Name: generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection
Uploaded: 2020-01-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

وقد حظي هذا العمل بدعم من المعاهد الوطنية للصحة التي تمنح R44GM113545 و P20GM103434.

قبل البدء في التجارب الحيوانية ، يجب الموافقة علي البروتوكول الذي سيتم استخدامه من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي (IACUC). تم الحصول علي الموافقة علي البروتوكول الموصوف من خلال IACUC في جامعه مارشال (هنتنغتون ، WV ، الولايات الامريكيه).
1. تصميم plasmid
<ol><li>لتوليد الح?...

<ol>
	<li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li><li>Valentine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+highly+attenuated+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+commercial+production+of+alginate.">Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate.</a> Microbial Biotechnology. , (2019).</li><li>Schweizer, H. P., Hoang, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+system+for+gene+replacement+and+xylE+fusion+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa.">An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Gene. 158 (1), 15-22 (1995).</li><li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis.">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).</li><li>Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+lacking+the+extreme-stress+sigma+factor+AlgU+(sigmaE).">Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE).</a> Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).</li><li>Baeshen, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Biopharmaceuticals+in+E.+coli:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).</li><li>Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+industrial+Escherichia+coli+strains+in+fed-batch+cultivations+during+high-level+SOD+protein+production.">Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production.</a> Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).</li><li>Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+factories+for+recombinant+pharmaceuticals.">Microbial factories for recombinant pharmaceuticals.</a> Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans.">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10-min+method+for+preparation+of+highly+electrocompetent+Pseudomonas+aeruginosa+cells:+application+for+DNA+fragment+transfer+between+chromosomes+and+plasmid+transformation.">A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation.</a> Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).</li><li>Liang, R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scarless+and+sequential+gene+modification+in+Pseudomonas+using+PCR+product+flanked+by+short+homology+regions.">Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions.</a> BMC Microbiology. 10, 209 (2010).</li><li>Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+multiple+genomic+deletions+in+Gram-negative+bacteria:+analysis+of+the+multi-resistant+antibiotic+profile+of+Pseudomonas+putida+KT2440.">Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).</li><li>Song, C. W., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+inactivation+of+single+or+multiple+genes+in+Escherichia+coli.">Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli.</a> Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).</li><li>Yan, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a-Assisted+Recombineering+in+Bacteria.">CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).</li><li>Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+and+prospects+of+microbial+preservation.">Practice and prospects of microbial preservation.</a> FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).</li></ol>

PEX100T-Not1 البلازميد هو وسيط فعال لحذف الجينوم المتسلسلة التي هي خاليه من العلامات وفي الإطار. عند هندسه سلالات بكتيرية لضراوة موهنه ، فان حذف متواليات الجينات بأكملها بدلا من توليد طفرات النقطة يقلل من احتماليه الارتداد إلى النمط الظاهري الخبيث. بالاضافه إلى ذلك ، كل حذف الجينات الامراضيه ي...

