Name: generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection
Uploaded: 2020-01-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag R44GM113545 och P20GM103434.

Innan djurförsök inleds måste det protokoll som skall användas godkännas av den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén (IACUC). Godkännandet för det beskrivna protokollet erhölls genom IACUC vid Marshall University (Huntington, WV, USA).
1. plasmid design
<ol><li>För att generera en genetisk radering med hjälp av pEX100T-registrering plasmid, klona regionerna i DNA fladta önskad radering sekvens och infoga i den registrering av plasmid. Plasmid-insatsen bör inne...

<ol>
	<li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li><li>Valentine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+highly+attenuated+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+commercial+production+of+alginate.">Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate.</a> Microbial Biotechnology. , (2019).</li><li>Schweizer, H. P., Hoang, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+system+for+gene+replacement+and+xylE+fusion+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa.">An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Gene. 158 (1), 15-22 (1995).</li><li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis.">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).</li><li>Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+lacking+the+extreme-stress+sigma+factor+AlgU+(sigmaE).">Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE).</a> Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).</li><li>Baeshen, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Biopharmaceuticals+in+E.+coli:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).</li><li>Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+industrial+Escherichia+coli+strains+in+fed-batch+cultivations+during+high-level+SOD+protein+production.">Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production.</a> Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).</li><li>Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+factories+for+recombinant+pharmaceuticals.">Microbial factories for recombinant pharmaceuticals.</a> Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans.">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10-min+method+for+preparation+of+highly+electrocompetent+Pseudomonas+aeruginosa+cells:+application+for+DNA+fragment+transfer+between+chromosomes+and+plasmid+transformation.">A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation.</a> Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).</li><li>Liang, R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scarless+and+sequential+gene+modification+in+Pseudomonas+using+PCR+product+flanked+by+short+homology+regions.">Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions.</a> BMC Microbiology. 10, 209 (2010).</li><li>Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+multiple+genomic+deletions+in+Gram-negative+bacteria:+analysis+of+the+multi-resistant+antibiotic+profile+of+Pseudomonas+putida+KT2440.">Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).</li><li>Song, C. W., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+inactivation+of+single+or+multiple+genes+in+Escherichia+coli.">Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli.</a> Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).</li><li>Yan, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a-Assisted+Recombineering+in+Bacteria.">CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).</li><li>Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+and+prospects+of+microbial+preservation.">Practice and prospects of microbial preservation.</a> FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).</li></ol>

Den pEX100T-Not1 plasmid är en effektiv medlare av sekventiella genomiska borttagningar som är markör-fri och i-Frame. När tekniska bakteriestammar för försvagad virulens, borttagande av hela gensekvenser snarare än att generera punktmutationer minskar sannolikheten för återgång till en virulent fenotyp. Dessutom dämpar varje patogenicitet gen borttagning patogenen ytterligare, vilket förstärker stabiliteten i försvagningen.
Denna metod kan också användas för att generera geno...

