieren. Diese Methode kann zeitaufwändig, teuer und begrenzt sein, da sie nur ein begrenztes geografisches Gebiet abdeckt. Ungeachtet seiner Grenzen kann sich der hohe Charakterisierungsgrad lohnen. Unser oberstes Ziel ist es, die erste italienische Brain Bank zu gründen, wobei die Bedeutung neuropathologisch verifizierter epidemiologischer Studien betont wird.

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Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um einzelne Gehirn-Aging-Trajektorien durch ein Gehirn-Spenden-Programm und die richtige Charakterisierung des Gehirns zu verfolgen. Hirnspender sind an einer langfristigen Längs-Langzeitstudie beteiligt, einschließlich serieller multidimensionaler Bewertungen. Das Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Gehirnverarbeitung und eine genaue Diagnosemethodik.

Abbiategrasso Brain Bank Protocol zum Sammeln, Verarbeiten und Charakterisieren alternder Gehirne

In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find ...

Da die Prävalenz einer neurokognitiven Störung kontinuierlich zunimmt, ist es unser Ziel, hochwertige Hirngewebeproben zu erhalten, zu charakterisieren und zu speichern, um eine genaue Diagnose zu erhalten und Licht auf die neurodegenerativen Mechanismen zu werfen. Unter Berücksichtigung der Hirnassymetrie ermöglicht unsere Sampling-Methodik, dass alle Metastudien an histologisch genau definierten Geweben aus beiden Hemisphären durchgeführt werden können und die vielen Daten durch Deep Learning gesammelt und korreliert werden können. Additive Effekte auf Hirnschäden durch mehrere Pathologien werden häufig beobachtet.Die definitive Diagnose erfordert die Kombination des klinischen Syndroms mit den neuropathologischen Befunden, um Krankheitspathogenese und mögliche Therapien zu entdecken. Frische Schneidverfahren sowie das Makroschnittmanagement sind schwierig, aber auch unerlässlich, um gute Ergebnisse zu erzielen. Ein geschultes und engmaschiges Team ist entscheidend, um diese Schwierigkeiten zu überwinden.Unser Protokoll enthält eine Reihe von Schritten, die Säugetier Geschicklichkeit erforderlich sind, daher visuelle Demonstration kann nützlicher als beschreibende Texte für Forscher, die diese Techniken beherrschen wollen. Nach der Bestätigung der Thanatographie verwenden Sie ein scharfes Skalpell, um einen Kopfhautschnitt durch die Haarhaut und das subkutane Gewebe auf der Koronaplatte von der Spitze des Mastoid-Prozesses auf einer Seite zur anderen zu machen, über den Scheitelpunkt. Trennen Sie die beiden Falten der Kopfhaut vorsichtig vom Schädel und setzen Sie den Schnitt fort, bis das gelbe Super-Orbitalfett sichtbar wird.Reflektieren Sie die Kopfhaut anterior und ziehen Sie den anderen Abschnitt des Gewebes nachtränk. Mit einem Skalpell und Zangen, ernten Sie eine kleine Probe des zeitlichen Muskels auf jeder Seite des Schädels, platzierung eine Probe in 4%Formaldehyd und die andere Probe bei vier Grad Celsius. Mit einer elektrischen Säge schnitt der Schädel in einem V-Schnitt auf der Vorderseite und entfernen Sie die Schädelkappe.Nach dem Schneiden der Meningen, ernten Sie ein Stück Dura für die Fixierung und ein anderes zum Einfrieren. Legen Sie eine 20 Gauge 3,5-Zoll-Nadel, die an einer 10 Milliliter Spritze befestigt ist, durch das Corpus Callosum ein, um den dritten Ventrikel zu erreichen und den Kolben zurückzuziehen, um etwa 10 Milliliter zerebrale Rückenmarksflüssigkeit zu erhalten. Bewerten Sie die Aussehensfarbe und Trübung der Flüssigkeit und messen Sie den pH-Wert.Ziehen Sie vorsichtig an beiden Frontallappen, um das Gehirn zu heben und schneiden Sie sowohl die Sehnerven infundibulum, die inneren Karotisarterien und die dritte, vierte, fünfte und sechste Hirnnerven. Schneiden Sie das Tentorium, um die hintere Fossa zu erreichen und schneiden Sie die Wirbelarterien und die unteren Hirnnerven. Dann legen Sie das Skalpell so tief wie möglich durch das Foramen Magnum, um den kaudalsten Teil der Medula zu schneiden und sorgfältig das gesamte Gehirn zu entfernen.Verwenden Sie das Skalpell, um den Knochen über Meckels Höhle zu erscheinen und sammeln Sie das