Name: experimental approach to examine leptin signaling in the carotid bodies and its effects on control of breathing
Uploaded: 2019-10-25T13:30:00
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R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025

すべての実験プロトコルは、制度的動物ケアと使用委員会(MO18M211)によって承認されています。
1. レプチン注入
注:呼吸に対するレプチンの影響を調べるために、浸透ポンプによって赤身C57BL/6Jマウスに皮下にレプチンを注入し、肥満マウスで観察されるものに循環レプチンレベルを上げた。
<ol><li>
浸透ポンプの準備
	<ol>
<li...

<ol>
	<li>O'donnell, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+prevents+respiratory+depression+in+obesity.">Leptin prevents respiratory depression in obesity.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).</li><li>Polotsky, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+gender+exacerbates+respiratory+depression+in+leptin-deficient+obesity.">Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).</li><li>Bassi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+leptin+replacement+enhances+chemorespiratory+responses+in+leptin-deficient+mice+independent+of+changes+in+body+weight.">Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight.</a> Pflu&#776;gers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).</li><li>Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+respiratory+activity+of+leptin+at+the+level+of+the+solitary+tract+nucleus.">Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).</li><li>Considine, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+immunoreactive-leptin+concentrations+in+normal-weight+and+obese+humans.">Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans.</a> New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).</li><li>Maffei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+levels+in+human+and+rodent:+measurement+of+plasma+leptin+and+ob+RNA+in+obese+and+weight-reduced+subjects.">Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects.</a> Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).</li><li>Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+leptin+with+hypoventilation+in+human+obesity.">Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity.</a> Thorax. 57, 75-76 (2002).</li><li>Berger, S., Polotsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+Leptin+Resistance+in+the+Pathogenesis+of+Obstructive+Sleep+Apnea:+A+Possible+Link+to+Oxidative+Stress+and+Cardiovascular+Complications.">Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947 (2018).</li><li>Ribeiro, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+blunts+the+effects+of+leptin+on+ventilation+and+on+carotid+body+activity.">High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity.</a> The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).</li><li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+signaling+in+the+carotid+body+regulates+a+hypoxic+ventilatory+response+through+altering+TASK+channel+expression.">Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression.</a> Frontiers in Physiology. 9, 249 (2018).</li><li>Caballero-Eraso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+acts+in+the+carotid+bodies+to+increase+minute+ventilation+during+wakefulness+and+sleep+and+augment+the+hypoxic+ventilatory+response.">Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response.</a> The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).</li><li>Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoneutrality+modifies+the+impact+of+hypoxia+on+lipid+metabolism.">Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).</li><li>Polotsky, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+interrupted+leptin+pathways+on+ventilatory+control.">Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control.</a> Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).</li><li>Pho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+leptin+replacement+on+sleep-disordered+breathing+in+the+leptin-deficient+ob/ob+mouse.">The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse.</a> Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).</li><li>Hernandez, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+whole+body+plethysmography+system+for+the+continuous+characterization+of+sleep+and+breathing+in+a+mouse.">Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse.</a> Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).</li><li>Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+domains+of+the+hypoxic+ventilatory+response.">Time domains of the hypoxic ventilatory response.</a> Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).</li><li>Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+barometric+method+for+measuring+ventilation+in+newborn+infants.">A barometric method for measuring ventilation in newborn infants.</a> Pediatrics. 16, 81-87 (1955).</li><li>Duffin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+ventilatory+response+to+hypoxia.">Measuring the ventilatory response to hypoxia.</a> The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).</li><li>Teppema, L. J., Dahan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ventilatory+Response+to+Hypoxia+in+Mammals:+Mechanisms,+Measurement,+and+Analysis.">The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis.</a> Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).</li><li>Nurse, C. A., Fearon, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+body+chemoreceptors+in+dissociated+cell+culture.">Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture.</a> Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).</li><li>Kumar, P., Prabhakar, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+chemoreceptors:+function+and+plasticity+of+the+carotid+body.">Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body.</a> Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).</li><li>Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventilatory+and+central+neurochemical+reorganisation+of+O2+chemoreflex+after+carotid+sinus+nerve+transection+in+rat.">Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat.</a> The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).</li></ol>

我々の研究の主な焦点は、CBにおけるレプチンシグナル伝達の呼吸効果を調べることであった。いくつかのプロトコルは、機械的な方法でレプチンの役割を評価するために開発されています。まず、HVRに対するCBの特異的寄与は、低酸素暴露の最初の2分の間にHVRの慎重な定量によって分析された。第二に、呼吸制御のレプチン媒介性アップレギュレーションにおけるCBの関連性を、2つの相補?...

