Name: cochlear surface preparation in the adult mouse
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

وكان المشروع البحثي الموصوف مدعوما بمنحه R01 DC009222 من المعهد الوطني لامراض الصمم وغيرها من اضطرابات الاتصالات ، والمعاهد الوطنية للصحة. وقد اجري هذا العمل في مبني WR في MUSC في المساحة التي تم تجديدها بدعم من منحه C06 RR014516. تم إسكان الماشية في مرافق الحيوانية MUSC CRI بدعم من منحه C06 RR015455 من برنامج مرافق البحوث خارج الأورال للمركز الوطني للموارد البحثية. ويشكر المؤلفون الدكتور جوتشين شاخت علي تعليقاته القيمة وعلي اندرا تالاسكا لتصحيح المخطوطات.

تمت الموافقة علي جميع البروتوكولات البحثية التي تنطوي علي الذكور الكبار CBA/J الفئران في سن 10-12 أسابيع و C57BL/6J الفئران في سن 6 – 8 أسابيع من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) في الجامعة الطبية في ولاية كارولينا الجنوبية (MUSC). وكانت رعاية الماشية تحت اشراف شعبه الموارد الحيوان...

<ol>
	<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li><li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss.">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion.">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li><li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK.">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss.">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress.">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses.">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo.">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li><li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+neural+degeneration+with+aging,+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear.">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms.">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 7, 2063 (2016).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Engstr&#246;m, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection.">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).</li><li>. MassEyeAndEar.org Available from: <a target="_blank" href="https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories">https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories</a> (2019)</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea.">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>. Corning Cell Culture Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf</a> (2019)</li><li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li><li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+anatomy+of+the+'hook'+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation.">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li><li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing.">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li><li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death.">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1262 (2014).</li><li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea.">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).</li></ol>

يوفر التشريح المجهري لقوقعة الاذن من المستحضرات السطحية كامله التركيب بالاشتراك مع المناعة المناعية أداه أساسيه لتحقيق الامراض الداخلية للاذن واليات الجزيئية. هذه الطريقة المعدلة لتشريح قوقعة الفاره باستخدام الخلية ولاصق الانسجه يبسط هذا الاجراء الصعب.
علي الرغم من ان ه...

