Name: generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection
Uploaded: 2020-01-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) гранты R44GM113545 и P20GM103434.

Перед началом экспериментов на животных протокол, который должен быть использован, должен быть одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC). Утверждение описанного протокола было получено через IACUC в Университете Маршалла (Huntington, WV, США).
<p class="jove_title"...

<ol>
	<li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li><li>Valentine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+highly+attenuated+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+commercial+production+of+alginate.">Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate.</a> Microbial Biotechnology. , (2019).</li><li>Schweizer, H. P., Hoang, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+system+for+gene+replacement+and+xylE+fusion+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa.">An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Gene. 158 (1), 15-22 (1995).</li><li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis.">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).</li><li>Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+lacking+the+extreme-stress+sigma+factor+AlgU+(sigmaE).">Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE).</a> Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).</li><li>Baeshen, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Biopharmaceuticals+in+E.+coli:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).</li><li>Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+industrial+Escherichia+coli+strains+in+fed-batch+cultivations+during+high-level+SOD+protein+production.">Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production.</a> Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).</li><li>Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+factories+for+recombinant+pharmaceuticals.">Microbial factories for recombinant pharmaceuticals.</a> Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans.">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10-min+method+for+preparation+of+highly+electrocompetent+Pseudomonas+aeruginosa+cells:+application+for+DNA+fragment+transfer+between+chromosomes+and+plasmid+transformation.">A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation.</a> Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).</li><li>Liang, R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scarless+and+sequential+gene+modification+in+Pseudomonas+using+PCR+product+flanked+by+short+homology+regions.">Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions.</a> BMC Microbiology. 10, 209 (2010).</li><li>Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+multiple+genomic+deletions+in+Gram-negative+bacteria:+analysis+of+the+multi-resistant+antibiotic+profile+of+Pseudomonas+putida+KT2440.">Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).</li><li>Song, C. W., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+inactivation+of+single+or+multiple+genes+in+Escherichia+coli.">Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli.</a> Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).</li><li>Yan, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a-Assisted+Recombineering+in+Bacteria.">CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).</li><li>Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+and+prospects+of+microbial+preservation.">Practice and prospects of microbial preservation.</a> FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).</li></ol>

Плазмида pEX100T-Not1 является эффективным посредником последовательных геномных делетций, которые свободны от маркеров и находятся в кадре. При инженерных бактериальных штаммах для ослабленной вирулентности удаление целых генных последовательностей, а не генерация точечных мутаций сни?...

