Name: generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection
Uploaded: 2020-01-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd R44GM113545 og P20GM103434.

Før begynnelsen dyr eksperimenter, må protokollen som skal brukes godkjennes av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC). Godkjenning for protokollen beskrevet ble innhentet gjennom IACUC ved Marshall University (Huntington, WV, USA).
1. plasmider design
<ol><li>For å generere en genetisk sletting ved hjelp av pEX100T-NotI plasmider, klone regionene DNA flankerer ønsket sletting sekvens og sette inn i NotI restriksjons området av plasmider. Den plasmider innsatsen skal inneh...

<ol>
	<li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li><li>Valentine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+highly+attenuated+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+commercial+production+of+alginate.">Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate.</a> Microbial Biotechnology. , (2019).</li><li>Schweizer, H. P., Hoang, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+system+for+gene+replacement+and+xylE+fusion+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa.">An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Gene. 158 (1), 15-22 (1995).</li><li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis.">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).</li><li>Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+lacking+the+extreme-stress+sigma+factor+AlgU+(sigmaE).">Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE).</a> Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).</li><li>Baeshen, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Biopharmaceuticals+in+E.+coli:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).</li><li>Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+industrial+Escherichia+coli+strains+in+fed-batch+cultivations+during+high-level+SOD+protein+production.">Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production.</a> Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).</li><li>Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+factories+for+recombinant+pharmaceuticals.">Microbial factories for recombinant pharmaceuticals.</a> Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans.">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10-min+method+for+preparation+of+highly+electrocompetent+Pseudomonas+aeruginosa+cells:+application+for+DNA+fragment+transfer+between+chromosomes+and+plasmid+transformation.">A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation.</a> Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).</li><li>Liang, R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scarless+and+sequential+gene+modification+in+Pseudomonas+using+PCR+product+flanked+by+short+homology+regions.">Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions.</a> BMC Microbiology. 10, 209 (2010).</li><li>Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+multiple+genomic+deletions+in+Gram-negative+bacteria:+analysis+of+the+multi-resistant+antibiotic+profile+of+Pseudomonas+putida+KT2440.">Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).</li><li>Song, C. W., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+inactivation+of+single+or+multiple+genes+in+Escherichia+coli.">Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli.</a> Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).</li><li>Yan, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a-Assisted+Recombineering+in+Bacteria.">CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).</li><li>Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+and+prospects+of+microbial+preservation.">Practice and prospects of microbial preservation.</a> FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).</li></ol>

PEX100T-Not1-plasmider er en effektiv formidler av sekvensielle genomisk slettinger som er markør fri og i-ramme. Når engineering bakterielle stammer for svekket virulens, sletting av hele gen sekvenser snarere enn å generere punkt mutasjoner reduserer sannsynligheten for reversion til en voldsom fenotype. I tillegg, hver patogenitet gen sletting attenuates den patogen videre, forsterke stabiliteten av demping.
Denne metoden kan også brukes til å generere genomisk modifikasjoner enn slett...