Pseudomonas aeruginosa är en opportunistisk bakteriell patogen som kan orsaka livshotande sjukdomar hos människor, särskilt i den immunsupprimerade. Patogenicitet av P. aeruginosa beror på uttrycket av många virulensfaktorer, inklusive proteaser och lipopolysackarid, samt dess förmåga att bilda en skyddande biofilm1. På grund av dess förmåga att producera virulensfaktorer och orsaka sjukdom hos människor, med hjälp av P. aeruginosa att göra kommersiella produkter presenterar säkerhetsproblem. Icke-patogena stammar av E. coli har traditionellt använts för att bioengineer medicinska och kommersiella produkter för humant bruk. Emellertid, vissa produkter är svåra för E. coli att göra, och många är förpackade i inkludering organ, vilket gör utvinning mödosam. Konstruerade bakteriestammar med förmågan att göra och utsöndra specifika produkter är mycket önskvärt, som sekretion skulle sannolikt öka avkastningen och lindra reningsprocesser. Sålunda, icke-patogena stammar av andra arter av bakterier (t. ex. arter som utnyttjar mer sekretion vägar) kan ge användbara alternativ till e. coli. Vi rapporterade nyligen utvecklingen av en stam av P. aeruginosa, PGN5, där patogenitet och toxicitet av organismen är mycket försvagade2. Viktigare, denna stam producerar fortfarande stora mängder av polysackarid alginate, en kommersiellt intressant del av P. aeruginosa biofilm.
Den PGN5 stammen genererades med hjälp av en två-stegs alleliska utbyte förfarande med pEX100T-e plasmid att sekventiellt ta bort fem gener (toxa, plch, phzm, wapr, Aroa) kända för att bidra till patogeniteten av organismen. pEX100T-är en produkt som genereras genom att ändra Smai till en för att erkänna en sida av enzymet erkännande av multipel kloning av plasmid pEX100T, som utvecklades i Herbert schweizers labb3,4. Erkännande platsen för restriktionsenzymen är en ovanligare DNA-sekvens jämfört med SmaI och mindre sannolikt att vara närvarande i sekvenser som klonas, vilket gör det bekvämare för kloning. Plasmiden bär gener som möjliggör val, inklusive bla genen, som kodar ß-Lactamase och ger resistens mot carbenicillin, och B. subtilissacB genen, som ger känslighet för sackaros (figur 1A). Plasmid bär också ett ursprung av replikering (Ori) kompatibel med E. coli, och ett ursprung av överföring (Orit) som möjliggör plasmid överföring från E. coli till Pseudomonas arter via konjugering. Emellertid, plasmiden saknar ett ursprung av replikering förenligt med Pseudomonas, och därmed inte kan replikera inom Pseudomonas arter (dvs., det är en Pseudomonas självmord vektor). Dessa egenskaper gör pEX100T-en idealisk för att rikta genetiska borttagningar från Pseudomonas -kromosomen. Plasmid kloning steg utförs med hjälp av E. coli och den resulterande plasmid överförs till Pseudomonas genom omvandling eller konjugering. Sedan, genom homolog rekombination händelser och selektiva steg, den riktade in-Frame radering genereras, markör-fri. Denna metod för sekventiellt ta bort genomiska regioner från kromosomen av P. aeruginosa kan användas för att generera mycket försvagade Pseudomonas stammar, som PGN5, eller att utforma stammar för andra specifika användningsområden (t. ex., stammar bristfällig i endonukleaser för plasmid förökning eller stammar brist på proteaser för produktion av proteiner av intresse).
Den totala virulens stammar av bakterier påverkas av tillväxtförhållanden och faser, under vilka mutationer förekommer ofta. Därför kan det vara utmanande att mäta säkerheten hos genetiskt modifierade stammar. För att utvärdera bakteriella isolat för systemisk virulens, anpassade vi ett tidigare publicerat protokoll för infektion genom intraperitoneal injektion av C57BL/6 möss5. Vi modifierade detta förfarande för att använda frysta bakteriella lager för injektion, som tillät exakt dosering och enkel validering av de stammar som används. I denna modell, E. coli stam BL21, som har FDA-godkänt för produktion av Biopharmaceuticals, användes som en kontroll säkerhetsstandard för att bestämma den relativa patogenesen av stammen6,7,8. Den största fördelen med att använda denna metod är att det är reproducerbara och minimerar källor till variation, som infekterande stammar valideras för bakteriell cell nummer, fenotyp, och genetiska markörer både före och efter infektion. Med dessa kontrollerade steg minskar antalet djur som krävs. I denna modell, P. aeruginosa stammar som resulterar i C57BL/6 murin dödlighet priser lika med eller mindre än E. coli BL21 när injiceras intraperitonealt kan anses vara försvagade. Denna enkla musmodell av infektion kan också användas för att bedöma den försvagade patogenicitet av genetiskt modifierade stammar från andra arter med hjälp av FDA-godkända E. coli stam som referens. Steg 1-7 detalj generering av sekventiella genomiska borttagningar i p. aeruginosa (figur 1) och steg 8-12 detalj användning av en musmodell för att testa patogenicitet av p. aeruginosa stammar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes with flat caps</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable polystyrene cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-821-13B</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>04-987-372</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Microcentrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>75-003-287</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tube, Polystyrene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12224-50</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>D6493-01</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>NC0492929</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastLink II DNA Ligation Kit</td>
			<td>Epicentre Technologies</td>
			<td>LK6201H</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Colorless Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7833</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>3120-500</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noble agar, ultrapure</td>
			<td>Affymetris/USB</td>
			<td>AAJ10907A1</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404052</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank">https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation broth</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>Custom made batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 4080</td>
			<td>shake at 200 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0032-17-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Plates (100 O.D. x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks, round</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand of toothpicks, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>45-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anesthesia System Filters</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>118999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI 8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>Caliper Life Sciences/Xenogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection

Mikroorganismer är genetiskt mångsidig och varierande och har blivit en viktig källa till många kommersiella produkter och Biopharmaceuticals. Även om vissa av dessa produkter produceras naturligt av organismer, andra produkter kräver genteknik av organismen att öka avkastningen av produktionen. Avirulent stammar av Escherichia coli har traditionellt varit den föredragna Bakteriearten för att framställa biologiska läkemedel; emellertid, vissa produkter är svåra för E. coli att producera. Således kan Avirulenta stammar av andra bakteriearter ge användbara alternativ för produktion av vissa kommersiella produkter. Pseudomonas aeruginosa är en vanlig och väl studerat gramnegativ bakterie som kan ge ett lämpligt alternativ till E. coli. Emellertid, P. aeruginosa är en opportunistisk mänsklig patogen. Här, vi detalj en procedur som kan användas för att generera nonpatogena stammar av P. aeruginosa genom sekventiella genomiska borttagningar med hjälp av pEX100T- Den största fördelen med denna metod är att producera en markör-fri stam. Denna metod kan användas för att generera mycket försvagade P. aeruginosa -stammar för produktion av kommersiella produkter, eller för att konstruera stammar för andra specifika användningar. Vi beskriver också en enkel och reproducerbar musmodell av bakteriell systemisk infektion via intraperitoneal injektion av validerade test stammar för att testa försvagningen av den genetiskt modifierade stammen i jämförelse med FDA-godkända BL21 stam av E. coli.