Pseudomonas aeruginosa является оппортунистическим бактериальным патогеном, который может вызвать опасные для жизни заболевания у людей, особенно в ослабленном иммунитете. Патогенность P. aeruginosa обусловлена выражением многих факторов вирулентности, включая протеазы и липополисахарид, а также его способностью образовывать защитную биопленку1. Из-за своей способности производить вирулентность факторов и вызвать болезни у людей, используя P. aeruginosa, чтобы сделать коммерческие продукты представляет проблемы безопасности. Непатогенные штаммы кишечной палочки традиционно используются для биоинженерных медицинских и коммерческих продуктов для использования человеком. Тем не менее, некоторые продукты трудно для кишечной палочки, чтобы сделать, и многие из них упакованы в включение органов, что делает добычу трудоемкой. Инженерные бактериальные штаммы с возможностью делать и выделять конкретные продукты очень желательно, так как секреция, скорее всего, увеличит урожайность и облегчит процессы очистки. Таким образом, непатогенные штаммы других видов бактерий (например, виды, которые используют более секреционные пути) могут обеспечить полезную альтернативу кишечной палочке. Недавно мы сообщили о разработке штамма P. aeruginosa, PGN5, в котором патогенность и токсичность организма сильно ослаблены2. Важно отметить, что этот штамм по-прежнему производит большое количество полисахаридного альгината, коммерчески интересного компонента биопленки P. aeruginosa.
Штамм PGN5 был создан с помощью двухступенчатой процедуры аллелистического обмена с плазмидом pEX100T-NotI, чтобы последовательно удалить пять генов(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA), как известно, способствуют патогенности организма. pEX100T-NotI был создан путем изменения SmaI на место распознавания ферментов ограничения NotI в пределах участка многократного клонирования плазмидного pEX100T, который был разработан в лаборатории Герберта Швайзера3,4. Место распознавания фермента NotI является более редкой последовательностью ДНК по сравнению с SmaI и менее вероятно, чтобы присутствовать в последовательностях, клонированных, таким образом, это более удобно для целей клонирования. Плазмида несет гены, которые позволяют для выбора, в том числе ген бла, который кодирует й-лактамазы и придает устойчивость к карбенициллин, и b. subtilissacB ген, который придает чувствительность сахарозы (Рисунок 1A). Плазмида также несет в себе происхождение репликации(ори)совместимы с кишечной палочкой,и происхождение передачи(oriT), что позволяет плазмидпередачи от кишечной палочки к Псевдомонас видов через спряжение. Тем не менее, плазмида не имеет происхождения репликации совместимы с Pseudomonas, и, таким образом, не может размножаться в Псевдомонас видов (т.е., это вектор самоубийства Pseudomonas). Эти характеристики делают pEX100T-NotI идеальным для таргетирования генетических удаляний из хромосомы Pseudomonas. Шаги клонирования плазмида выполняются с помощью кишечной палочки, и резучная плазмида передается в Псевдомонас путем трансформации или спряжения. Затем, через гомологичные события рекомбинации и селективные шаги, целенаправленное удаление в кадре генерируется, без маркеров. Этот метод последовательного удалять геномные области от хромосомы P. aeruginosa смог быть использован для того чтобы произвести высоки ослабленные штаммы Pseudomonas, как PGN5, или конструировать напряжения для других специфических польз (например, напряжения deficient в эндонуклизировании для плазмидного размножения или strains defic.
На общую вирулентность штаммов бактерий влияют условия роста и фазы, во время которых мутации происходят часто. Таким образом, измерение безопасности генетически-инженерных штаммов может быть сложной задачей. Для оценки бактериальных изолятов для системной вирулентности, мы адаптировали ранее опубликованный протокол инфекции путем интраперитонеальной инъекции c57BL/6 мышей5. Мы изменили эту процедуру, чтобы использовать замороженные бактериальные запасы для инъекций, что позволило для точного дозирования и легкой проверки используемых штаммов. В этой модели, штамм кишечной палочки BL21, который был одобрен FDA для производства биофармацевтических препаратов, был использован в качестве стандарта безопасности контроля для определения относительного патогенеза штамма6,7,8. Основным преимуществом использования этого метода является то, что он воспроизводим и сводит к минимуму источники вариаций, так как заражение штаммов проверяются на количество бактериальных клеток, фенотип и генетические маркеры как до, так и после заражения. С помощью этих контролируемых шагов, количество животных требуется уменьшается. В этой модели, P. aeruginosa штаммов, которые приводят к C57BL/6 коэффициенты смертности, равные или меньше, чем E. coli BL21 при инъекциях интраперитоно может рассматриваться с ослабленным. Эта простая модель мыши инфекции также может быть использована для оценки ослабленной патогенности генетически модифицированных штаммов от других видов, используя FDA утвержденных E. coli штамма в качестве ссылки. Шаги 1-7 подробно поколения последовательных геномных делетций в P. aeruginosa (Рисунок 1) и шаги 8-12 подробно использование мыши модели для проверки патогенности штаммов P. aeruginosa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes with flat caps</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable polystyrene cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-821-13B</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>04-987-372</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Microcentrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>75-003-287</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tube, Polystyrene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12224-50</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>D6493-01</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>NC0492929</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastLink II DNA Ligation Kit</td>
			<td>Epicentre Technologies</td>
			<td>LK6201H</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Colorless Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7833</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>3120-500</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noble agar, ultrapure</td>
			<td>Affymetris/USB</td>
			<td>AAJ10907A1</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404052</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank">https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation broth</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>Custom made batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 4080</td>
			<td>shake at 200 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0032-17-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Plates (100 O.D. x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks, round</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand of toothpicks, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>45-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anesthesia System Filters</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>118999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI 8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>Caliper Life Sciences/Xenogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection

Микроорганизмы генетически универсальны и разнообразны и стали основным источником многих коммерческих продуктов и биофармацевтических препаратов. Хотя некоторые из этих продуктов естественным образом производятся организмами, другие продукты требуют генной инженерии организма для увеличения урожайности продукции. Авирулентные штаммы кишечной палочки традиционно являются предпочтительными бактериальными видами для производства биофармацевтических препаратов; однако, некоторые продукты трудны для e. coli для того чтобы произвести. Таким образом, авиационные штаммы других видов бактерий могут служить полезной альтернативой для производства некоторых коммерческих продуктов. Pseudomonas aeruginosa является общей и хорошо изученной грам-негативной бактерией, которая может стать подходящей альтернативой кишечной палочке. Тем не менее, P. aeruginosa является оппортунистическим человеческим патогеном. Здесь мы подробно процедуры, которые могут быть использованы для генерации непатогенных штаммов P. aeruginosa через последовательные геномные удаления с помощью pEX100T-NotI плазмиды. Основным преимуществом этого метода является производство деформации без маркера. Этот метод может быть использован для создания высоко ослабленных штаммов P. aeruginosa для производства коммерческих продуктов или для разработки штаммов для других конкретных целей. Мы также описываем простую и воспроизводимую модель мыши бактериальной системной инфекции с помощью интраперитонеальной инъекции проверенных тестовых штаммов для проверки затухания генно-инженерного штамма по сравнению с одобренным FDA штаммом BL21 e. coli.