Pseudomonas aeruginosa er en opportunistiske bakterie patogen som kan forårsake livstruende sykdommer hos mennesker, spesielt i immunsupprimerte. Patogenitet av P. aeruginosa skyldes uttrykk for mange virulens faktorer, inkludert proteaser og lipopolysakkarid, så vel som dens evne til å danne en beskyttende biofilm1. På grunn av sin evne til å produsere virulens faktorer og forårsake sykdom hos mennesker, ved hjelp av P. aeruginosa å lage kommersielle produkter presenterer sikkerhet bekymringer. Patogeniske stammer av E. coli har tradisjonelt blitt brukt til å bioengineer medisinske og kommersielle produkter for menneskelig bruk. Men noen produkter er vanskelig for E. coli å gjøre, og mange er pakket i inkludering organer, noe som gjør utvinning arbeidskrevende. Konstruert bakteriell stammer med evnen til å lage og skille ut bestemte produkter er svært ønskelig, som sekresjon vil trolig øke utbyttet og lette rensing prosesser. Således, patogeniske stammer av andre arter av bakterier (f. eks, arter som utnytter mer sekresjon trasé) kan gi nyttige alternativer til e. coli. Vi har nylig rapportert utviklingen av en stamme av P. aeruginosa, PGN5, der patogenitet og toksisitet av organismen er svært svekket2. Viktigere, produserer denne belastningen fortsatt store mengder av polysakkarid alginat, en kommersielt interessant komponent i P. aeruginosa biofilm.
Den PGN5 stammen ble generert ved hjelp av en to-trinns allel utveksling prosedyre med pEX100T-NotI plasmider til sekvensielt slette fem gener (toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) kjent for å bidra til patogenitet av organismen. pEX100T-NotI ble generert ved å endre SmaI til en NotI restriksjon enzym anerkjennelse området innenfor flere kloning området av plasmider pEX100T, som ble utviklet i Herbert Schweizer Lab3,4. Erkjennelsen nettstedet for begrensningen enzymet NotI er en sjeldnere DNA-sekvens i forhold til SmaI og mindre sannsynlighet for å være til stede i sekvenser blir klonet, og dermed er det mer praktisk for kloning formål. Plasmider bærer gener som tillater valg, inkludert Bla genet, som koder ß-laktamase og gir motstand mot carbenicillin, og B. subtilissacB Gene, som gir følsomhet for sukrose (figur 1A). Plasmider bærer også en opprinnelse av replikering(Ori) kompatibel med E. coli, og en opprinnelsen til overføring (oriT) som gjør det mulig for plasmider overføring fra E. coli til Pseudomonas arter via Bøyning. Imidlertid, det plasmider mangler en Origin av replikering forenlig med Pseudomonas, og således kan ikke duplisere innen Pseudomonas arter (i.e., det er en Pseudomonas selvmord vektor). Disse egenskapene gjør pEX100T-NotI ideelt for å målrette genetiske slettinger fra Pseudomonas -kromosom. Plasmider kloning trinnene er utført ved hjelp av E. coli og resulterende plasmider overføres til Pseudomonas ved transformasjon eller Bøyning. Så, igjennom homologe rekombinasjon begivenheter og selektiv skritt, det mål inne-rammen overstrekingen er utviklet, merke-ledig. Denne metoden for sekvensielt slette genomisk regioner fra kromosom av P. aeruginosa kan brukes til å generere svært svekket Pseudomonas stammer, som PGN5, eller å designe stammer for andre spesifikke bruksområder (f. eks, stammer mangelfull i endonucleases for plasmider forplantning eller stammer mangelfull i proteaser for produksjon av proteiner av interesse).
Den generelle virulens av bakteriestammer påvirkes av vekstforhold og faser, der mutasjoner forekommer hyppig. Derfor kan det være utfordrende å måle sikkerheten til genetisk konstruerte stammer. For å evaluere bakteriell isolat for systemisk virulens, tilpasset vi en tidligere publisert protokoll av infeksjon ved intraperitoneal injeksjon av C57BL/6 mus5. Vi endret denne prosedyren for å bruke frosne bakterielle aksjer for injeksjon, som tillot for presis dosering og enkel validering av stammene som brukes. I denne modellen, E. coli stamme BL21, som har vært FDA-godkjent for produksjon av biopharmaceuticals, ble brukt som en kontroll sikkerhet standard for å bestemme den relative patogenesen av belastningen6,7,8. Den største fordelen med å bruke denne metoden er at den er reproduserbar og minimerer kilder til variasjon, som infiserer stammer er validert for bakteriell celle nummer, fenotype, og genetiske markører både før og etter smitte. Med disse kontrollerte trinnene reduseres antallet dyr som kreves. I denne modellen, P. aeruginosa stammer som RESULTERER i C57BL/6 murine dødelighet lik eller mindre enn E. coli BL21 når injisert intraperitonealt kan betraktes som svekket. Denne enkle musen modell av infeksjon kan også brukes til å vurdere svekket patogenitet av genetisk konstruert stammer fra andre arter ved hjelp av FDA-godkjente E. coli stamme som referanse. Trinn 1-7 detaljer generering av sekvensiell genomisk slettinger i P. aeruginosa (figur 1) og trinn 8-12 detalj bruk av en musemodell for å teste patogenitet av P. aeruginosa stammer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes with flat caps</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable polystyrene cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-821-13B</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>04-987-372</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Microcentrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>75-003-287</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tube, Polystyrene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12224-50</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>D6493-01</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>NC0492929</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastLink II DNA Ligation Kit</td>
			<td>Epicentre Technologies</td>
			<td>LK6201H</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Colorless Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7833</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>3120-500</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noble agar, ultrapure</td>
			<td>Affymetris/USB</td>
			<td>AAJ10907A1</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404052</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank">https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation broth</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>Custom made batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 4080</td>
			<td>shake at 200 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0032-17-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Plates (100 O.D. x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks, round</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand of toothpicks, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>45-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anesthesia System Filters</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>118999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI 8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>Caliper Life Sciences/Xenogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection

Mikroorganismer er genetisk allsidig og mangfoldig og har blitt en viktig kilde til mange kommersielle produkter og biopharmaceuticals. Selv om noen av disse produktene er naturlig produsert av organismer, andre produkter krever genetisk engineering av organismen for å øke avkastningen av produksjonen. Avirulent stammer av Escherichia coli har tradisjonelt vært den foretrukne bakterie arten for å produsere biopharmaceuticals; men noen produkter er vanskelig for E. coli å produsere. Dermed kan avirulent stammer av andre bakterielle arter gi nyttige alternativer for produksjon av noen kommersielle produkter. Pseudomonas aeruginosa er en felles og godt studert gram-negativ bakterie som kan gi et egnet alternativ til E. coli. Imidlertid er P. aeruginosa en opportunistiske menneskelig patogen. Her detalj vi en prosedyre som kan brukes til å generere patogeniske stammer av P. aeruginosa gjennom sekvensielle genomisk slettinger ved hjelp av PEX100T-NotI plasmider. Den største fordelen med denne metoden er å produsere en markør fri belastning. Denne metoden kan brukes til å generere svært svekket P. aeruginosa stammer for produksjon av kommersielle produkter, eller å designe stammer for andre spesifikke bruksområder. Vi beskriver også en enkel og reproduserbar musemodell av bakteriell systemisk infeksjon via intraperitoneal injeksjon av validerte test stammer for å teste demping av genetisk konstruert belastning i forhold til FDA-godkjente BL21 stamme av E. coli.

Som vist i figur 2, kan den målrettede genomisk slettingen bekreftes ved hjelp av koloni PCR med spesifikk grunning som forsterker interesseområdet. Kolonier som har en genomisk sletting vil gi et kortere PCR-band størrelse i forhold til vill-type kolonier. En PCR-Screen av 10-12 kolonier er vanligvis tilstrekkelig til å oppdage minst en koloni som bærer målrettet sletting. Hvis det ikke oppdages noen slettinger etter flere runder med skjermbilder, gjen...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Her beskriver vi en enkel og reproduserbar protokoll av mus modell av infeksjon for å evaluere demping av genmodifiserte stammer av Pseudomonas aeruginosa i forhold til USA Food and Drug ADMINISTRATION (FDA)-godkjent Escherichia coli for kommersielle applikasjoner.