Som framgår i figur 2, kan den riktade genomisk radering bekräftas med hjälp av Colony PCR med specifika primers som förstärker regionen av intresse. Kolonier som bär en genomisk radering kommer att ge en kortare PCR-bandstorlek jämfört med vildtyps-kolonier. En PCR-avskärma av 10-12 kolonier är vanligt tillräcklig för att upptäcka åtminstone en koloni som bär den riktade borttagningen. Om inga borttagningar upptäcks efter flera omgångar av s...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Här beskriver vi ett enkelt och reproducerbart protokoll av musmodell av infektion för att utvärdera försvagningen av den genetiskt modifierade stammar av Pseudomonas aeruginosa i jämförelse med USA Food and Drug Administration (FDA)-godkända Escherichia coli för kommersiella tillämpningar.

Generering av in-Frame gen radering mutanter i Pseudomonas aeruginosa och testning för virulens dämpning i en enkel musmodell av infektion

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Detta protokoll är betydande för att skapa och bestämma kropp-själ önskade mutationer i arvsmassan av Pseudomonas aeruginosa, liksom testning effekten av mutationer på virulens minskning i en reproducerbar mus modell. Den viktigaste fördelen med denna teknik är en krom validering och en reproducerbarhet av mus infektion modell. Bakterier arbetar ständigt, ständigt förändras.För att sakta ner denna process använder vi en frusen stannar, väska dem, hänga dem på flera stegpinnar på modifiering innan du testar dem i musmodellen. Någon obekant med dessa metoder kommer sannolikt att kämpa med utveckling och urval av möjliga crossover rekombinant för att testa. Dessutom kommer hanteringen av mössen för infektion att vara svår för någon som inte känner till djurarbete.Denna metod kan tillämpas för att testa andra patogener och deras mutanter, samt virulens infektera hos möss. Jämfört med nuvarande modeller, förfaranden med reproducerbarhet plus klon validering före och efter infektion kan gynna andra utredare i området. Visuell demonstration av detta protokoll ger insikt till omfattande procedurer som kan vara svåra att förstå eller förstå genom att läsa ensam.Börja med att odla single crossover, rekombinanta kolonier i Pseudomonas Isolation Broth, eller PIB. Inokulera och strimma 10 mikroliter av varje kultur på förvuppvade PIA plattor, kompletterat med 10%sackaros. Sedan inkubera plattorna över natten vid 37 grader Celsius.På nästa dag, ta bort plattorna från inkubatorn och inspektera dem för tillväxt. Den sackaros resistenta kolonin ska vara dubbel crossover rekombinanter. Använd sterila tandpetare för att plåstra minst 20 kolonier på förvörda plattor av PIA, PIA kompletterad med 10%sackaros, och PIA kompletterat med karbaticillin.Inkubera plattorna över natten och undersöka dem för tillväxt på nästa dag. True dubbel crossover rekombinanter kommer att vara carbenicillin-känsliga och sackaros-resistenta. Skärm 10 till 20 kolonier för deletion, med hjälp av koloni PCR.Plocka upp tillväxten av en misstänkt dubbel crossover rekombinant med en steril tandpetare och suspendera den i 50 mikroliter pbs. Koka upphängningen vid 100 grader Celsius i 10 minuter. Centrifugera den i tre minuter vid 13, 000 gånger G och placera den på is.Sedan, utföra PCR enligt manuskriptet riktningar. När PCR är klar, utför Agarose gel elektrofores på produkterna. Mindre amplifieringsprodukter anger kolonier där den intresseregion har strukits.På morgonen av injektioner, tina cryovials av bakterieceller vid fyra grader Celsius i tre till fyra timmar. Håll injektionsflaskan på is efter upptining och injicera mössen inom två timmar. Överför innehållet i varje cryovial till en ny två milliliter rör och centrifug det på 4, 500 gånger G i 10 minuter.Kassera supernatanten och dra upp cellpelleten på ett milliliter på åter i en milliliter pbs. Upprepa centrifugeringen och åter upphäva cellerna i PBS till en slutkoncentration på 2,5 gånger 10 till nionde kolonin som bildar enheter per milliliter. Ta tre prover från den slutliga suspensionen av varje stam för att validera koncentration, genotyp, och fenotyp.För varje stam, alikvot 1,5 milliliter av cellupphängningen i ett två milliliterrör och bereda PBS för kontrollinjektioner. Samla de möss och material som behövs för injektioner i ett sterilt djurkirurgiskt rum och torka alla ytor med saniterande våtservetter före start. Använd två par latexhandskar för att begränsa risken för punktering, om den blir biten, samt en labbrock, skyddsglasögon och ansiktsmask.Ta bort musen från buren och väg den, märkning svansen med permanent