Gasserian Ganglion von jeder Seite für fixieren und einfrieren. Verwenden Sie einen chirurgischen Schlägel und Meißel, um die knöcherne Sella turcica zu brechen und entfernen Sie die Hypophyse zur Fixierung in 4%Formaldehyd. Inspizieren Sie den Schädel und das gesamte Gehirn vor makroskopischen Veränderungen und Gefäßveränderungen.Verwenden Sie ein Maßband, um die Quer- und vorderen Körperhaltungsdurchmesser des Gehirns zu messen und das Gehirn auf einer Skala zu wiegen. Rufen Sie vorsichtig den Kreis von Willis für die makroskopische Bewertung für das Vorhandensein von anatomischen Varianten, Läsionen oder Gefäßstenose. Trennen und inspizieren Sie das Großhirn, Kleinhirn und Hirnstamm, bevor Sie das Gewebe einzeln wiegen.Ein bis zwei, zwei bis vier Zentimeter quadratische Leptomeninge aus der Konvexität entfernen und die Proben in einem vollständig glukosehohen DMEM-Kulturmedium bei vier Grad Celsius aufbewahren. Ernten Sie die Zirbeldrüse zur Fixierung in 4%Formaldehyd und entfernen Sie die Olfaktor-Lampen und Sehnerven für die Fixierung und das Einfrieren eines jeden Paares. Das Großhirn, das Kleinhirn und den Hirnstamm bei vier Grad Celsius auf Eis legen.Wenn alle Gewebe von Interesse geerntet wurden, verwenden Sie einen Super-Klebstoff, um den Knochen wieder zu befestigen und eine chirurgische Nadel zu verwenden, und nicht resorbierbare Nähte, um die Kopfhaut zurückzunähen. Für Gehirnbank-Sektion verwenden Sie ein Trennmesser, um den Hirnstamm axial zu schneiden und machen Sie den ersten Schnitt auf der Ebene des rostralen Mittelhirns durch den überlegenen Colliculus, um zwei Scheiben zu erhalten, um die Substantia nigra freizulegen. Schneiden Sie das Hirnstamm in 10, acht Millimeter Scheiben mit Vorsicht, um Schnitte einzuschließen, die durch die rostralen Pons in der Nähe der oberen Ränder des vierten Ventrikels gehen, um den Locus caeruleus zu beobachten, und durch die Medulla oblongata, die den akustischen Strian unterlegen ist, knapp über dem unteren Scheitelpunkt des vierten Ventrikels, um Scheiben einschließlich des dorsalen Motorkerns des Vagus zu erhalten.Beschriften Sie alle Scheiben in einer rostralen kaudalen Weise als BS für Hirnstamm gefolgt von arabischen Ziffern. Verwenden Sie nach dem letzten Hirnstammabschnitt die Bezeichnung SC für Rückenmark gefolgt von arabischen Ziffern. Schneiden Sie das Kleinhirn auf der sagittalen Ebene, um die beiden Kleinhirnhalbkugeln auf der Ebene der Vermis zu trennen und sagittale Schnitte durchzuführen, um fünf Scheiben aus jeder Hemisphäre zu erhalten.Benennen Sie alle Slices aus der Vermis als CBR oder CBL für das rechte bzw. linke Kleinhirn, und verwenden Sie arabische Ziffern, um jeden Abschnitt zu identifizieren. Als nächstes trennen Sie die beiden Hemisphären des Großhirns durch den Corpus callosum auf der sagittalen Ebene, bevor Sie die Hemisphäre als singulär entlang der koronalen Ebene schneiden, die zwischen dem optischen Chiasmus und den Brustkörpern durch den frontalen Lappen-Temporalpol, den vorderen cingulate, den vorderen Kommissure, den Kern von Minored und basalen Ganglien führt. Machen Sie einen zweiten Schnitt etwa einen Zentimeter hinterder Weise durch die Brustkörper und entlarven die Basalganglien, vorderen Thalamus sub thalamus, und Amygdala.Weiter schneiden, um die vorderen und hinteren Bereiche zu sezieren, bis 15 bis 21 Zentimeter Scheiben für jede Hemisphäre erhalten wurden. Platzieren Sie die Scheibe auf einer ebenen Oberfläche, wie sie nach ihrer ursprünglichen Position in der vorderen hinteren Richtung von der Frontal- bis zum Okzipitalpol erreicht werden, mit dem Abschnitt kontinuierlich mit den vorherigen Dias nach oben. Wenn alle Slices platziert wurden, wählen Sie die Hauptabschnitte aus, die für die Histopathologie fixiert werden sollen, einschließlich der zuvor erworbenen Abschnitte und der hippocampalen, parietalen und okzipitalen Abschnitte, und beschriften Sie die Slices als L oder R, gefolgt von arabischen Ziffern, einschließlich einer Beschriftung, die angibt, ob die Scheibe fixiert oder eingefroren werden soll.Wenn alle Gewebe geschnitten und beschriftet