Как показано на рисунке 2, целевое геномное удаление может быть подтверждено с помощью колонии ПЦР с конкретными грунтовки, которые усиливают область интереса. Колонии, которые несут геномное удаление даст более короткий размер полосы ПЦР по сравнению...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Здесь мы описываем простой и воспроизводимый протокол мышиной модели инфекции для оценки затухания генетически модифицированных штаммов Pseudomonas aeruginosa по сравнению с Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) утвержденных Escherichia coli для коммерческого применения.

Поколение in-Frame Джин Удаление мутантов в Pseudomonas aeruginosa и тестирование на викроменность затмения в простой модели мыши инфекции

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Этот протокол имеет важное значение для создания и определения разума и тела желаемых мутаций в геноме Pseudomonas aeruginosa, а также для тестирования влияния мутаций на снижение вирулентности в воспроизводимой модели мыши. Ключевым преимуществом этого метода является хром проверки и воспроизводимость мышиной модели инфекции. Бактерии постоянно работают, постоянно меняются.Чтобы замедлить этот процесс, мы используем замороженные остановки, мешок их, повесить их на несколько ступеней на модификации перед тестированием их в модели мыши. Кто-то, кто не знаком с этими методами, скорее всего, будет бороться с разработкой и выбором возможного рекомбинанта кроссовера для тестирования. Кроме того, обработка мышей для инфекции будет трудно для тех, кто не знаком с работой животных.Этот метод может быть применен для тестирования других патогенов и их мутантов, а также вирулентности заразить мышей. По сравнению с текущими моделями, процедуры с воспроизводимостью плюс проверка клонов до и после заражения могут принести пользу другим следователям в этой области. Визуальная демонстрация этого протокола дает представление о обширных процедурах, которые может быть трудно понять или понять, читая в одиночку.Начните с выращивания одного кроссовера, рекомбинантных колоний в Pseudomonas Isolation Broth, или PIB. Прививка и полоса 10 микролитров каждой культуры на предварительно разогретые пластины PIA, дополненные 10% сахарозой. Затем инкубировать пластины на ночь при 37 градусов по Цельсию.На следующий день снимите пластины с инкубатора и осмотрите их на рост. Колония, устойчивая к сахарозе, должна быть двойным кроссовером рекомбинантов. Используйте стерильные зубочистки, чтобы залатать по крайней мере 20 колоний на предварительно разогретых пластин PIA, PIA дополнен 10% сахарозы, и PIA дополнен карбенициллин.Инкубировать пластины на ночь и изучить их на рост на следующий день. Настоящие двойные рекомбинанты кроссовера будут карбенициллин-чувствительными и сахарозными. Экран от 10 до 20 колоний для удаления, с использованием колонии ПЦР.Подберите рост предполагаемого двойного кроссовера рекомбинантным со стерильной зубочисткой и приостановите его в 50 микролитров PBS. Отварить суспензию при 100 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Центрифуга в течение трех минут при 13 000 раз G и поместите его на лед.Затем выполните ПЦР в соответствии с рукописными указаниями. Как только ПЦР закончен, выполните электрофорез агарозного геля на продуктах. Меньшие продукты усиления указывают на колонии, в которых регион, представляющий интерес, был удален.Утром инъекций, оттепель криовиалы бактериальных клеток при четырех градусах по Цельсию в течение трех-четырех часов. Держите флаконы на льду после оттаивания и вводить мышей в течение двух часов. Перенесите содержимое каждого криовиалового в новую двухмилитровую трубку и центрифуга в 4500 раз G в течение 10 минут.Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы клетки в один миллилитр PBS. Повторите центрифугирование и повторно приостанавливайте клетки в PBS до конечной концентрации в 2,5 раза от 10 до девятой колонии, образуя единицы на миллилитр. Возьмите три образца из окончательной суспензии каждого штамма для проверки концентрации, генотипа и фенотипа.Для каждого штамма, aliquot 1,5 миллилитров клеточной подвески в две миллилитровые трубки и подготовить PBS для контроля инъекций. Соберите мышей и материалы, необходимые для инъекций в стерильной комнате хирургии животных и протрите все поверхности с дезинфицирующими салфетками до начала. Носите две пары латексных перчаток, чтобы ограничить риск прокола, если укусил, а также лабораторное пальто, защитные очки и маску для лица.Удалите мышь из клетки и взвесить ее, отмечая хвост постоянным маркером для отслеживания после инъекций. Откройте новый одноми миллилитровый шприц с иглой 27 калибра и нарисуйте 200 микролитров стерильных PBS. Захватите мышь за уши, используя большой палец и указательный палец, и щепотку, чтобы создать складку кожи на затылке.