وتكرس القوقعة للكشف عن الصوت والمسؤولة عن السمع. يتم لف القناة القوقعة في شكل حلزوني في المتاهة العظمية ويحمل الجهاز السمعي الحسي النهاية ، وجهاز كورتي (OC). يعتمد OC علي غشاء بأزيار ، مما يشكل ظهاره قوقعة ، مع طول حوالي 5.7 ملم عندما غير ملفوف في الفئران CBA/caj الكبار1،2. ونظرا لان درجه التردد العالي التي يتم تنظيمها بالترددات المرتفعة المكتشفة في القاعدة والترددات المنخفضة في القمه ، فان ظهاره القوقعة غالبا ما تنقسم إلى ثلاثه أجزاء للمقارنة التحليلية: المنعطفات المتوسطة والقاعدية المقابلة لمنخفضه ، المتوسطة ، والكشف عن الترددات العالية ، علي التوالي. بالاضافه إلى مجموعه من الخلايا الداعمة ، تتكون OC من صف واحد من خلايا الشعر الداخلية (IHCs) الموجودة في الوسيط وثلاثه صفوف من خلايا الشعر الخارجية (OHCs) الموجودة بشكل أفقي فيما يتعلق بدوامه القوقعة.
المعالجة السمعية الصحيحة تعتمد علي سلامه خلايا الشعر الحسية في القوقعة. تلف أو فقدان خلايا الشعر الحسية هو سمه مرضيه شائعه لفقدان السمع المكتسبة ، الناجمة عن العديد من المسببات مثل التعرض للضوضاء المفرطة ، واستخدام الادويه السامة للاذن ، والتهابات الاذن البكتيرية أو الفيروسية ، وإصابات الراس ، والشيخوخة عمليه3. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن ان تضعف سلامه ووظيفة الخلية الداخلية للشعر/العصب السمعي العصبية بالإهانات الخفيفة4. مع توافر المعلومات الجزيئية والوراثية والتلاعب في الجينات بالضربة القاضية وتقنيات الطرق ، وقد استخدمت الفئران علي نطاق واسع في السمع العلم. علي الرغم من ان قوقعة الماوس الكبار هي ضئيله وتحيط ظهاره القوقعة بكبسوله عظميه مما يؤدي إلى الأجزاء المجهرية الصعبة من الناحية الفنية ، والاستعدادات السطحية لظهاره في تركيبه مع المناعة أو مناعي وقد استخدمت الصور المحورية علي نطاق واسع للتحقيق في امراض القوقعة ، بما في ذلك فقدان الشريط العصبي وخلايا الشعر ، والتغيرات في مستويات البروتينات في خلايا الشعر الحسية وخلايا الدعم ، وتجديد خلايا الشعر. كما تم استخدام مستحضرات سطح القوقعة لتحديد نمط التعبير عن جينات المراسلين (اي GFP) وتاكيد التوصيل الناجح وتحديد أنواع الخلايا المحولة. وقداستخدمت هذه التقنيات في السابق لدراسة أليات الجزيئية الكامنة وراء فقدان السمع الناجم عن الضوضاء باستخدام الفئران CBA/J الكبار5,6,7,8,9.
خلافا لمناعي باستخدام أقسام البارافين أو الحلوى للحصول علي أجزاء صغيره مقطعه عبر القوقعة التي تحتوي علي ثلاثه خلايا الشعر الخارجي (OHCs) وخليه واحده الشعر الداخلي (IHC) علي كل قسم ، والاستعدادات سطح القوقعة تسمح التصور من طول OC للعد خلايا الشعر الحسية والمشابك الشريط والمناعة من خلايا الشعر الحسية المقابلة للترددات وظيفية محدده. ويبين الجدول 1 رسم الترددات السمعية كداله للمسافة علي طول دوامه القوقعة في الماوس البالغ CBA/J وفقا للدراسات التي أجريت من مولر1 وفيبرغ وكانلون1،2. وقد استخدمت علي نطاق واسع الاستعدادات سطح قوقعة للتحقيق في امراض القوقعة4،5،6،7،8،9،10 ،11،12،13،14،15. تم وصف الطريقة الكاملة لتشريح القوقعة في كتاب حرره هانز انجستروم في 196616. وتم صقل هذه التقنية فيما بعد وتكييفها مع مجموعه متنوعة من الأنواع علي النحو الموصوف في الأدبيات التي كتبها عدد من العلماء في العلوم السمعية10و11و12و13و 15,17 وبواسطة مختبرات ايتون-peabody في ماساتشوستس العين والاذن18. وفي الاونه الاخيره ، أبلغت شركه مونتغمري وآخرون19عن طريقه أخرى لتشريح القوقعة. يعد التشريح المجهري لقوقعة الزرع خطوه أساسيه وحاسمه لتحضيرات سطح القوقعة. ومع ذلك ، فان تشريح قوقعة الماوس يمثل تحديا فنيا ويتطلب ممارسه كبيره. هنا ، يتم تقديم طريقه معدله لتحضير سطح القوقعة للاستخدام في قوقعة الماوس البالغة. هذا الأسلوب يتطلب الكلس واستخدام لاصقه الخلية والانسجه (اي ، خليه تاك) للتقيد قطع ظهاره قوقعة الراس إلى 10 ملم الشفتين المستديرة للمناعة. وقد استخدمت علي نطاق واسع الخلية والانسجه لاصقه لمناعي20. هذه الطريقة المعدلة لتشريح القوقعة المجهرية بسيطه نسبيا مقارنه بتلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-mm Rund Coverslips</td>
			<td>Microscopy products for science and industry</td>
			<td>260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboard Micro Slide Trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST fine science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-gel with Tris Buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-myosin VIIa Antibody</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CtBP2 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Glu2R Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100491-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cochlear surface preparation in the adult mouse

