Name: generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection
Uploaded: 2020-01-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den Nationalen Instituten für Gesundheit (NIH) Stipendien R44GM1113545 und P20GM103434 unterstützt.

Vor Beginn von Tierversuchen muss das anzuwendende Protokoll vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung (IACUC) genehmigt werden. Die Zulassung für das beschriebene Protokoll wurde durch die IACUC an der Marshall University (Huntington, WV, USA) eingeholt.
1. Plasmid-Design
<ol><li>Um eine genetische Deletion mit dem pEX100T-NotI-Plasmid zu erzeugen, klonen Sie die DNA-Bereiche, die die gewünschte Deletionssequenz flankieren, und fügen Sie sie in die NotI-Einschränkun...

<ol>
	<li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li><li>Valentine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+highly+attenuated+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+commercial+production+of+alginate.">Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate.</a> Microbial Biotechnology. , (2019).</li><li>Schweizer, H. P., Hoang, T. 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S., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+lacking+the+extreme-stress+sigma+factor+AlgU+(sigmaE).">Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE).</a> Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).</li><li>Baeshen, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Biopharmaceuticals+in+E.+coli:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).</li><li>Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+industrial+Escherichia+coli+strains+in+fed-batch+cultivations+during+high-level+SOD+protein+production.">Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production.</a> Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).</li><li>Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+factories+for+recombinant+pharmaceuticals.">Microbial factories for recombinant pharmaceuticals.</a> Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans.">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10-min+method+for+preparation+of+highly+electrocompetent+Pseudomonas+aeruginosa+cells:+application+for+DNA+fragment+transfer+between+chromosomes+and+plasmid+transformation.">A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation.</a> Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).</li><li>Liang, R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scarless+and+sequential+gene+modification+in+Pseudomonas+using+PCR+product+flanked+by+short+homology+regions.">Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions.</a> BMC Microbiology. 10, 209 (2010).</li><li>Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+multiple+genomic+deletions+in+Gram-negative+bacteria:+analysis+of+the+multi-resistant+antibiotic+profile+of+Pseudomonas+putida+KT2440.">Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).</li><li>Song, C. W., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+inactivation+of+single+or+multiple+genes+in+Escherichia+coli.">Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli.</a> Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).</li><li>Yan, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a-Assisted+Recombineering+in+Bacteria.">CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).</li><li>Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+and+prospects+of+microbial+preservation.">Practice and prospects of microbial preservation.</a> FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).</li></ol>

Das pEX100T-Not1 Plasmid ist ein effizienter Vermittler sequenzieller genomischer Deletionen, die markerfrei und im Rahmen sind. Bei der Entwicklung von Bakterienstämmen für abgeschwächte Virulenz verringert das Löschen ganzer Gensequenzen anstatt Punktmutationen zu generieren, die Wahrscheinlichkeit einer Rückkehr zu einem virulenten Phänotyp. Zusätzlich dämtt jede Pathogenitätsgen-Deletion den Erreger weiter ab und verstärkt die Stabilität der Dämpfung.
Diese Methode kann auch ve...

Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer bakterieller Erreger, der beim Menschen lebensbedrohliche Krankheiten verursachen kann, insbesondere bei immungeschwächten. Die Pathogenität von P. aeruginosa ist auf die Expression vieler Virulenzfaktoren, einschließlich Proteasen und Lipopolysaccharid, sowie seine Fähigkeit, einen schützenden Biofilm zubilden, zurückzuführen. Aufgrund seiner Fähigkeit, Virulenzfaktoren zu produzieren und Krankheiten beim Menschen verursachen, stellt die Verwendung von P. aeruginosa zur Herstellung kommerzieller Produkte Sicherheitsbedenken dar. Nichtpathogene Stämme von E. coli werden traditionell verwendet, um medizinische und kommerzielle Produkte für den menschlichen Gebrauch zu bioengineering. Jedoch, einige Produkte sind schwierig für E. coli zu machen, und viele sind in Inklusionsgremien verpackt, so dass Extraktion mühsam. Technische Bakterienstämme mit der Fähigkeit, bestimmte Produkte herzustellen und zu sezernieren, sind sehr wünschenswert, da die Sekretion wahrscheinlich die Ausbeute erhöhen und Reinigungsprozesse erleichtern würde. So können nicht pathogene Stämme anderer Bakterienarten (z. B. Arten, die mehr Sekretionswege nutzen) nützliche Alternativen zu E. coli bieten. Wir berichteten vor kurzem die Entwicklung eines Stammes von P. aeruginosa, PGN5, in dem die Pathogenität und Toxizität des Organismus stark abgeschwächt ist2. Wichtig ist, dass dieser Stamm immer noch große Mengen des Polysaccharidalginats produziert, einem kommerziell interessanten Bestandteil des Biofilms P. aeruginosa.
Der PGN5-Stamm wurde mit einem zweistufigen Allelic-Austauschverfahren mit dem pEX100T-NotI-Plasmid erzeugt, um fünf Gene(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) sequenziell zu löschen, die bekanntermaßen zur Pathogenität des Organismus beitragen. pEX100T-NotI wurde durch die Umwandlung des SmaI in eine NotI-Restriktionsenzymerkennungsstelle innerhalb der Mehrfachklonstelle des Plasmids pEX100T erzeugt, die im Labor von Herbert Schweizer entwickelt wurde3,4. Die Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym NotI ist eine seltenere DNA-Sequenz im Vergleich zu SmaI und ist weniger wahrscheinlich in geklonten Sequenzen vorhanden, daher ist es für Klonzwecke bequemer. Das Plasmid trägt Gene, die eine Selektion ermöglichen, einschließlich des bla-Gens, das ß-Lactamase kodiert und Resistenzen gegen Carbenicillin verleiht, und das B. subtilissacB-Gen, das die Empfindlichkeit gegenüber Saccharose verleiht (Abbildung 1A). Das Plasmid trägt auch einen Ursprung der Replikation (ori) kompatibel mit E. coli, und einen Ursprung der Übertragung (oriT), die plasmid Transfer von E. coli zu Pseudomonas Arten über Konjugation ermöglicht. Dem Plasmid fehlt jedoch ein mit Pseudomonaskompatibler Replikationsursprung und kann daher innerhalb der Pseudomonas-Arten nicht replizieren (d. h. es handelt sich um einen Pseudomonas-Selbstmordvektor). Diese Eigenschaften machen pEX100T-NotI ideal für die gezielte genetische Deletion aus dem Pseudomonas-Chromosom. Plasmid-Klonschritte werden mit E. coli durchgeführt und das resultierende Plasmid wird durch Umwandlung oder Konjugation auf Pseudomonas übertragen. Dann wird durch homologe Rekombinationsereignisse und selektive Schritte die gezielte In-Frame-Deletion generiert, markerfrei. Diese Methode, genomische Regionen sequenziell aus dem Chromosom von P. aeruginosa zu löschen, könnte verwendet werden, um stark abgeschwächte Pseudomonas-Stämme wie PGN5 zu erzeugen oder Stämme für andere spezifische Anwendungen zu entwerfen (z. B. Stämme, die einen Mangel an Endonukleasen für die Plasmidvermehrung haben, oder Stämme, die einen Mangel an Proteasen für die Produktion von Proteinen von Interesse haben).
Die allgemeine Virulenz von Bakterienstämmen wird durch Wachstumsbedingungen und Phasen beeinflusst, in denen Mutationen häufig auftreten. Daher kann die Messung der Sicherheit gentechnisch veränderter Stämme eine Herausforderung darstellen. Um bakterielle Isolate auf systemische Virulenz zu untersuchen, haben wir ein zuvor veröffentlichtes Infektionsprotokoll durch intraperitoneale Injektion von C57BL/6-Mäusen5angepasst. Wir haben dieses Verfahren modifiziert, um gefrorene Bakterienvorräte für die Injektion zu verwenden, was eine präzise Beweichung und eine einfache Validierung der verwendeten Stämme ermöglichte. In diesem Modell wurde der E. coli-Stamm BL21, der von der FDA für die Herstellung von Biopharmazeutika zugelassen ist, als Kontrollsicherheitsstandard für die Bestimmung der relativen Pathogenese des Stammes6,7,8verwendet. Der Hauptvorteil der Verwendung dieser Methode ist, dass es reproduzierbar ist und Variationsquellen minimiert, da infizierende Stämme für bakterielle Zellzahl, Phänotyp und genetische Marker sowohl vor als auch nach der Infektion validiert werden. Mit diesen kontrollierten Schritten wird die Anzahl der benötigten Tiere reduziert. In diesem Modell können P. aeruginosa-Stämme, die zu C57BL/6 murinen Sterblichkeitsraten von e. coli BL21 führen, wenn sie intraperitoneal injiziert werden, als abgeschwächt angesehen werden. Dieses einfache Mausmodell der Infektion kann auch verwendet werden, um die abgeschwächte Pathogenität von gentechnisch veränderten Stämmen anderer Arten unter Verwendung des von der FDA zugelassenen E. coli-Stamms als Referenz zu bewerten. In den Schritten 1-7 wird die Generierung sequenzieller genomischer Deletionen in P. aeruginosa (Abbildung 1) und die Schritte 8-12 detailliert die Verwendung eines Mausmodells zur Erprobung der Pathogenität von P. aeruginosa-Stämmen beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes with flat caps</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable polystyrene cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-821-13B</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>04-987-372</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Microcentrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>75-003-287</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tube, Polystyrene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12224-50</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>D6493-01</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>NC0492929</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastLink II DNA Ligation Kit</td>
			<td>Epicentre Technologies</td>
			<td>LK6201H</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Colorless Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7833</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>3120-500</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noble agar, ultrapure</td>
			<td>Affymetris/USB</td>
			<td>AAJ10907A1</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404052</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank">https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation broth</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>Custom made batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 4080</td>
			<td>shake at 200 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0032-17-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Plates (100 O.D. x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks, round</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand of toothpicks, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>45-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anesthesia System Filters</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>118999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI 8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>Caliper Life Sciences/Xenogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection

Mikroorganismen sind genetisch vielseitig und vielfältig und haben sich zu einer wichtigen Quelle für viele kommerzielle Produkte und Biopharmazeutika entwickelt. Obwohl einige dieser Produkte natürlich von den Organismen produziert werden, erfordern andere Produkte Gentechnik des Organismus, um die Produktionserträge zu erhöhen. Avirulen-Stämme von Escherichia coli sind traditionell die bevorzugte Bakterienart für die Herstellung von Biopharmazeutika; einige Produkte sind jedoch für E. coli schwer herzustellen. So könnten avirulente Stämme anderer Bakterienarten nützliche Alternativen für die Produktion einiger kommerzieller Produkte bieten. Pseudomonas aeruginosa ist ein häufiges und gut untersuchtes Gram-negatives Bakterium, das eine geeignete Alternative zu E. colibieten könnte. P. aeruginosa ist jedoch ein opportunistischer menschlicher Erreger. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das verwendet werden kann, um nicht pathogene Stämme von P. aeruginosa durch sequenzielle genomische Deletionen mit dem pEX100T-NotI-Plasmid zu erzeugen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, einen markerfreien Stamm zu erzeugen. Diese Methode kann verwendet werden, um stark abgeschwächte P. aeruginosa-Stämme für die Herstellung kommerzieller Produkte zu erzeugen oder Stämme für andere spezifische Verwendungszwecke zu entwerfen. Wir beschreiben auch ein einfaches und reproduzierbares Mausmodell der bakteriellen systemischen Infektion durch intraperitoneale Injektion von validierten Teststämmen, um die Dämpfung des gentechnisch veränderten Stammes im Vergleich zum FDA-zugelassenen BL21-Stamm von E. colizu testen.

Wie in Abbildung 2dargestellt, kann die gezielte genomische Deletion mit Kolonie-PCR mit spezifischen Primern bestätigt werden, die die Interessensregion verstärken. Kolonien, die eine genomische Deletion tragen, ergeben eine kürzere PCR-Bandgröße im Vergleich zu Wildtypkolonien. Ein PCR-Bildschirm von 10-12 Kolonien ist in der Regel ausreichend, um mindestens eine Kolonie zu erkennen, die die gezielte Löschung trägt. Wenn nach mehreren Bildschirmrunde...

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Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Hier beschreiben wir ein einfaches und reproduzierbares Protokoll des Mausmodells der Infektion, um die Dämpfung der genetisch veränderten Stämme von Pseudomonas aeruginosa im Vergleich zur von der United States Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Escherichia coli für kommerzielle Anwendungen zu bewerten.

Generierung von In-Frame-Gen-Deletion Mutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf VirulenzDämpfung in einem einfachen Mausmodell der Infektion