Generering av in-Frame Gene sletting mutanter i Pseudomonas aeruginosa og testing for virulens demping i en enkel mus modell av infeksjon

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Denne protokollen er viktig for å skape og bestemme sinn-kropp ønskede mutasjoner i genomet til Pseudomonas aeruginosa, samt teste effekten av mutasjoner på virulensreduksjon i en reproduserbar musemodell. Den viktigste fordelen med denne teknikken er en kromvalidering og en reproduserbarhet av museinfeksjonsmodell. Bakterier jobber hele tiden, og forandrer seg kontinuerlig.For å bremse denne prosessen bruker vi en frossen stopp, bag dem, henge dem på flere trinn på modifikasjon før du tester dem i musemodellen. Noen som ikke er kjent med disse metodene vil mest sannsynlig slite med utvikling og valg av mulig crossover rekombinant å teste. Videre vil håndteringen av musene for infeksjon være vanskelig for noen som ikke er kjent med dyrearbeid.Denne metoden kan brukes til å teste andre patogener og deres mutanter, samt virulens infisere hos mus. Sammenlignet med dagens modeller, prosedyrer med reproduserbarhet pluss klone validering før og etter infeksjon kan være til nytte for andre forskere i feltet. Visuell demonstrasjon av denne protokollen gir innsikt i omfattende prosedyrer som kan være vanskelige å forstå eller forstå gjennom å lese alene.Start med å vokse enkelt crossover, rekombinante kolonier i Pseudomonas Isolation Broth, eller PIB. Inokuler og strek 10 mikroliter av hver kultur på forhåndsoppvarmede PIA plater, supplert med 10% sukrose. Deretter inkubere platene over natten ved 37 grader Celsius.På neste dag, fjern platene fra inkubatoren og inspiser dem for vekst. Den sukroseresistente kolonien bør være dobbel crossover rekombinanter. Bruk sterile tannpirkere til å lappe minst 20 kolonier på forvarmede plater av PIA, PIA supplert med 10% sukrose, og PIA supplert med karbabinenicillin.Inkuber platene over natten og undersøke dem for vekst neste dag. Ekte dobbel crossover rekombinanter vil være carbenicillin-sensitive og sukrose-resistente. Skjerm 10 til 20 kolonier for sletting, ved hjelp av kolonien PCR.Plukk opp veksten av en mistenkt dobbel crossover rekombinant med en steril tannpirker og suspendere den i 50 mikroliter pbs. Kok suspensjonen ved 100 grader Celsius i 10 minutter. Sentrifuger den i tre minutter ved 13 000 ganger G og legg den på is.Deretter utfører du PCR i henhold til manuskriptretninger. Når PCR er ferdig, utfør Agarose gel elektroforese på produktene. Mindre forsterkningsprodukter indikerer kolonier der interesseområdet er slettet.Om morgenen med injeksjoner tiner kryovialene av bakterielle celler ved fire grader Celsius i tre til fire timer. Hold hetteglassene på is etter tining og injiser musene innen to timer. Overfør innholdet i hver kryovial til et nytt to milliliter rør og sentrifuge det ved 4, 500 ganger G i 10 minutter.Kast det overnaturlige og suspender cellepelleten på en milliliter PBS. Gjenta sentrifugeringen og re-suspendere cellene i PBS til en endelig konsentrasjon på 2,5 ganger 10 til niende koloni forming enheter per milliliter. Ta tre prøver fra den endelige suspensjonen av hver stamme for å validere konsentrasjon, genotype og fenotype.For hver stamme, aliquot 1,5 milliliter av cellesuspensjon i en to milliliter tube og forberede PBS for kontroll injeksjoner. Samle mus og materialer som trengs for injeksjoner i et sterilt dyr kirurgisk rom og tørk alle overflater med sanitizing kluter før du starter. Bruk to par latekshansker for å begrense risikoen for punktering, hvis de er bitt, samt en laboratoriefrakk, vernebriller og ansiktsmaske.Fjern musen fra buret og veie den, merking halen med permanent markør for post-injeksjon sporing. Åpne en ny en milliliter sprøyte med en 27 gauge nål og trekk opp 200 mikroliter steril PBS. Grip musen bak ørene, ved hjelp av tommelen og pekefingeren, og klem for å skape en hudfold i nakken.Deretter fester halen inn i håndflaten ved hjelp av pinky for å holde musen flat og immobile. Sett nålen i en 