المعالجة السمعية في القوقعة تعتمد علي سلامه خلايا الشعر الميكانيكية. علي مدي العمر ، يمكن الحصول علي فقدان السمع من مسببات عديده مثل التعرض للضوضاء المفرطة ، واستخدام الادويه السامة للاذن ، والتهابات الاذن البكتيرية أو الفيروسية ، وإصابات الراس ، وعمليه الشيخوخة. فقدان خلايا الشعر الحسية هو سمه مرضيه شائعه من أنواع فقدان السمع المكتسبة. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن ان تتلف المشبك الداخلي لخلايا الشعر بالإهانات الخفيفة. لذلك ، تعد الاستعدادات السطحية لظهاره قوقعة الاذن ، بالاشتراك مع تقنيات المناعة والتصوير البؤري ، أداه مفيده جدا للتحقيق في امراض القوقعة ، بما في ذلك فقدان المشابك الشريطية وخلايا الشعر الحسية ، التغيرات في مستويات البروتين في خلايا الشعر والخلايا الداعمة ، وتجديد خلايا الشعر ، وتحديد التعبير الجيني للتقرير (اي GFP) للتحقق من التوصيل الناجح وتحديد أنواع الخلايا المحولة. والقوقعة ، وهي بنيه عظميه حلزونية الشكل في الاذن الداخلية ، تحمل جهاز النهاية الحسية السمعية ، وهو جهاز كورتي (OC). يتم تضمين خلايا الشعر الحسية والخلايا الداعمة المحيطة بها في قناه القوقعة والباقي علي الغشاء القاعدي ، والتي يتم تنظيمها بطريقه اللوزتين مع الكشف عن الترددات العالية التي تحدث في القاعدة والتردد المنخفض في القمه. مع توافر المعلومات الجزيئية والوراثية والقدرة علي التلاعب بالجينات بواسطة الضربة القاضية وتقنيات الطرق ، وقد استخدمت الفئران علي نطاق واسع في البحوث البيولوجية ، بما في ذلك في السمع العلم. ومع ذلك ، فان قوقعة الماوس البالغة ضئيله ، ويتم تغليف ظهاره القوقعة في متاهة عظميه ، مما يجعل التشريح المجهري صعبا. علي الرغم من انه تم تطوير تقنيات التشريح واستخدامها في العديد من المختبرات ، فان طريقه التشريح المجهري المعدلة باستخدام لاصق الخلايا والانسجه أسهل وأكثر ملاءمة. ويمكن استخدامه في جميع أنواع قوقعة الماوس الكبار بعد الكلس.

وقد استخدمت الاستعدادات السطحية لظهاره القوقعة ، بالاشتراك مع التصوير المناعي والتصويري البؤري ، علي نطاق واسع في علم السمع للتحقيق في امراض القوقعة ، مثل القياس الكمي لمشابك الشريط العصبي ، وخلايا الشعر الحسية ، والبروتين التعبير في خلايا الشعر الحسية5،6...

Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

تقدم هذه المقالة طريقه تعديل سطح القوقعة التي تتطلب الكلس واستخدام لاصقه الخلية والانسجه للالتزام قطع من ظهاره قوقعة الراس إلى 10 مم زلة غطاء الجولة لمناعي في قوقعة الماوس الكبار.

