Name: generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection
Uploaded: 2020-01-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud R44GM113545 og P20GM103434.

Før dyreforsøg påbegyndes, skal den protokol, der skal anvendes, godkendes af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC). Godkendelsen af den beskrevne protokol blev indhentet gennem IACUC på Marshall University (Huntington, WV, USA).
1. plasmid design
<ol><li>For at generere en genetisk sletning ved hjælp af pEX100T-noti plasmid, klon regionerne i DNA ledsage den ønskede sletning sekvens og indsætte i noti restriktion site af plasmid. Plasmid-indsatsen skal indehold...

<ol>
	<li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li><li>Valentine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+highly+attenuated+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+commercial+production+of+alginate.">Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate.</a> Microbial Biotechnology. , (2019).</li><li>Schweizer, H. P., Hoang, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+system+for+gene+replacement+and+xylE+fusion+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa.">An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Gene. 158 (1), 15-22 (1995).</li><li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis.">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).</li><li>Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+lacking+the+extreme-stress+sigma+factor+AlgU+(sigmaE).">Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE).</a> Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).</li><li>Baeshen, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Biopharmaceuticals+in+E.+coli:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).</li><li>Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+industrial+Escherichia+coli+strains+in+fed-batch+cultivations+during+high-level+SOD+protein+production.">Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production.</a> Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).</li><li>Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+factories+for+recombinant+pharmaceuticals.">Microbial factories for recombinant pharmaceuticals.</a> Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans.">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10-min+method+for+preparation+of+highly+electrocompetent+Pseudomonas+aeruginosa+cells:+application+for+DNA+fragment+transfer+between+chromosomes+and+plasmid+transformation.">A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation.</a> Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).</li><li>Liang, R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scarless+and+sequential+gene+modification+in+Pseudomonas+using+PCR+product+flanked+by+short+homology+regions.">Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions.</a> BMC Microbiology. 10, 209 (2010).</li><li>Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+multiple+genomic+deletions+in+Gram-negative+bacteria:+analysis+of+the+multi-resistant+antibiotic+profile+of+Pseudomonas+putida+KT2440.">Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).</li><li>Song, C. W., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+inactivation+of+single+or+multiple+genes+in+Escherichia+coli.">Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli.</a> Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).</li><li>Yan, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a-Assisted+Recombineering+in+Bacteria.">CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).</li><li>Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+and+prospects+of+microbial+preservation.">Practice and prospects of microbial preservation.</a> FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).</li></ol>

Den pEX100T-Not1 plasmid er en effektiv mægler af sekventielle genomsletninger, der er markør frie og in-frame. Når tekniske bakteriestammer for svækket virulens, sletning af hele gensekvenser i stedet for at generere punktmutationer nedsætter sandsynligheden for tilbagevenden til en virulente fænotype. Derudover dæmper hver gensletning af patogenicitet yderligere det patogen, hvilket forstærker dæmpnings stabiliteten.
Denne metode kan også bruges til at generere genomændringer andr...