wurden, erhalten Sie ein Bild für jede Reihe von Abschnitten vor ihrer Fixierung oder dem Einfrieren. Um die Proben einzufrieren, legen Sie die reservierten alternativen Gewebeabschnitte auf eine vorgefrorene Aluminiumschale und bedecken die Abschnitte mit einer ineinandergreifenden Aluminiumplatte, um sie flach zu halten. Dann frieren Sie die Scheiben in flüssigem Stickstoff für drei Minuten ein, bevor Sie die gefrorenen Proben in eine Plastiktüte legen, die mit den entsprechenden Identifikationscodes und Scheibennummern für eine Lagerung in der entsprechenden kryogenen Box bei 80 Grad Celsius gekennzeichnet ist.Um die Proben zu fixieren, legen Sie die reservierten alternativen Gewebeabschnitte in einzelne Gazestücke und legen Sie die Scheiben in 10%phosphat gepufferte Formalinlösung für fünf Tage in einem vier Grad Celsius kalten Raum. 24 von 27 geernteten Gehirnen erhielten die vollständige neuropathologische Charakterisierung mit einer bestimmten klinischen pathologischen Diagnose. Vorläufige quantitative Elektroenzephalogramm-Analyse einer Reihe von 36 Hirnspendern zeigt, dass der Haupt-Alpha-Rhythmus-Prozentsatz bei wichtigen neurokognitiven Störungen signifikant niedriger ist als bei normalen älteren leichten neurokognitiven Störungen.Hier zeigt sich ein Beispiel für eine asymmetrische Pathologie mit einer rechten Atrophie, die makroskopisch mit den im rechten koronalen Abschnitt im Vergleich zur linken beobachteten schweren ventrikulären Dilatationen sichtbar ist. Ein anderer Fall zeigt einen Infarkt der rechten Hemisphäre, während ein anderes Exemplar eine deutliche Atrophie des rechten Brustkörpers zeigt. Makroabschnitte können gefärbt werden, um Myelinverlust oder die Verteilung der Immunreaktivität innerhalb der Hemisphären zu identifizieren.Diese Proben stammen von Zwillingen, die aufgrund epigenetischer und ökologischer Faktoren einen klinischen Beginn der Alzheimer-Krankheit in unterschiedlichen Zeitrahmen hatten. Dennoch ergab die mikroskopische Analyse ein sehr ähnliches neuropathologisches Bild, das auf eine hohe Alzheimer-Krankheitspathologie und Amyloid-Angiopathie hindeutet. Bei diesen beiden Patienten entsprach jedoch nicht genau die gleiche klinische Diagnose der Alzheimer-Krankheit den nnpathologischen Merkmalen, die ein Demenz-Duo in mehreren Ätiologien zeigten.Tatsächlich stellte der erste Fall Lewy-Körper in der Gyrus-Einzellüge und der Substantia nigra dar. Und der zweite Fall zeigte Lewy-Körper, die mit Lewy-Neuriten im Amygdala- und Beiminorus assoziiert waren. Die Fotografie der Scheiben ist sorgfältig für eine genaue Identifizierung der anatomischen Bereiche während der mikroskopischen Analyse.Die Fixierung und das Einfrieren von Einzelscheiben sind auch wichtig, um die Gewebemikrostruktur Omics die Topographie der Genaktivierung und Proteinverteilung zu erhalten und korrelieren diese Daten mit der Histopathologie. Zellkulturen aus gut charakterisierten Geweben, auch eine Untersuchung der Krankheitspathogenese. Tragen Sie immer eine angemessene persönliche Schutzausrüstung, da ein eigens übertragenes Hirngewebe als potenziell infektiös gilt und weil der Einsatz gefährlicher Werkzeuge wie scharfe Instrumente und flüssiger Stickstoff erforderlich ist.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

Anatomy of the Central and Peripheral Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Forschung

Neurowissenschaften

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Mit dem Theta-Burst-Protokoll zu Mechasnism der Plastizität in Individuen sich mit Fragile X-Syndrom und Autismus

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

Hohe Auflösung<em&gt; In-vivo-</em&gt; Manuelle Segmentierung Protokoll für Menschen Hippocampus Teilfelder Verwenden von 3T Kernspintomographie

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Futter suchen Pfad-Länge-Protokoll für<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualisierung von Amyloid-β-Einlagen in das menschliche Gehirn mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung bildgebende Massenspektrometrie

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...