اعداد سطح القوقعة في فاره الكبار

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

الاستعدادات سطح القوقعة تسمح التصور للعدسة بأكملها من الجهاز من الكورتي باستخدام الكيمياء المناعية والتصوير confocal. وقد استخدمت على نطاق واسع للتحقيق في أمراض قوقعة معينة من الفائدة. سنقوم بتعديل طريقة microdissection القوقعة.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الالتزام بقطعة من ظهارة قوقعة 10 ملليمترات مستديرة لـ 10 ملليمترات من أجل إجراء التميّز المناعي مع تجنب فقدان الأنسجة أثناء خطوات الغسيل المتعددة. بالإضافة إلى أمراض القوقعة ، يمكن أيضًا استخدام إعداد سطح القوقعة للتعبير التقييمي وتجديد خلايا الشعر. مطلوب مهارات المجهر الأساسية لهذه التقنية ، ويمكن أن تساعد على إظهار البصرية للأسلوب لضمان أن يتم تنفيذ كل خطوة بشكل صحيح.إثبات الإجراء سيكون تشياوجون فانغ، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. لاستخراج العظام الصدغية، على الفور بعد الوفاة سحب الجلد في وقت ما للكشف عن عظم الجمجمة واستخدام مقص لقطع العظام من الجانب الخلفي إلى الأمام على طول خط وسط الجمجمة. استخدم ملقط لإزالة أنسجة المخ قبل استخدام الإبهام وإصبع السبابة لإزالة العظام الصدغية يدويًا من الفئران التي يبلغ عمرها ثلاثة أشهر أو أكثر.ضع العظام في طبق بيتري قطره 30 ملليمترًا يحتوي على الثلج البارد الطازج بنسبة 4٪ PFA و PBS تحت مجهر تشريح وإزالة الستابس من النافذة البيضاوية. ثقب غشاء النافذة المستديرة مع عدد خمسة ملقط واستخدام إبرة قياس 27 تعلق على حقنة ملليلتر واحدة تحتوي على 4٪ PFA جديدة لجعل ثقب صغير في قمة القوقعة. بلطف وببطء افسد القوقعة بحل تثبيتي عبر النوافذ المستديرة والبيضاوية حتى يغسل المحلل من الثقب الصغير عند القمة.ثم نقل ما يصل إلى اثنين من قوقعة الأذن إلى قنينات تلة 20 ملليلتر فردية تحتوي على 10 ملليلترات من 4٪ PFA لكل قارورة وتهيج العينات بلطف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، تليها التخزين بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية على دوار. في صباح اليوم التالي، اغسل القوقعة بثلاث يغسل لمدة خمس دقائق مع PBS الطازجة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، إضافة 20 ملليلتر من 4٪ EDTA لكل قارورة وتدوير العينات لمدة 48 ساعة في أربع درجات مئوية مع التحريض لطيف.في نهاية الحضانة ، المس الجزء الدهليزي العظمي لكل قوقعة مع ملقط لتقييم مرونة العينات. إذا كانت العظام مرنة بدلا من شركة، وقد تم decalcified القوقعة. استبدل EDTA لكل عينة بـ PBS جديد.بالنسبة للميكروفيسكشن للظهارة القوقعة، فهم الجزء الدهليزي من العظم الصدغي مع ملقط واستخدام مشرط لخفض بدوره apical في زاوية 45 درجة. قطع عموديا على طول الخط الخافت بين النافذة المستديرة والنافذة البيضاوية لفصل القوقعة من الجزء الدهليزي وتوجيه جزء القوقعة مع بدوره القاعي نحو أسفل ووسط يتحول نحو الجزء العلوي من طبق بيتري. من هذا الموقف، وقطع الكبسولة العظمية والجدار الجانبي من منتصف بدوره نحو النهاية التي تمت إزالة القسم apical ومواصلة القطع لفصل تماما الجزء الأوسط من المناطق القاعدية وخطاف.وضع الجزء القاعدي والخطاف مع موقع غشاء basilar الموجهة نحو الجزء السفلي من الطبق، وقطع عموديا من medialis من منطقة هوك لإزالة الوسيطات وقطع المناطق القاعدية وربط لفصل جزء هوك. لتجنب تشويه الأنسجة ، وقطع الوسيطات قبالة منطقة هوك قبل الفصل من منعطف القاعدي ومنطقة هوك. قطع بعيدا أجزاء كبيرة نسبيا من كبسولة عظمية والأنسجة الجدار الجانبي من منتصف بدوره وعقد الجدار الجانبي مع ملقط لمحاذاة كبسولة عظمية والجدار الجانبي مع الجزء السفلي من طبق بيتري، وقطع هذه الأنسجة من جانب غشاء باسيلار.المقبل، تسطيح العينة لتوجيه الجانب الجانب خلية الشعر الحسية سطح لأعلى وتقليم بعيدا بقية كبسولة عظمية والجدار الجانبي. ثم استخدام ملقط لإزالة غشاء tectorial لفصل تماما في المنطقة الوسطى وإزالة كبسولة عظمية، نسيج الجدار الجانبي، والمناطق tectorial من المنعطفات المتبقية كما أظهرت للتو. عندما تم تشريح جميع المنعطفات القوقعة ، انتشار 0.5 ميكرولترات من الخلايا والأنسجة لاصقة على مركز جولة واحدة 10 ملليمتر يغطي والسماح لللصق لتجف لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.