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Dieses Protokoll ist wichtig für die Erstellung und Bestimmung von vom Geist und Körper gewünschten Mutationen im Genom von Pseudomonas aeruginosa, sowie die Prüfung der Wirkung von Mutationen auf die Virulenzreduktion in einem reproduzierbaren Mausmodell. Der Hauptvorteil dieser Technik ist eine Chromvalidierung und eine Reproduzierbarkeit des Mausinfektionsmodells. Bakterien arbeiten ständig und verändern sich ständig.Um diesen Prozess zu verlangsamen, verwenden wir einen gefrorenen Stopp, packen sie, hängen sie auf mehrere Sprossen bei der Modifikation, bevor wir sie im Mausmodell testen. Jemand, der mit diesen Methoden nicht vertraut ist, wird höchstwahrscheinlich mit der Entwicklung und Auswahl möglicher Crossover-Rekombinante zu testen kämpfen. Darüber hinaus wird der Umgang mit den Mäusen für Infektionen für jemanden schwierig sein, der mit der Tierarbeit nicht vertraut ist.Diese Methode kann angewendet werden, um andere Krankheitserreger und ihre Mutanten zu testen, sowie Virulenz-Infektion bei Mäusen. Im Vergleich zu aktuellen Modellen können Verfahren mit Reproduzierbarkeit und Klonvalidierung vor und nach einer Infektion anderen Forschern vor Ort zugute kommen. Die visuelle Demonstration dieses Protokolls bietet Einblicke in umfangreiche Verfahren, die durch das Lesen allein schwer zu verstehen oder zu verstehen sind.Beginnen Sie mit dem Anbau von Single Crossover, rekombinanten Kolonien in Pseudomonas Isolation Broth, oder PIB. Impfen und Streifen 10 Mikroliter jeder Kultur auf vorgewärmten PIA-Platten, ergänzt mit 10%Saccharose. Dann bebrüten die Teller über Nacht bei 37 Grad Celsius.Entfernen Sie am nächsten Tag die Platten aus dem Inkubator und inspizieren Sie sie auf Wachstum. Die saccharoseresistente Kolonie sollte doppelüberquerende Rekombinanten sein. Verwenden Sie sterile Zahnstocher, um mindestens 20 Kolonien auf vorgewärmte Platten von PIA zu flicken, PIA mit 10% Saccharose und PIA ergänzt mit Carbenicillin.Die Platten über Nacht bebrüten und am nächsten Tag auf Wachstum untersuchen. Echte Doppel-Crossover-Rekombinanten sind Carbenicillin-empfindlich und saccharosefest. Bildschirm 10 bis 20 Kolonien zum Löschen, mit Kolonie PCR.Nehmen Sie das Wachstum eines vermuteten Doppel-Crossover-Rekombinanten mit einem sterilen Zahnstocher auf und setzen Sie es in 50 Mikroliter PBS aus. Kochen Sie die Federung bei 100 Grad Celsius für 10 Minuten. Zentrifugieren Sie es für drei Minuten bei 13.000 Mal G und legen Sie es auf Eis.Führen Sie dann PCR nach Manuskriptanweisungen aus. Sobald PCR fertig ist, führen Sie Agarose Gel Elektrophorese auf den Produkten. Kleinere Amplifikationsprodukte weisen auf Kolonien hin, in denen die Interessenregion gelöscht wurde.Am Morgen der Injektionen, tauen die Kryovials der Bakterienzellen bei vier Grad Celsius für drei bis vier Stunden. Halten Sie die Fläschchen nach dem Auftauen auf Eis und injizieren Sie die Mäuse innerhalb von zwei Stunden. Übertragen Sie den Inhalt jedes Kryovials auf ein neues Zwei-Milliliter-Rohr und zentrifugieren Sie ihn bei 4, 500 mal G für 10 Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter PBS wieder auf. Wiederholen Sie die Zentrifugation und setzen Sie die Zellen in PBS auf eine Endkonzentration von 2,5 mal 10 auf die neunte Kolonie bildende Einheiten pro Milliliter wieder aus. Nehmen Sie drei Proben von der endgültigen Suspension jedes Stammes, um Konzentration, Genotyp und Phänotyp zu validieren.Für jeden Stamm 1,5 Milliliter der Zellsuspension in ein Zwei-Milliliter-Rohr zu geben und die PBS für Steuerinjektionen vorzubereiten. Sammeln Sie die Mäuse und Materialien, die für Injektionen benötigt werden, in einem sterilen chirurgischen Raum für Tiere und wischen Sie alle Oberflächen mit Desinfektionstüchern ab, bevor Sie beginnen. Tragen Sie zwei Paar Latexhandschuhe, um das Risiko einer Punktion zu begrenzen, wenn sie gebissen wird, sowie einen Labormantel, eine Schutzbrille und eine Gesichtsmaske.Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und wiegen Sie sie, indem Sie den Schwanz mit einem permanenten Marker für die Nachverfolgung nach der Injektion markieren. Öffnen Sie eine neue Ein-Milliliter-Spritze mit einer 27-Spur-Nadel und ziehen Sie 200 Mikroliter steriles PBS. Schnappen Sie sich die Maus hinter den Ohren, mit Daumen und Zeigefinger, und kneifen, um eine Hautfalte am Nacken zu erstellen.Dann sichern Sie den Schwanz in die Handfläche mit dem Pinky, um die Maus flach und unbeweglich zu halten. Setzen Sie die Nadel in einem 30-Grad-Winkel in die Peritonealhöhle links oder rechts der Mittellinie ein. Heben Sie die Nadel leicht an, um sicherzustellen, dass sie nicht in Organe eingeführt wurde.Dann injizieren Sie langsam die PBS und ziehen Sie die Nadel. Ein Bolus an der Injektionsstelle ist typisch. Legen Sie die Nadel in den dafür vorgesehenen Scharfen-Entsorgungsbehälter und bewegen Sie die Maus in einen separaten Käfig.Wiederholen Sie den Vorgang mit der nächsten Maus und nachdem alle Mäuse aus einem Käfig injiziert werden, verschieben Sie sie zurück in ihren ursprünglichen Käfig. Nachdem Sie die Kontrollgruppe injiziert haben, injizieren Sie die Testgruppen mit demselben Verfahren. Sobald alle Injektionen abgeschlossen sind, bringen Sie die Mäuse in den Wohnraum zurück und reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Desasietüchern.Um die Tiere abzubilden, bereiten Sie das Bildgebungssystem vor, indem Sie die Kameraparameter einstellen und die Bühne erwärmen. Stellen Sie den Sauerstoffstrom auf 1,5 Liter pro Minute und Isofluran auf 3,5 % ein und bewegen Sie die Maus in die Anästhesiekammer, dann in das temperaturstabilisierte Stadium, nach anästhesie. Positionieren Sie die Maus auf dem Rücken mit ausgestreckten Armen und passen Sie einen Nasenkegel für die Verabreichung von 2,5% Isofluran während der Bildgebung.Schließen Sie die Tür und nehmen Sie biolumineszierende Bilder und Röntgenaufnahmen der Maus. Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, kehren Sie die Maus in ihren Käfig zurück und überwachen Sie sie. Es sollte das Bewusstsein innerhalb von drei bis fünf Minuten wiedererlangen.Die gezielten genomischen Deletionen wurden von der Kolonie PCR mit spezifischen Primern bestätigt, die die Interessensregion verstärkten. Kolonien mit der genomischen Deletion ergeben ein kürzeres PCR-Band im Vergleich zu Wildenkolonien. Die intraperitoneale Injektion des abgeschwächten Stammes von P aeruginosa, PGN five, führte zu einer Sterblichkeit von 0 %, was der Mortalität entspricht, die mit E.coli BL 21 beobachtet wurde.Die Injektion des Elternstamms war jedoch für 80% der Mäuse tödlich. Die Infektionsprogression wurde mit biolumineszenzmarkierten Eltern und abgeschwächten Stämmen verfolgt. Der abgeschwächte Stamm blieb an der Injektionsstelle lokalisiert, bis die Biolumineszenz verblasste, was wahrscheinlich mit der Clearance der Infektion zusammenfiel.Die vorgestellte Methode untersuchte nur die Sterblichkeit, die durch den Stamm erzeugt wurde. Genauere immunologische und toxikologische Aspekte könnten genutzt werden, um die Dynamik der Infektion zu bestimmen und die Endwirkung der Infektion, die nicht zum Tod führt. Das Wichtigste im Verfahren ist die umfangreiche Validierung zwischen verschiedenen Schritten von der Erstidentifizierung bis hin zu Tierversuchen.Das Fehlen bestimmter Validierungsschritte kann möglicherweise zu falschen Folgen führen, da die getesteten Stämme Mutationen und Selektionen unterzogen oder kontaminiert werden können. Mit der Entwicklung dieser beiden Techniken, wir denken, dass dies unseren Forschern auf dem Gebiet der Infektionsimmunologie ermöglichen wird, effektiver zu untersuchen, wie leistungsfähige Paketinteraktion zu dem extremen Phänotyp, Sepsis und Mortalität führt. Die Auswirkungen verschiedener Nährstoffe auf Varianten können durch die Größendosierung von Bakterien verglichen werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

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Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

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Besuchen Sie die Licht-Seite: In Vivo Monitoring von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Infektionen bei chronischen Wunden in einer diabetischen haarlose Mausmodell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

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Replikation von bestellt, Nonredundant Bibliothek von Pseudomonas Aeruginosa Stamm PA14 Transposon Insertion Mutanten

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

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Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas Infektion in einem Caenorhabditis Elegans -Modell

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

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Ein verzögertes Impfmodell der chronischen Pseudomonas aeruginosa Wundinfektion

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...