脂肪細胞産生ホルモンレプチンは、食物摂取を抑制し、代謝率を増加させるために視床下部で作用する。私たちの研究室1、2および他の研究者3、4で行われた研究は、レプチンがレプチンの肥満低換気を予防する高カプニック換気応答(HVR)を増加させることを示した不足している肥満。しかし、肥満者の大半は、高い血漿レプチンレベルを有し、ホルモン5、6、7、8の代謝および呼吸効果に対する耐性を示す。レプチンに対する耐性は多因子であるが、レプチンに対する血液脳関門(BBB)の透過性は限られているが、大きな役割を果たす。我々は、レプチンが末梢低酸素感受性の重要な器官である頸動脈体(CB)でBBB以下に作用し、肥満個体の呼吸を防御することを提案する。CBはレプチン受容体の長い機能的アイソフォームを発現し、LepRb、レプチンの呼吸効果におけるCBの役割は十分に解明されていない9、10である。
我々の方法の目的は、HVRに対するCBにおけるレプチンシグナル伝達の影響を調べることであった。私たちの根拠は、(a)無傷の頸動脈体と変性頸動脈体を持つマウスにレプチンを注入する機能実験の喪失を行い、その後HVR測定を行うことでした。(b) LepRbを欠くdb/dbマウスにおける関数実験のゲインは、CBのみでLepRbのベースラインおよび発現後にHVRを測定した。私たちの技術の利点は、睡眠と覚醒中に拘束されていない無麻酔を受けたマウスですべての実験を行ったことです。以前の研究者は、麻酔9の下で実験を行ったか、睡眠中のレプチンの効果を測定しなかった10.さらに、我々の研究は、上述したCBにおける選択的LepRb発現を用いる機能アプローチのユニークな利益を利用した最初の研究である。
広い文脈において、我々のアプローチは、CBで発現される他の受容体と低酸素感受性におけるその役割に一般化することができる。研究者は、目的の受容体にリガンドを注入し、ベースラインおよびCB脱窒後にHVRを測定することができる。補完的なアプローチとして、関心のある受容体はCBで過剰発現することができ、HVR測定は、この原稿に記載されている当社の技術を使用して過剰発現の前後に行うことができる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-Lacz</td>
			<td>Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago)</td>
			<td></td>
			<td>1x1010 pfu/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-LepRb-GFP</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>ADV-263380</td>
			<td>2-5x1010 pfu/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic cart</td>
			<td>Atlantic Biomedical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue Products Ltd.</td>
			<td>12496-0757-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Buprenex)</td>
			<td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td>
			<td>12496-0757-5</td>
			<td>0.3mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6J</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Mice Strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Gauze Sponges</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-362-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>db/db</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>000697</td>
			<td>Mice Strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Vetone</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Chart</td>
			<td>Data Science International (DSI)</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spring Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Ox Plus</td>
			<td>STARR Life Sciences Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Ox Plus Collar Sensor</td>
			<td>STARR Life Sciences Corp.</td>
			<td>015022-2</td>
			<td>Medium Collar Clip Special 7&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Whole Body Plethysmography Chamber</td>
			<td>Data Science International (DSI)</td>
			<td>PLY3211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohio Care Plus Incubator</td>
			<td>Ohmeda</td>
			<td>HCHD000173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>501753-G</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic Pump</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>1003D</td>
			<td>1ul per hour, 3 days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Leptin protein</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>498-OB-05M</td>
			<td>5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>RICCA Chemical</td>
			<td>7210-16</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Suture</td>
			<td>DemeTech</td>
			<td>DT-639-1</td>
			<td>Silk, size 6-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Innovative Calibration Solutions (INNOCAL)</td>
			<td>EW 20250-91</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental approach to examine leptin signaling in the carotid bodies and its effects on control of breathing

脂肪細胞産生ホルモンレプチンは強力な呼吸刺激剤であり、肥満における呼吸機能を防御する上で重要な役割を果たす可能性がある。末梢低酸素感受性の主要な器官である頸動脈体(CB)は、レプチン受容体(LepRb)の長い機能的同位体を発現するが、呼吸制御におけるレプチンシグナル伝達の役割は完全には解明されていない。ベースラインおよびCB脱窒後のレプチン注入前後のC57BL/6Jマウスにおける低酸素換気応答(HVR)(1)を調べた。(2)LepRb -ベースラインおよびLepRb過剰発現後の欠損肥満db/dbマウスにおけるCB。C57BL/6Jマウスでは、レプチンはHVRを増加させ、レプチンがHVRに及ぼす影響は、CB脱窒によって廃止された。db/dbマウスにおいて、CBにおけるLepRb発現はHVRを増強した。したがって、レプチンは、低酸素症に対する応答を増強するためにCBで作用すると結論付ける。

レプチンの連続的な注入は、リーンC57BL/6JマウスのHVRを0.23mL/分/g/ΔFiO2に有意に増加させた(P< 0.001、図2)11.CSNDはHVRのレプチン誘発増加を廃止した(図2)が、レプチン注入後のシャム手術群ではHVRに対するCSNDの減衰作用は認められなかった。
LepRbの CB における LepRb発現は、欠?...