Pseudomonas aeruginosa er et opportunistisk bakterie patogen, der kan forårsage livstruende sygdomme hos mennesker, især i immunkompromitterede. Patogeniciteten af P. aeruginosa skyldes ekspression af mange virulensfaktorer, herunder proteaser og lipopolysaccharid, samt dets evne til at danne en beskyttende biofilm1. På grund af sin evne til at producere virulensfaktorer og forårsage sygdom hos mennesker, ved hjælp af P. aeruginosa at gøre kommercielle produkter præsenterer sikkerhedsmæssige betænkeligheder. Ikke-patogene stammer af E. coli har traditionelt været anvendt til bioingeniør medicinske og kommercielle produkter til human brug. Men, nogle produkter er vanskelige for E. coli at gøre, og mange er pakket i inklusion organer, hvilket gør udvinding besværlig. Manipuleret bakteriestammer med evnen til at foretage og udskiller specifikke produkter er meget ønskværdigt, da sekretionen sandsynligvis ville øge udbyttet og lette rensnings processerne. Således, ikke-patogene stammer af andre arter af bakterier (f. eks arter, der udnytter flere sekretions veje) kan give nyttige alternativer til e. coli. Vi rapporterede for nylig om udviklingen af en stamme af P. aeruginosa, PGN5, hvor patogeniciteten og toksiciteten af organismen er stærkt svækket2. Det er vigtigt, at denne stamme stadig producerer store mængder polysaccharidalginat, en kommercielt interessant bestanddel af P. aeruginosa biofilm.
Den PGN5 stamme blev genereret ved hjælp af en to-trins allelisk udveksling procedure med pEX100T-NotI plasmid til sekventielt slette fem gener (Toxa, plch, phzm, wapr, Aroa) kendt for at bidrage til patogenicitet af organismen. pEX100T-noti blev genereret ved at ændre SMAI til en noti restriktion enzym anerkendelse site inden for multiple kloning site af plasmid pEX100T, som blev udviklet i Herbert Schweizer Lab3,4. Anerkendelses stedet for restriktions enzymet NotI er en sjældnere DNA-sekvens sammenlignet med SmaI og mindre tilbøjelige til at være til stede i sekvenser, der klones, således at det er mere bekvemt for kloning formål. Plasmid bærer gener, der giver mulighed for udvælgelse, herunder bla genet, som koder ß-lactamase og giver resistens over for carbenicillin, og B. subtilissacB genet, som giver følsomhed over for saccharose (figur 1A). Plasmid har også en oprindelse af replikation (ori) kompatibel med E. coli, og en oprindelse af overførsel (Orit), der giver mulighed for plasmid overførsel fra E. coli til Pseudomonas arter via konjugering. Plasmid mangler imidlertid en replikation, der er kompatibel med Pseudomonas, og kan derfor ikke replikere inden for Pseudomonas arter (dvs. det er en Pseudomonas selvmords vektor). Disse egenskaber gør pEX100T-NotI ideel til målretning af genetiske sletninger fra Pseudomonas kromosom. Plasmid klonings trin udføres ved hjælp af E. coli , og den resulterende plasmid overføres til Pseudomonas ved omdannelse eller konjugering. Derefter, gennem homologe rekombination begivenheder og selektive trin, den målrettede i-frame sletning genereres, markør-fri. Denne metode til sekventielt sletning af genomområder fra kromosom af P. aeruginosa kunne anvendes til at generere stærkt svækkede Pseudomonas stammer, som PGN5, eller til at designe stammer til andre specifikke anvendelser (f. eks. stammer mangelfuld i endonukleaser til plasmid formering eller stammer mangelfuld i proteaser til produktion af proteiner af interesse).
Den samlede virulens af bakteriestammer påvirkes af vækstbetingelser og-faser, hvor mutationer forekommer hyppigt. Derfor kan det være en udfordring at måle sikkerheden ved genetisk fremstillede stammer. For at evaluere bakterielle isolater til systemisk virulens tilpassede vi en tidligere offentliggjort infektions protokol ved intraperitoneal injektion af C57BL/6-mus5. Vi har ændret denne procedure for at bruge frosne bakterielle lagre til injektion, som tillod præcis dosering og nem validering af de anvendte stammer. I denne model, E. coli Strain BL21, som er blevet FDA-godkendt til produktion af biofarmaceutiske, blev brugt som en kontrol sikkerhedsstandard til bestemmelse af den relative patogenesen af stammen6,7,8. Den største fordel ved at bruge denne metode er, at det er reproducerbare og minimerer kilder til variation, som inficerende stammer er valideret for bakteriecelle nummer, fænotype, og genetiske markører både før og efter infektion. Med disse kontrollerede trin reduceres antallet af dyr, der kræves. I denne model er P. aeruginosa -stammerne, der resulterer i C57BL/6 murine dødelighed lig med eller mindre end E. coli BL21, når de injiceres intraperitonealt, kan betragtes som svækket. Denne simple musemodel af infektion kan også anvendes til at vurdere den svækkede patogenicitet af genetisk manipulerede stammer fra andre arter ved hjælp af FDA-godkendt E. coli stamme som reference. Trin 1-7 detaljeret generering af sekventielle sletninger i p. aeruginosa (figur 1) og trin 8-12 detaljeret brug af en musemodel til at teste patogeniciteten af p. aeruginosa -stammerne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes with flat caps</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable polystyrene cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-821-13B</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>04-987-372</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Microcentrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>75-003-287</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tube, Polystyrene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12224-50</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>D6493-01</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>NC0492929</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastLink II DNA Ligation Kit</td>
			<td>Epicentre Technologies</td>
			<td>LK6201H</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Colorless Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7833</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>3120-500</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noble agar, ultrapure</td>
			<td>Affymetris/USB</td>
			<td>AAJ10907A1</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404052</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank">https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation broth</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>Custom made batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 4080</td>
			<td>shake at 200 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0032-17-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Plates (100 O.D. x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks, round</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand of toothpicks, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>45-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anesthesia System Filters</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>118999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI 8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>Caliper Life Sciences/Xenogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection

Mikroorganismer er genetisk alsidige og forskelligartede og er blevet en vigtig kilde til mange kommercielle produkter og Biopharmaceuticals. Selv om nogle af disse produkter produceres naturligt af organismer, andre produkter kræver genteknologi af organismen til at øge udbyttet af produktionen. Avirulente stammer af Escherichia coli har traditionelt været de foretrukne bakteriearter til fremstilling af biofarmaceutiske; Men, nogle produkter er vanskelige for E. coli til at producere. Således kan Avirulente stammer af andre bakteriearter give nyttige alternativer til produktion af nogle kommercielle produkter. Pseudomonas aeruginosa er en almindelig og velstuderet gram-negativ bakterie, der kan udgøre et egnet alternativ til E. coli. P. aeruginosa er imidlertid et opportunistisk humant patogen. Her, vi detaljeret en procedure, der kan bruges til at generere ikke-patogene stammer af P. aeruginosa gennem sekventielle genomer sletninger ved hjælp af PEX100T-noti plasmid. Den største fordel ved denne metode er at producere en markør-fri stamme. Denne metode kan anvendes til at generere stærkt svækkede P. aeruginosa -stammer til fremstilling af kommercielle produkter eller til at designe stammer til andre specifikke anvendelser. Vi beskriver også en enkel og reproducerbar musemodel af bakteriel systemisk infektion via intraperitoneal injektion af validerede test stammer for at teste dæmpningen af den genetisk fremstillede stamme i forhold til den FDA-godkendte BL21 stamme af E. coli.

Som vist i figur 2kan den målrettede genomsletning bekræftes ved hjælp af koloni PCR med specifikke primere, der forstærker regionen af interesse. Kolonier, der bærer en genomisk sletning, vil give en kortere PCR-bånd størrelse i forhold til vilde kolonier. En PCR-Screen på 10-12 kolonier er normalt tilstrækkelig til at detektere mindst én koloni, der bærer den målrettede sletning. Hvis der ikke registreres sletninger efter flere skærm runder, sk...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Her beskriver vi en enkel og reproducerbar protokol af musemodel af infektion til at evaluere dæmpning af de genetisk modificerede stammer af Pseudomonas aeruginosa i forhold til USA Food and Drug Administration (FDA)-godkendt Escherichia coli til kommercielle applikationer.