الزائفة الزنجاريه هو الممرض الجرثومي الانتهازية التي يمكن ان تسبب الامراض التي تهدد الحياة في البشر ، وخاصه في المناعة. ويرجع الامراضيه الزنجاريه إلى التعبير عن العديد من عوامل الضراوة ، بما في ذلك بروتياسيس و lipopolysaccharide ، فضلا عن قدرتها علي تشكيل بيوفيلم الواقية1. بسبب قدرتها علي إنتاج عوامل الضراوة وتسبب المرض في البشر ، وذلك باستخدام الزنجاريه لجعل المنتجات التجارية ويعرض المخاوف السلامة. السلالات غير المسببة للامراض من e. القولونية وقد استخدمت تقليديا للهندسة الحيوية المنتجات الطبية والتجارية للاستخدام البشري. ومع ذلك ، بعض المنتجات من الصعب علي e. كولاي لجعل ، والعديد من تعبئتها في هيئات الادراج ، مما يجعل استخراج شاقه. السلالات البكتيرية المهندسة مع القدرة علي صنع وإفراز منتجات محدده أمر مرغوب فيه للغاية ، كما إفراز من المرجح ان تزيد من الغلة وسهوله عمليات التنقية. وهكذا ، سلالات غير المسببة للامراض من الأنواع الأخرى من البكتيريا (علي سبيل المثال ، الأنواع التي تستخدم المزيد من مسارات إفراز) قد توفر بدائل مفيده ل e. كولاي. وقد أبلغنا مؤخرا عن تطور سلاله من الزنجاريه، PGN5 ، حيث الامراضيه وسميه الكائن الحي موهنه للغاية2. والاهم من ذلك ، لا تزال هذه السلالة تنتج كميات كبيره من الجينات السكاريد ، وهو مكون مثير للاهتمام من الناحية التجارية من p. الزنجاريه biofilm.
تم إنشاء سلاله PGN5 باستخدام اجراء تبادل اليليه من خطوتين مع pEX100T البلازميد لحذف بالتتابع خمسه الجينات (توكا، plch، phzm، wapr، aroa) المعروفة للمساهمة في الامراضيه الكائن الحي. تم توليد pEX100T-نؤتي عن طريق تغيير smai إلى موقع التعرف علي الانزيم نؤتي تقييد داخل موقع استنساخ متعددة من pEX100T البلازميد ، والتي وضعت في مختبر هربرت schweizer3،4. موقع الاعتراف لانزيم تقييد نؤتي هو تسلسل الحمض النووي النادرة مقارنه مع SmaI واقل احتمالا ان تكون موجودة في تسلسل يجري استنساخها ، التالي فانه هو أكثر ملاءمة لأغراض الاستنساخ. يحمل البلازميد الجينات التي تسمح للاختيار ، بما في ذلك الجينات bla ، والتي تقوم بترميز ß-lactamase ويمنح المقاومة لكاربينسيلين ، والجينات b. subtilissacb ، الذي يضفي حساسية لالسكروز (الشكل 1ا). كما يحمل البلازميد أصل النسخ المتماثل (ori) متوافق مع e. كولاي، واصل نقل (orit) الذي يسمح لنقل البلازميد من e. كولاي إلى الأنواع الزائفة عن طريق الاقتران. ومع ذلك ، فان البلازميد يفتقر إلى أصل النسخ المتماثل متوافقة مع الزائفة، التالي لا يمكن تكرار داخل الأنواع الزائفة (اي ، هو ناقلات الانتحار الزائفة ). هذه الخصائص تجعل pEX100T-نؤتي مثاليه لاستهداف المحذوفات الوراثية من كروموسوم الزائفة . يتم تنفيذ خطوات الاستنساخ البلازميد باستخدام e. كولاي ويتم نقل البلازميد الناتجة إلى الزائفة عن طريق التحويل أو الاقتران. ثم ، من خلال الاحداث أعاده تجميع المتماثلة والخطوات الانتقائية ، يتم إنشاء الحذف المستهدف في الإطار ، خاليه من العلامات. هذه الطريقة لحذف المناطق الجينية بالتتابع من كروموسوم الزنجاريه يمكن استخدامها لتوليد سلالات الزائفة الموهنة للغاية ، مثل PGN5 ، أو لتصميم سلالات لاستخدامات محدده أخرى (علي سبيل المثال ، سلالات نقص في الكريات الوحيدة النوى لانتشار البلازميد أو سلالات نقص في البرواسات لإنتاج البروتينات من الفائدة).
يتاثر الضراوة العامة لسلالات البكتيريا بظروف النمو والمراحل ، التي تحدث خلالها الطفرات بشكل متكرر. ولذلك ، فان قياس سلامه السلالات المهندسة وراثيا يمكن ان يكون صعبا. لتقييم العزلات البكتيرية لضراوة الجهازية ، ونحن تكييف بروتوكول نشرت سابقا من العدوى بواسطة حقن داخل الC57BL/6 الفئران5. قمنا بتعديل هذا الاجراء لاستخدام المخزونات البكتيرية المجمدة للحقن ، والتي سمحت بالجرعات الدقيقة وسهوله التحقق من السلالات المستخدمة. في هذا النموذج ، تم استخدام BL21 سلاله e. القولونية ، التي تمت الموافقة عليها من قبل أداره الاغذيه والعقاقير لإنتاج biopharmaceuticals ، كمعيار سلامه التحكم لتحديد المرض النسبي لسلاله6،7،8. الميزة الرئيسية لاستخدام هذا الأسلوب هو انه هو استنساخ ويقلل من مصادر الاختلاف ، كما يتم التحقق من صحة سلالات عدوي لرقم الخلية البكتيرية ، والنمط الظاهري ، وعلامات وراثيه قبل وبعد العدوى. مع هذه الخطوات التي تسيطر عليها ، يتم تقليل عدد الحيوانية المطلوبة. في هذا النموذج, الزنجاريه سلالات التي تؤدي إلى معدلات الوفاات MURINE C57BL/6 مساويه أو اقل من e. كولاي BL21 عند حقن داخل الصفاق يمكن اعتبار الموهن. ويمكن أيضا استخدام هذا النموذج البسيط الماوس للعدوى لتقييم الامراضيه الموهن من سلالات المهندسة وراثيا من الأنواع الأخرى باستخدام سلاله e. القولونية التي وافقت عليها الهيئة كمرجع. الخطوات 1-7 التفاصيل الجيل من الحذف الجينوم متسلسلة في الزنجاريه (الشكل 1) والخطوات 8-12 التفاصيل استخدام نموذج الماوس لاختبار الامراضيه سلالات الزنجاريه .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes with flat caps</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable polystyrene cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-821-13B</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>04-987-372</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Microcentrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>75-003-287</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tube, Polystyrene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12224-50</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>D6493-01</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>NC0492929</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastLink II DNA Ligation Kit</td>
			<td>Epicentre Technologies</td>
			<td>LK6201H</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Colorless Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7833</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>3120-500</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noble agar, ultrapure</td>
			<td>Affymetris/USB</td>
			<td>AAJ10907A1</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404052</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank">https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation broth</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>Custom made batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 4080</td>
			<td>shake at 200 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0032-17-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Plates (100 O.D. x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks, round</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand of toothpicks, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>45-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anesthesia System Filters</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>118999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI 8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>Caliper Life Sciences/Xenogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection

الكائنات المجهرية هي متعددة الأغراض وراثيا ومتنوعة وأصبحت مصدرا رئيسيا للعديد من المنتجات التجارية والbiopharmaceuticals. علي الرغم من ان بعض هذه المنتجات تنتج بشكل طبيعي من قبل الكائنات الحية ، والمنتجات الأخرى تتطلب الهندسة الوراثية للكائن الحي لزيادة غله الإنتاج. سلالات خبيثه من القولونية كانت تقليديا الأنواع البكتيرية المفضلة لإنتاج biopharmaceuticals; ومع ذلك ، بعض المنتجات من الصعب علي e. كولاي لإنتاج. وهكذا ، فان السلالات الخبيثة من الأنواع البكتيرية الأخرى يمكن ان توفر بدائل مفيده لإنتاج بعض المنتجات التجارية. الزائفة الزنجاريه هي بكتيريا سلبيه الجرام المشتركة ومدروسه جيدا التي يمكن ان توفر بديلا مناسبا ل e. كولاي. ومع ذلك ، الزنجاريه هو الممرض البشري الانتهازي. هنا ، ونحن التفاصيل الإجراءات التي يمكن استخدامها لتوليد سلالات غير المسببة للامراض من الزنجاريه من خلال الحذف الجيني متسلسلة باستخدام Plasmid pEX100T نؤتي. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي إنتاج سلاله خاليه من العلامات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد سلالات الزنجاريه موهنه للغاية لإنتاج المنتجات التجارية ، أو لتصميم سلالات لاستخدامات محدده أخرى. ونحن أيضا وصف نموذج الماوس بسيطه واستنساخه من العدوى الجهازية البكتيرية عن طريق حقن داخل الصفاق من سلالات اختبار المصادق عليها لاختبار التوهين من سلاله المهندسة وراثيا بالمقارنة مع سلاله BL21 المعتمدة من قبل FDA من e. كولاي.

وكما هو مبين في الشكل 2، يمكن تاكيد الحذف الجيني المستهدف باستخدام المستعمرة PCR مع الإشعال المحددة التي تضخم منطقه الاهتمام. المستعمرات التي تحمل الحذف الجيني سوف تسفر عن حجم الفرقة PCR أقصر بالمقارنة مع المستعمرات من النوع البري. وعاده ما تكون الشاشة PCR من ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

هنا ، ونحن وصف بروتوكول بسيطه وقابله للتكرار من نموذج الماوس للعدوى لتقييم توهين السلالات المعدلة وراثيا من الزائفة الزنجاريه بالمقارنة مع الولايات المتحدة الغذاء والدواء أداره (FDA)-التي وافقت علي القولونية للتطبيقات التجارية.

جيل من المتحولين في الإطار الجينات الحذف في الزائفة الزنجاريه واختبار لتوهين ضراوة في نموذج الماوس بسيطه من العدوى