markör för efter injektion spårning. Öppna en ny milliliterspruta med en 27 gauge nål och dra upp 200 mikroliter av steril PBS. Ta tag i musen bakom öronen, med hjälp av tummen och pekfingret, och nyp för att skapa en hudveck vid nacken.Sedan, säkra svansen i handflatan med hjälp av pinky att hålla musen platt och orörlig. Stick in nålen i 30 graders vinkel i peritonealhålan till vänster eller höger om mittlinjen. Lyft på något nålen för att säkerställa att den inte sattes in i organ.Injicera sedan långsamt PBS och dra tillbaka nålen. En bolus vid injektionsstället är typisk. Placera nålen i den avsedda behållaren för vassa kassering och flytta musen till en separat bur.Upprepa proceduren med nästa mus och efter alla möss från en bur injiceras, flytta dem tillbaka till sin ursprungliga bur. Injicera testgrupperna med samma procedur efter att ha injicerat kontrollgruppen. När alla injektioner är klara, returnera mössen till bostadsrummet och rengör arbetsområdet med sanitizing våtservetter.För att avbilda djuren, förbereda bildsystemet genom att ställa in kamerans parametrar och värma scenen. Ställ in syreflödet till 1,5 liter per minut och isofluran till 3,5%och flytta musen till anestesikammaren, sedan till temperaturen stabiliserats skede, efter anestesi. Placera musen på ryggen med utsträckta armar och montera en noskon för administrering av 2,5%isofluran under bildtagning.Stäng dörren och ta bioluminescerande bilder och röntgenbilder av musen. När avbildningen är klar, returnera musen till sin bur och övervaka den. Det bör återfå medvetandet inom tre till fem minuter.De riktade genomiska borttagningar bekräftades av kolonin PCR med specifika primers som förstärkt regionen av intresse. Kolonier med den genomiska borttagningen ger ett kortare PCR-band jämfört med vilda typkolonier. Intraperitoneal injektion av den försvagade stammen av P aeruginosa, PGN fem, resulterade i 0%dödlighet, motsvarande dödlighet som observerats med E.coli BL 21.Injektion av moderstammen var dock dödlig till 80%av mössen. Infektion progression spårades med hjälp av bioluminescens-märkt förälder och försvagade stammar. Den försvagade stammen förblev lokaliserad vid injektionsstället tills bioluminescens bleknat, vilket sannolikt sammanföll med clearance av infektion.Den metod som presenterades undersökte endast den dödlighet som stammen producerar. Mer djupgående immunologiska och toxikologiska aspekter skulle kunna utnyttjas för att bestämma dynamiken i infektion och slutet effekt infektionen har som inte resulterar i döden. Det viktigaste i förfarandet är den omfattande validering som görs, mellan olika steg från första identifiering till djurförsök.Att missa vissa valideringssteg kan potentiellt leda till fel resultat, eftersom de testade stammarna kan genomgå mutation och urval, eller bli förorenade. Med utvecklingen av dessa två tekniker, tror vi att detta kommer att göra det möjligt för våra forskare inom infektionsimmunologi att mer effektivt undersöka hur kraftfull paketinteraktion leder till den extrema fenotyp, sepsis och dödlighet. Olika näringsämnen'påverkan på varianter kan jämföras genom storleksdering av bakterier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa och Saccharomyces cerevisiae biofilm i Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Användning av artificiell Sputum Medium för att testa antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I villkor som är mer relevanta för cystisk fibros Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Långsiktig Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway infektion hos möss

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studera Microbial gemenskaperna<em&gt; In Vivo</em&gt;: En modell av Host-medierad interaktion mellan<em&gt; Candida albicans</em&gt; Och<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel och effektiv strategi för att konstruera Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Komma till den ljus sidan: In Vivo övervakning av Pseudomonas aeruginosa Biofilm infektioner i kroniska sår i en diabetiker hårlösa murina modell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikering av beställt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon införande mutanter

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Utvärderande virulens och patogenesen av Aeromonas infektion i Caenorhabditis elegans modell

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

En fördröjd inokulering modell av kronisk pseudomonas aeruginosa Sår infektion

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...