Generation af in-frame-Gensletnings mutanter i Pseudomonas aeruginosa og testning for virulens dæmpning i en simpel muse model af infektion

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Denne protokol er signifikant for at skabe og bestemme sind-krop ønskede mutationer i genomet af Pseudomonas aeruginosa, samt test effekten af mutationer på virulens reduktion i en reproducerbar musemodel. Den vigtigste fordel ved denne teknik er en krom validering og en reproducerbarhed af mus infektion model. Bakterier arbejder konstant, hele tiden ændrer sig.For at bremse denne proces, bruger vi en frossen stopper, taske dem, hænge dem på flere trin på modifikation, før du tester dem i musen model. Nogen bekendt med disse metoder vil højst sandsynligt kæmpe med udvikling og udvælgelse af mulige crossover rekombinant at teste. Desuden vil håndteringen af musene for infektion være vanskelig for en person, der ikke er bekendt med dyrearbejde.Denne metode kan anvendes til test af andre patogener og deres mutanter, samt virulens inficere i mus. Sammenlignet med de nuværende modeller kan procedurer med reproducerbarhed plus klonvalidering før og efter infektion gavne andre efterforskere på området. Visuel demonstration af denne protokol giver indsigt i omfattende procedurer, der kan være svære at forstå eller forstå ved at læse alene.Start med at dyrke enkelt crossover, rekombinant kolonier i Pseudomonas Isolation Bouillon, eller PIB. Inokuler og streak 10 mikroliter af hver kultur på forvarmte PIA plader, suppleret med 10% saccharose. Derefter inkubere pladerne natten over ved 37 grader Celsius.Den næste dag skal pladerne fjernes fra inkubatoren og inspicere dem for vækst. Den saccharoseresistente koloni skal være dobbelt crossover rekombinanter. Brug sterile tandstikkere til at lappe mindst 20 kolonier på forvarmte plader af PIA, PIA suppleret med 10% saccharose, og PIA suppleret med carbenicillin.Inkuber pladerne natten over og undersøge dem for vækst på den næste dag. Ægte dobbelt crossover rekombinanter vil være carbenicillin-følsomme og saccharose-resistente. Skærm 10 til 20 kolonier til sletning, ved hjælp af koloni PCR.Afhente væksten af en formodet dobbelt crossover rekombinant med en steril tandstikker og suspendere det i 50 mikroliter af PBS. Kog suspensionen ved 100 grader Celsius i 10 minutter. Centrifuge det i tre minutter ved 13,000 gange G og læg den på is.Derefter udføre PCR i henhold til manuskript retninger. Når PCR er færdig, udføre Agarose gel elektroforese på produkterne. Mindre forstærkningsprodukter angiver kolonier, hvor interesseregionen er blevet slettet.Om morgenen af injektioner, tø cryovials af bakterieceller ved fire grader Celsius i tre til fire timer. Hold hætteglassene på is efter optøning og injicer musene inden for to timer. Overfør indholdet af hver kryovial til en ny to milliliter rør og centrifuge det på 4, 500 gange G i 10 minutter.Supernatanten kasseres, og cellepellet skal hænges igen i en milliliter PBS. Centrifugering og genspjæld cellerne i PBS til en endelig koncentration på 2,5 gange 10 til den niende koloni, der danner enheder pr. milliliter. Der udtages tre prøver fra den endelige suspension af hver stamme for at validere koncentration, genotype og fænotype.For hver stamme skal der anvendes 1,5 milliliter cellesuspension i et 2 milliliterrør, og PBS forberedes til kontrolinjekt injektioner. Saml mus og materialer, der er nødvendige til injektioner i et sterilt dyrekirurgisk rum, og tør alle overflader af med desinficeringsservietter, før du starter. Brug to par latexhandsker for at begrænse risikoen for punktering, hvis de er bidt, samt en laboratoriekittel, sikkerhedsbriller og ansigtsmaske.Fjern musen fra buret og veje det, mærkning halen med permanent markør for post-injektion sporing. Åbn en ny millilitersprøjte med en 27 gauge nål og udskø 200 mikroliter steril PBS. Grib musen bag ørerne, ved hjælp af tommelfingeren og pegefingeren, og knibe for at skabe en hud fold på nakken.Derefter fastgør halen ind i håndfladen ved hjælp af pinky til at holde musen flad og immobile. Sæt nålen i en 30 graders vinkel ind i bughulen til venstre eller højre for midterlinjen. Løft