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

هذا البروتوكول مهم لخلق وتحديد الطفرات المطلوبة العقل والجسم في الجينوم من aeruginosa Pseudomonas، فضلا عن اختبار تأثير الطفرات على الحد من الفوعة في نموذج الماوس استنساخها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التحقق من صحة الكروم وإعادة إنتاج نموذج عدوى الماوس. البكتيريا تعمل باستمرار، تتغير باستمرار.لإبطاء هذه العملية، ونحن نستخدم توقف المجمدة، كيس منهم، شنق لهم على درجات متعددة على التعديل قبل اختبارها في نموذج الماوس. شخص غير مألوف مع هذه الأساليب سوف النضال على الأرجح مع التنمية واختيار إعادة المؤتلف المحتمل كروس لاختبار. وعلاوة على ذلك، فإن التعامل مع الفئران للعدوى يكون من الصعب على شخص غير مألوف مع العمل الحيواني.يمكن تطبيق هذه الطريقة لاختبار مسببات الأمراض الأخرى والمسوخ ، وكذلك تصيب الفوعة في الفئران. وبالمقارنة مع النماذج الحالية، فإن الإجراءات التي لها قابلية الاستنساخ بالإضافة إلى التحقق من صحة الاستنساخ قبل وبعد العدوى يمكن أن تفيد المحققين الآخرين في هذا المجال. يقدم العرض المرئي لهذا البروتوكول نظرة ثاقبة على إجراءات واسعة النطاق قد يصعب فهمها أو فهمها من خلال القراءة وحدها.ابدأ بزراعة مستعمرات واحدة، مُؤتلفة في مرق العزلة Pseudomonas، أو PIB. تلقيح و streak 10 microliters من كل ثقافة على لوحات PIA ساخنة قبل, تكمل مع 10٪ السكروز. ثم احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.في اليوم التالي، قم بإزالة اللوحات من الحاضنة وتفقدها من أجل النمو. يجب أن تكون مستعمرة مقاومة السكروز إعادة الكومبينات المزدوجة. استخدام المسواك المعقمة لتصحيح ما لا يقل عن 20 مستعمرات على لوحات ما قبل warmed من PIA، PIA تكملها 10٪ السكروز، و PIA تكملها مع كاربينيسيلين.احتضان لوحات بين عشية وضحاها وفحصها للنمو في اليوم التالي. سوف صحيح إعادة الكومبينا الكروس أوفر مزدوجة تكون كاربينسيلين حساسة ومقاومة السكروز. الشاشة 10 إلى 20 مستعمرات للحذف، وذلك باستخدام مستعمرة PCR.التقاط نمو يشتبه في كروس مزدوج المؤتلف مع مسواك معقمة وتعليقه في 50 ميكرولترers من برنامج تلفزيوني. يغلي التعليق في 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق في 13،000 مرات G ووضعها على الجليد.ثم قم بإجراء PCR وفقًا لتوجيهات المخطوطات. بمجرد الانتهاء PCR، أداء Agarose هلام الكهرباء على المنتجات. وتشير منتجات التضخيم الأصغر حجما إلى المستعمرات التي حذفت فيها المنطقة موضع الاهتمام.في صباح الحقن، ذوبان cry الخلايا البكتيرية عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث إلى أربع ساعات. الحفاظ على قارورة على الجليد بعد ذوبان وحقن الفئران في غضون ساعتين. نقل محتويات كل cryovial إلى أنبوب ملليلتر جديد وطاردة مركزية في 4، 500 مرات G لمدة 10 دقائق.تجاهل عظمى وإعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. كرر الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني إلى تركيز نهائي من 2.5 مرة 10 إلى وحدات القولون التاسعة تشكيل لكل ملليلتر. أخذ ثلاث عينات من التعليق النهائي لكل سلالة للتحقق من التركيز، واType، وphenotype.لكل سلالة، aliquot 1.5 ملليلتر من تعليق الخلية في أنبوب ملليلتر وإعداد برنامج تلفزيوني لحقن التحكم. جمع الفئران والمواد اللازمة للحقن في غرفة جراحية حيوانية معقمة ومسح جميع الأسطح مع مناديل التعقيم قبل البدء. ارتداء اثنين من أزواج من قفازات اللاتكس للحد من خطر ثقب, إذا عض, فضلا عن معطف مختبر, نظارات السلامة, وقناع الوجه.إزالة الماوس من القفص ووزنها، ووضع علامة على الذيل مع علامة دائمة لتتبع ما بعد الحقن. فتح حقنة واحدة ملليلتر جديدة مع إبرة قياس 27 ورسم 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عقيمة. الاستيلاء على الماوس وراء أذنيه، وذلك باستخدام الإبهام والسبابة، وقرصة لخلق أضعاف الجلد في مؤخر الرقبة.ثم، تأمين الذيل في النخيل باستخدام الخنصر لعقد الماوس شقة وغير متحركة. أدخل الإبرة بزاوية 30 درجة في تجويف الصفاق إلى يسار أو يمين خط الوسط. رفع قليلا الإبرة لضمان عدم إدراجها في الأجهزة.