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Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

我々の研究は、頸動脈体内のレプチンシグナル伝達が低酸素換気応答(HVR)に及ぼす影響に焦点を当てている。CB脱窒後のHVRに対するレプチンの効果を測定する「機能喪失」実験と、CBにおけるレプチン受容体の過剰発現後のHVRを測定する「機能のゲイン」実験を行った。

頸動脈体におけるレプチンシグナル伝達と呼吸制御への影響を調べる実験的アプローチ

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...

我々のプロトコルは、末梢ケモレフ呼吸制御における頸動脈の身体に対するレプチンの呼吸効果および低酸素症に対する生理学的応答を調べるために使用することができる。また、外科的および化学的な脱用とアデノウイルストランスフェクションを使用して、頸動脈の身体機能の喪失と利益の影響を評価することもできます。手順を開始する前に、カスタムメイド全身プラステマグロフィーチャンバー内の温度を測定し、実験室の相対湿度を測定します。次に、実験用マウスの体重および直腸温度を測定する。マウスをチャンバーの中に置き、動物の剃った首の周りにオキシメーターカラーを置きます。そして、完全に空気漏れを避けるためにチャンバーを密封してください。マウスが静かでチャンバーが一定の音量になるまで約30分待ちます。ノルモキシアで呼吸信号と末梢酸素飽和度を記録し始める前に.ノルモキシアの20分後、動物を10%酸素と3%の二酸化炭素の一定の混合ガス流に曝します。そして、呼吸信号と末梢酸素飽和における急性低酸素症の最初のサイクルの記録を開始します。低酸素症の最初の30秒間、チャンバーの基部にある2つの小さな側面ポートを開き、混合ガスのプラグインを可能にします。最初の30秒後、チャンバーの小さな側のポートの1つを閉じ、5分間、インスピレーションを受けた酸素の分率の10%で一定の低酸素状態で記録し続けます。低酸素症治療の終わりに、インフローソースを切り替えてマウスを室内の空気に再び露出させ、動物がノルモキシアで少なくとも30分間回復してから次の分析を開始します。実験の最後に、シリンジをチャンバーの基部にある小さな側ポートの1つに差し込み、1ミリリットルの室内空気を全血プレチスモグラフィーチャンバーに3回注入してチャンバーを較正する。3回目のフラッシュの後、動物がまだ中にあり、チャンバーがまだ閉じている状態でチャンバー内の温度を測定します。次に、チャンバーを開き、動物を自宅のケージに戻す前に、マウスの直腸温度を測定します。頸動脈洞神経の外科的脱毛のために、麻酔マウスに鎮痛を投与し、首の腹側領域で毛髪を除去する。露出した皮膚をベタジンとアルコールで消毒し、動物の目に軟膏を塗布する。中線切開を行った後、結合組織と脂肪組織を取り除き、一般的な頸動脈の分岐を露出させ、舌下神経を同定する。舌下神経を持ち上げてすぐ下の舌咽頭神経を露出させ、マイクロスプリングハサミを使って頸動脈洞神経を二国間で解剖する。頸動脈体が露出したら、適切なアデノウイルスの1マイクロリットルを氷上の4マイクロリットルの液体マトリゲルマトリックスにそっと懸濁し、ウイルス懸濁液の5マイクロリットルを頸動脈体領域に両側に塗布する。液体マトリゲルマトリックスが固まるまで2〜3分待ってから、6-0シルク縫合糸で切開を閉じ、皮下に正常な生理食塩水を1ミリリットル投与する。その後、動物を自宅のケージに戻す前に、胸骨の債務まで監視して回復室にマウスを収容します。レプチンの連続注入は、赤身C57BL/6マウスにおける低酸素換気応答を有意に増加させ、頚動脈洞神経解剖はこのレプチン誘発増加を廃止する。予想通り、レプチン注入後の恥手術群では、低酸素換気反応に対する頸動脈洞神経解離の減衰効果は認められない。レプチン受容体の長いイソフォームの体におけるレプチン受容体の長いイソフォーム発現の誘導は、肥満db/dbマウスの酸素欠損性の低下の結果、低酸素換気応答の有意な増加をもたらす。一方、コントロールLacZアデノウイルスでトランスフェクションした後、変化は認められない。これらの技術は、末梢ケモレフにおける頸動脈体の役割と呼吸制御における頸動脈体へのレプチンの影響を分析することを可能にする。

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