Name: cochlear surface preparation in the adult mouse
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

Het beschreven onderzoeksproject werd gesteund door Grant R01 DC009222 van het Nationaal Instituut voor doofheid en andere communicatiestoornissen, National Institutes of Health. Dit werk werd uitgevoerd in het WR-gebouw bij MUSC in een gerenoveerde ruimte ondersteund door Grant C06 RR014516. Dieren werden gehuisvest in MUSC CRI dier faciliteiten ondersteund door Grant C06 RR015455 van het Extramural Research facilities Program van het National Center for Research resources. De auteurs danken Dr. Jochen schacht voor zijn waardevolle commentaren en Andra Talaska voor het naleden van het manuscript.

Alle onderzoeksprotocollen met betrekking tot mannelijke volwassen CBA/J muizen op de leeftijden van 10 – 12 weken en C57BL/6J muizen op de leeftijd van 6 – 8 weken werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de medische universiteit van South Carolina (MUSC). Animal Care stond onder toezicht van de scheiding van laboratorium dierlijk materiaal bij MUSC.
Opmerking: Voor de onderstaande procedures worden muizen verdomiliseerd met ke...

<ol>
	<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li><li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss.">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion.">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li><li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK.">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss.">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress.">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses.">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo.">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li><li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+neural+degeneration+with+aging,+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear.">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms.">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 7, 2063 (2016).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Engstr&#246;m, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection.">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).</li><li>. MassEyeAndEar.org Available from: <a target="_blank" href="https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories">https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories</a> (2019)</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea.">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>. Corning Cell Culture Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf</a> (2019)</li><li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li><li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+anatomy+of+the+'hook'+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation.">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li><li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing.">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li><li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death.">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1262 (2014).</li><li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea.">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).</li></ol>

Cochleaire microdissectie van complete-Mount oppervlakte preparaten in combinatie met immunolabeling biedt een fundamenteel hulpmiddel voor onderzoek naar pathologieën van het binnenoor en moleculaire mechanismen. Deze gemodificeerde volwassen muis cochleaire dissectie methode met behulp van de cel en weefsellijm vereenvoudigt deze moeilijke procedure.
Hoewel deze aangepaste bereidingsmethode voor cochleaire oppervlakken relatief eenvoudig en toegankelijk is, is er nog steeds praktijk nodig o...