ثم، ببطء حقن برنامج تلفزيوني وسحب الإبرة. بولوس في موقع الحقن هو نموذجي. ضع الإبرة في حاوية التخلص من النفايات الحادة المعينة وتحريك الماوس إلى قفص منفصل.كرر الإجراء مع الماوس التالي وبعد حقن كل الفئران من قفص واحد، ونقلها مرة أخرى إلى قفص الأصلي. بعد حقن مجموعة التحكم، قم بإدخال مجموعات الاختبار باستخدام نفس الإجراء. مرة واحدة كل الحقن كاملة، والعودة الفئران إلى غرفة السكن وتنظيف منطقة العمل مع مناديل التعقيم.لتصوير الحيوانات، قم بإعداد نظام التصوير من خلال وضع معلمات الكاميرا وتسخين المسرح. تعيين تدفق الأكسجين إلى 1.5 لتر في الدقيقة وisoflurane إلى 3.5٪، وتحريك الماوس إلى غرفة التخدير، ثم إلى درجة حرارة مستقرة المرحلة، بعد التخدير. ضع الماوس على ظهره مع الذراعين الممدودين وتناسب مخروط الأنف لإدارة 2.5٪ isoflurane أثناء التصوير.أغلق الباب واصطُلم صورًا بيولوجيًا وأشعة سينية من الفأرة. عند اكتمال التصوير، ارجع الماوس إلى قفصه وراقبه. وينبغي أن يستعيد وعيه في غضون ثلاث إلى خمس دقائق.تم تأكيد عمليات حذف الجينوم المستهدفة من قبل مستعمرة PCR مع التمهيديات المحددة التي تضخيم المنطقة من الاهتمام. المستعمرات مع حذف الجينوم تسفر عن أقصر الفرقة PCR مقارنة مستعمرات نوع البرية. الحقن داخل الصفتون من سلالة مخففة من P aeruginosa, PGN خمسة, أدى إلى 0٪ الوفيات, أي ما يعادل الوفيات لوحظ مع E.coli BL 21.ومع ذلك، كان حقن سلالة الوالدين قاتلاً بنسبة 80٪ من الفئران. تم تتبع تطور العدوى باستخدام الوالدين البيوميلينسي ملحوظ وسلالات مخففة. وظلت السلالة المخففة موضعية في موقع الحقن حتى تلاشى التخمة الحيوية، والتي من المرجح أن تتزامن مع إزالة العدوى.الطريقة المقدمة لم تفحص سوى معدل الوفيات الناتج عن السلالة. ويمكن استخدام المزيد من الجوانب المناعية والسمية في العمق لتحديد ديناميات العدوى والأثر النهائي للعدوى الذي لا يؤدي إلى الوفاة. أهم شيء في الإجراء هو التحقق الشامل الذي تم ، بين خطوات مختلفة من تحديد الهوية الأولية إلى اختبار الحيوانات.قد يؤدي فقدان بعض خطوات التحقق من الصحة إلى نتيجة خاطئة، حيث أن السلالات التي تم اختبارها قد تخضع للطفرات والاختيار، أو تصبح ملوثة. مع تطوير هذه التقنيات اثنين، ونحن نعتقد أن هذا سيسمح الباحثينا في مجال علم المناعة العدوى للتحقيق بشكل أكثر فعالية كيف التفاعل حزمة قوية يؤدي إلى النمط الظاهري المدقع، sepsis، والوفيات. يمكن مقارنة مختلف nutrients'impact على المتغيرات من خلال حجم الزَنَة من البكتيريا.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

والزائفة الزنجارية السكيراء بيوفيلم في خلايا خميرة تدفق

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

على المدى الطويل المزمن<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; عدوى مجرى الهواء في الفئران

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

الزائفة الزنجارية المستحثة الرئة الإصابات نموذج

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

دراسة المجتمعات الميكروبية<em&gt; في فيفو</em&gt;: نموذج من التفاعل بوساطة بين المضيف<em&gt; المبيضات البيض</em&gt; و<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في الخطوط الجوية

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

تأتي إلى "جانب الضوء": "في فيفو" الرصد الزائفة الزّنجاريّة بيوفيلم الالتهابات في "الجروح المزمنة" في "نموذج مورين أصلع السكري"

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

النسخ المتماثل لمطلوب، "مكتبة نونريدوندانت" من سلالة الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 ينقول طفرات الإدراج

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

تقييم الفوعة والمرضية للعدوى أيروموناس في نموذج ايليجانس كاينورهابديتيس

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

نموذج التلقيح المتأخر لعدوى الجروح المزمنة الزائفة الجيروجينوسا

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...