30 graders vinkel inn i bukhinnen til venstre eller høyre for midtlinjen. Løft nålen litt for å sikre at den ikke ble satt inn i organer.Deretter injiserer du PBS langsomt og trekker kanylen tilbake. En bolus på injeksjonsstedet er typisk. Plasser nålen i den angitte beholderen for avfallsdeponering av skarpe gjenstander og flytt musen til et eget bur.Gjenta prosedyren med neste mus, og etter at alle mus fra ett bur er injisert, flytt dem tilbake til sitt opprinnelige bur. Når du har injisert kontrollgruppen, injiserer du testgruppene ved hjelp av samme prosedyre. Når alle injeksjoner er fullført, returnerer musene til boligrommet og rengjør arbeidsområdet med sanitiseringsservietter.For å bilde av dyrene, klargjør bildesystemet ved å stille inn kameraparametrene og varme opp scenen. Sett oksygenstrømmen til 1,5 liter per minutt og isofluran til 3,5%og flytt musen til bedøvelseskammeret, deretter til temperaturstabilisert stadium, etter anestesi. Plasser musen på ryggen med armene utstrakt og monter en nesekjegle for administrering av 2,5% isofluran under bildebehandling.Lukk døren og ta bioluminescerende bilder og røntgenstråler av musen. Når bildet er fullført, returnerer du musen til buret og overvåker den. Det bør gjenvinne bevisstheten innen tre til fem minutter.De målrettede genomiske slettingene ble bekreftet av koloni-PCR med spesifikke primere som forsterket interesseregionen. Kolonier med genomisk sletting gir et kortere PCR-bånd sammenlignet med ville kolonier. Intraperitoneal injeksjon av den dempede stammen av P aeruginosa, PGN fem, resulterte i 0 % dødelighet, tilsvarende dødelighet observert med E.coli BL 21.Injeksjon av foreldrestammen var imidlertid dødelig for 80% av musene. Infeksjonsprogresjon ble sporet ved hjelp av bioluminescens-merket forelder og dempede stammer. Den dempede belastningen forble lokalisert på injeksjonsstedet til bioluminescensen falmet, noe som sannsynligvis sammenfalt med clearance av infeksjon.Metoden som presenteres, undersøkte bare dødeligheten som ble produsert av belastningen. Mer i dybden immunologiske og toksikologiske aspekter kan benyttes for å bestemme dynamikken i infeksjon og slutteffekten infeksjonen har som ikke resulterer i døden. Det viktigste i prosedyren er den omfattende valideringen gjort, mellom ulike trinn fra innledende identifikasjon til dyreforsøk.Manglende visse valideringstrinn kan potensielt føre til feil resultat, da de testede stammene kan gjennomgå mutasjon og utvelgelse, eller bli forurenset. Med utviklingen av disse to teknikkene tror vi dette vil tillate våre forskere innen infeksjonsimmunologi å mer effektivt undersøke hvordan kraftig pakkeinteraksjon fører til ekstrem fenotype, sepsis og dødelighet. Ulike næringsstoffers innvirkning på varianter kan sammenlignes gjennom størrelsessteding av bakterier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Bruk av kunstig Oppspytt Medium til Test antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Forhold mer relevant for Cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luftveisinfeksjon i Mus

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studere mikrobielle samfunn<em&gt; I Vivo</em&gt;: En modell av Host-mediert samhandling mellom<em&gt; Candida albicans</em&gt; Og<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel og effektiv tilnærming til Konstruer Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Kommer til lys Side: I Vivo overvåking av Pseudomonas aeruginosa Biofilm infeksjoner i kroniske sår i en diabetiker Hairless Murine modell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikering av bestilt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa belastning PA14 Transposon innsetting mutanter

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluere virulens og patogenesen av Aeromonas i en Caenorhabditis elegans modell

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

En forsinket inokulasjonmodell av kroniskpseudomonas aeruginosa sårinfeksjon

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...