Затем закрените хвост в ладонь, используя мизинец, чтобы держать мышь плоской и неподвижной. Вставьте иглу под углом 30 градусов в брюшную полость слева или справа от средней линии. Слегка поднимите иглу, чтобы убедиться, что она не была вставлена в органы.Затем медленно ввиснуть PBS и снять иглу. Болус в месте инъекции является типичным. Поместите иглу в назначенный контейнер для удаления остроты и переместите мышь в отдельную клетку.Повторите процедуру со следующей мышью и в конце концов мышей из одной клетки вводят, переместить их обратно в свою первоначальную клетку. После введения контрольной группы ввимите тестовые группы с использованием той же процедуры. Как только все инъекции будут завершены, верните мышей в жилищную комнату и очистите рабочую зону с помощью дезинфицирующих салфеток.Для изображения животных подготовьтесь к системе визуализации, установив параметры камеры и нагревая сцену. Установите поток кислорода до 1,5 литра в минуту и изофлюран до 3,5% и переместите мышь в анестезиа, затем в стадию стабилизации температуры, после анестезии. Распоимите мышь на спине с вытянутыми руками и подготовьте носовой конус для администрирования 2,5%изофлюрана во время визуализации.Закройте дверь и сделайте биолюминесцентные изображения и рентгеновские снимки мыши. Когда изображение будет завершено, верните мышь в клетку и следите за ней. Он должен восстановить сознание в течение трех-пяти минут.Целевые геномные удаления были подтверждены колонией ПЦР с конкретными грунтовки, которые усилили область интереса. Колонии с геномное удаление дают более короткую полосу ПЦР по сравнению с колониями дикого типа. Внутриперитонеальная инъекция атенуированного штамма P aeruginosa, PGN 5, привела к 0%-ной смертности, эквивалентной смертности, наблюдаемой с E.coli BL 21.Инъекция родительского штамма, однако, была смертельной для 80% мышей. Прогрессирование инфекции отслеживалось с помощью биолюминесценции, отмеченной родительскими и затуханием штаммов. Затухающий штамм оставался локализованным в месте инъекции до тех пор, пока биолюминесценция не исчезла, что, вероятно, совпало с очисткой инфекции.Представленный метод только исследовал смертность, производимую штаммом. Более глубокие иммунологические и токсикологические аспекты могут быть использованы для определения динамики инфекции и конечного эффекта инфекции, который не приводит к смерти. Самое главное в процедуре является обширная проверка сделано, между различными шагами от первоначальной идентификации на животных тестирования.Отсутствующие определенные шаги проверки потенциально могут привести к неправильному результату, так как проверенные штаммы могут пройти мутацию и отбор, или стать загрязненными. С развитием этих двух методов, мы думаем, что это позволит нашим исследователям в области инфекционной иммунологии более эффективно исследовать, как мощное взаимодействие пакетов приводит к экстремальному фенотипу, сепсису и смертности. Различные питательные'impact на варианты можно сравнить через размер досирования бактерий.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Синегнойной палочки и Saccharomyces CEREVISIAE биопленки в Проточные ячейки

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В условиях более актуальными для кистозного фиброза легких

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Долгосрочная Хронический<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; Дыхательных инфекции у мышей

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Синегнойная палочка Индуцированные легких травм Модель

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Изучение микробных сообществ<em&gt; В Vivo</em&gt;: Модель узла опосредованного взаимодействия между<em&gt; Candida Albicans</em&gt; И<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Простой и эффективный подход к Construct Mutant осповакцины вирусного вектора

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Приходите в сторону света: В Vivo мониторинг Pseudomonas aeruginosa биопленки инфекций, хронических ран в диабетической голые мышиных модели

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Репликация Ordered, неизбыточной библиотека штамма PA14 Transposon вставки мутантов синегнойной палочки

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Оценки вирулентности и патогенез Aeromonas инфекции в Caenorhabditis elegans модели

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Задержка прививки Модель хронической Pseudomonas aeruginosa раневой инфекции

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...