nålen lidt for at sikre, at den ikke blev indsat i organer.Derefter skal DU langsomt injicere PBS og trække nålen tilbage. En bolus på injektionsstedet er typisk. Anlæste nålen i den udpegede beholder til bortskaffelse af skarpe genstande, og flyt musen til et separat bur.Gentag proceduren med den næste mus og efter alle mus fra et bur er injiceret, flytte dem tilbage til deres oprindelige bur. Efter injektion af kontrolgruppen injiceres testgrupperne ved hjælp af samme procedure. Når alle injektioner er færdige, skal musene returneres til husets rum og rengøre arbejdsområdet med desinficeringsservietter.At billedet dyrene, forberede billedbehandlingssystemet ved at indstille kameraets parametre og varme scenen. Indstil iltstrømmen til 1,5 liter i minuttet og isofluran til 3,5%, og flyt musen til bedøvelseskammeret, derefter til temperaturstabiliseret fase efter anæstesi. Placer musen på ryggen med udstrakte arme, og monter en næsekegle til administration af 2,5 % isofluran under billeddannelse.Luk døren og tag bioluminescerende billeder og røntgenbilleder af musen. Når billeddannelsen er færdig, skal du returnere musen til buret og overvåge den. Det bør genvinde bevidstheden inden for tre til fem minutter.De målrettede genomiske sletninger blev bekræftet af koloni-PCR med specifikke primere, der forstærkede interesseregionen. Kolonier med den genomiske sletning giver et kortere PCR-bånd sammenlignet med vilde kolonier. Intraperitoneal injektion af den svækkede stamme af P aeruginosa, PGN fem, resulterede i 0% dødelighed, svarende til dødelighed observeret med E.coli BL 21.Injektion af forældrestammen var imidlertid dødelig for 80 % af musene. Infektion progression blev sporet ved hjælp af bioluminescens-mærket forælder og svækket stammer. Den svækkede stamme forblev lokaliseret på injektionsstedet, indtil bioluminescensen falmede, hvilket sandsynligvis faldt sammen med clearance af infektion.Den fremlagte metode undersøgte kun den dødelighed, der frembragte af stammen. Mere i dybden immunologiske og toksikologiske aspekter kunne udnyttes til at bestemme dynamikken i infektion og den endelige virkning infektionen har, der ikke resulterer i døden. Det vigtigste i proceduren er den omfattende validering udført, mellem forskellige trin fra indledende identifikation til dyreforsøg.Manglende visse valideringstrin kan potentielt føre til forkert resultat, da de testede stammer kan gennemgå mutation og udvælgelse eller blive forurenet. Med udviklingen af disse to teknikker, vi tror, at dette vil give vores forskere inden for infektion immunologi til mere effektivt at undersøge, hvordan magtfulde pakke interaktion fører til den ekstreme fænotype, sepsis, og dødelighed. Forskellige næringsstoffer'indvirkning på varianter kan sammenlignes gennem størrelse dosering af bakterier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Brug af kunstig Sputum Medium til Test antibiotikum Effekt mod<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I forhold mere relevante for cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Langtids kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luftvejsinfektion i mus

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

At studere mikrobielle samfund<em&gt; In vivo</em&gt;: En model af Host-medieret samspil mellem<em&gt; Candida albicans</em&gt; Og<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I luftvejene

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En simpel og effektiv tilgang til Construct Mutant vacciniavirus Vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Kommer til lys Side: In Vivo overvågning af Pseudomonas aeruginosa Biofilm infektioner i kroniske sår i en diabetisk Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikering af bestilt, Nonredundant bibliotek af Pseudomonas aeruginosa stamme PA14 Transposon indsættelse mutanter

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluering af virulens og patogenese af Aeromonas infektion i en Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

En forsinket vaccination Model af kronisk Pseudomonas aeruginosa Sårinfektion

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...