ضع الأغطية المجففة في طبق بيتري والصق جميع القطع الأربع لكل عينة ظهارة حسية على غطاء واحد. ثم استخدام ملقط لفهم حافة واحدة من كل غطاء لنقل العينات إلى آبار فردية من طبق ثقافة الخلايا أربع جيدا للمناعة. بالنسبة للمناعة من الاستعدادات المشبكة للسطح، اغسل كل ظهارة حسية ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني جديد لكل غسيل، يليها علاج كل عينة بمليلترين من 2٪ من السطح غير الأيونيك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على دوار.في نهاية الحضانة، pirate حل السطحي من كل بئر ومنع أي ربط غير محددة مع 100 ميكرولترات من محلول حجب في بئر لمدة ساعة واحدة على الدوار مع التحريض لطيف في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة منع، وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح تحت التحريض لطيف قبل وضع علامة على كل ظهارة مع 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية من الفائدة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية محمية من الضوء. في اليوم التالي، وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني جديد والتحريض لطيف في غسل وتسمية العينات مع 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة من الفائدة لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية محمية من الضوء.في نهاية الحضانة، وغسل العينات مع ثلاثة يغسل لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني الطازجة في غسل قبل وضع كل غطاء على الشرائح المجهر الزجاجي الفردية مع العينات التي تواجه ما يصل. المقبل، إضافة بعناية ثمانية ميكرولترات من المتوسطة المناسبة تصاعد في وسط كل غطاء واستخدام ملقط لتركيب آخر 10 ملليمتر coverslip على كل عينة. ثم ختم الجانبين من كل شطيرة غطاء مع طلاء الأظافر واضحة، ووضع العينات في مجلد شريحة من الورق المقوى، وتخزين الشرائح في أربع درجات مئوية.على الرغم من أن تشريح قوقعة الأذن الماوس الكبار للتحضيرات السطحية ليست بسيطة ، وينبغي أن يكون الباحثون الجدد لهذه التقنية قادرين على تعلم الطريقة بعد ممارسة مع 10 إلى 15 آذان. يبين تحديد المناعة للمستحضرات السطحية لفئران CBAJ غير المعالجة من 10 إلى 12 أسبوعًا مع CTBP2 وGluA2 أن كلاً من شرائط presynaptic والمحطات الطرفية بعد المينابتيكية على التوالي تقع تحت نواة خلايا الشعر الداخلية ويتم تجاورها مما يشير إلى نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية. كشف التميّز المناعي لميوسين 7A ومواجهة الحساسية مع phalloidin وDAPI عن وجود خلايا شعر حسية بما في ذلك خلايا الشعر الخارجية وخلايا الشعر الداخلية والنوى الخاصة بها.لا يظهر علم المناعة لميوسين 7A ومضادة مع phalloidin أي اختلافات في النشاط المناعي أو التوحيد مع أو بدون استخدام الخلايا والأنسجة لاصقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المسح المجهري للإلكترون من الاستعدادات السطحية من ستة إلى ثمانية أسابيع من العمر C57 الأسود 6 الفئران تظهر جيدة التنظيم على شكل V stereocilia من خلايا الشعر الخارجي في ثلاثة صفوف من العينة. تذكر أن تملأ القوقعة بمحلول تثبيتي بلطف وببطء من خلال النوافذ المستديرة والبيضاوية حتى يغسل الحل من الحفرة الصغيرة عند القمة.قبل فصل منطقة هوك من منعطف القاعدية، والحرص على قطع ميدياليس قبالة منطقة هوك لتسهيل إزالة medialis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

تحضير الأنسجة وImmunostaining من الألياف العصبية الحسية ماوس التعصيب الجلد والعظام الاطراف

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية في شرائح الدماغ الأمامي الحاد للماوس الكبار

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

على<em&gt; في المختبر</em&gt; إعداد الخلايا العصبية المعوية المعزولة والدبقية من الضفيرة العضلية المعوية من الماوس الكبار

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

و<em&gt; في المختبر</em&gt; ماوس الكبار إعداد العضلات العصبية لدراسة خصائص اطلاق Afferents العضلات

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير من الفأر القوقعة إإكسبلنتس

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

إعداد الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية من الكبار ماوس النخاع الشوكي الأنسجة

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

إعداد شرائح أفقية من الكبار شبكية العين الفأر للدراسات الكهربية

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

التحقيق إكسون الثدييات التجديد: في فيفو انهانسر من العقدة الجذر الظهرية الماوس الكبار

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...