De slakkenhuis is gewijd aan het opsporen van geluid en verantwoordelijk voor het horen. Het cochleaire kanaal wordt in een spiraalvorm in het Bony labyrint gewikkeld en houdt het auditieve sensorische eind orgaan, het orgaan van Corti (OC). De OC berust op het basilaire membraan, waaruit het cochleaire epitheel bestaat, met een lengte van ongeveer 5,7 mm wanneer het niet is opgerold bij volwassen CBA/CAJ muizen1,2. Omdat de OC tonotopisch georganiseerd is met hoge frequenties gedetecteerd in de basis en lage frequenties in de Apex, wordt het cochleaire epitheel vaak onderverdeeld in drie delen voor analytische vergelijkingen: de apicale, middelste en basale bochten die corresponderen met laag, middelste en hoogfrequente detectie. Naast een reeks ondersteunende cellen, bestaat de OC uit een rij binnenste haarcellen (Ihc's) die zich mediaal en drie rijen buitenste haarcellen (Ohc's) bevinden, die zich lateraal bevinden ten opzichte van de cochleaire spiraal.
De juiste auditieve verwerking is afhankelijk van de integriteit van de sensorische haarcellen in de cochlea. Beschadiging of verlies van sensorische haarcellen is een veel voorkomend pathologisch kenmerk van verworven gehoorverlies, veroorzaakt door tal van etiologieën zoals blootstelling aan overmatig lawaai, het gebruik van ototoxische medicatie, bacteriële of virale oorontstekingen, hoofdletsel en de veroudering proces3. Bovendien kan de integriteit en functie van de binnenste haar cel/auditieve zenuw synapsen worden aangetast door milde insulten4. Met de beschikbaarheid van moleculaire en genetische informatie en manipulatie van genen door knockout en knock-in technieken, zijn muizen op grote schaal gebruikt in de hoorwetenschap. Hoewel de volwassen muis slakkenhuis minuscule is en het cochleaire epitheel is omgeven door een Bony capsule, wat resulteert in technisch moeilijke micro dissecties, oppervlakte preparaten van het epitheel in combinatie met immunolabeling of immunohistochemie en confocale beelden zijn breed gebruikt voor onderzoek naar cochleaire pathologieën, met inbegrip van verliezen van lint synapsen en haarcellen, veranderingen in de niveaus van eiwitten in sensorische haarcellen en ondersteunende cellen, en haar celregeneratie. Er zijn ook cochleaire oppervlakte preparaten gebruikt om het patroon van de expressie van reporter genen (d.w.z. GFP) te bepalen en succesvolle transductie te bevestigen en getransduceerde celtypen te identificeren. Deze technieken zijn eerder gebruikt voor de studie van moleculaire mechanismen onderliggend gehoorverlies met behulp van volwassen CBA/J muizen5,6,7,8,9.
In tegenstelling tot immunohistochemie die paraffine secties of cryosecties gebruikt om kleine transversale delen van het slakken hoofd te verkrijgen die drie buitenste haarcellen (Ohc's) en één binnenste Haarcel (IHC) op elke sectie bevatten, kunnen cochleaire oppervlakte preparaten visualisatie van de volledige lengte van de OC voor het tellen van sensorische haarcellen en lint synapsen en immunolabeling van sensorische haarcellen overeenkomend met specifieke functionele frequenties. Tabel 1 toont de toewijzing van hoorfrequenties als een functie van afstand over de lengte van de cochleaire spiraal in volwassen CBA/J-muis volgens studies van Muller1 en Viberg en canlon1,2. Cochleaire oppervlakte preparaten worden op grote schaal gebruikt voor onderzoek naar cochleaire pathologieën4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. De Whole-Mount cochleaire dissectie methode werd oorspronkelijk beschreven in een boek bewerkt door Hans Engstrom in 196616. Deze techniek werd vervolgens verfijnd en aangepast aan een verscheidenheid aan soorten zoals beschreven in de literatuur door een aantal wetenschappers in de hoorwetenschappen10,11,12,13, 15,17 en door de Eaton-Peabody Laboratories bij Massachusetts Eye en ear18. Onlangs werd een andere cochleaire dissectie-methode gerapporteerd door Montgomery et al.19. Micro dissectie van de slakkenhuis is een essentiële en kritieke stap voor cochleaire oppervlakte preparaten. Het ontleden van de muis cochleae is echter een technische uitdaging en vereist een aanzienlijke praktijk. Hier wordt een gemodificeerde cochleaire oppervlakte bereidingsmethode gepresenteerd voor gebruik in volwassen muis cochleae. Deze methode vereist de decalcificatie en het gebruik van cel-en weefsellijm (d.w.z. cel-tak) om de stukjes cochleair epitheel te hechten aan 10 mm ronde dekstroken voor immunolabeling. Cel en weefsellijm is op grote schaal gebruikt voor immunohistochemie20. Deze gemodificeerde cochleaire microdissection-methode is relatief eenvoudig in vergelijking met de eerder gerapporteerde18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-mm Rund Coverslips</td>
			<td>Microscopy products for science and industry</td>
			<td>260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboard Micro Slide Trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST fine science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-gel with Tris Buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-myosin VIIa Antibody</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CtBP2 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Glu2R Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100491-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cochlear surface preparation in the adult mouse

Auditieve verwerking in de slakkenhuis hangt af van de integriteit van de mechanosensorische haarcellen. Gedurende een leven kan gehoorverlies worden verkregen uit tal van etiologie, zoals blootstelling aan overmatig lawaai, het gebruik van ototoxische medicatie, bacteriële of virale oorontstekingen, hoofd blessures en het verouderingsproces. Verlies van sensorische haarcellen is een veel voorkomend pathologisch kenmerk van de variëteiten van verworven gehoorverlies. Bovendien kan de binnenste Haarcel Synapse worden beschadigd door milde beledigingen. Daarom zijn oppervlakte preparaten van cochleaire epithei, in combinatie met immunolabeling-technieken en confocale beelden, een zeer nuttig hulpmiddel voor het onderzoek naar cochleaire pathologieën, inclusief het verlies van lint synapsen en sensorische haarcellen, veranderingen in de eiwit spiegels in haarcellen en ondersteunende cellen, haarcelregeneratie en de bepaling van de genexpressie van het rapport (d.w.z. GFP) voor de verificatie van succesvolle transductie en identificatie van getransduceerde celtypen. De cochlea, een Bony spiraalvormige structuur in het binnenoor, houdt het auditieve sensorische eind orgaan, het orgaan van Corti (OC). Sensorische haarcellen en omringende ondersteunende cellen in de OC zijn opgenomen in het cochleair kanaal en rusten op het basilaire membraan, georganiseerd in een tonotopische mode met hoogfrequente detectie die optreedt in de basis en lage frequentie in de Apex. Met de beschikbaarheid van moleculaire en genetische informatie en de mogelijkheid om genen te manipuleren door knockout en knock-in technieken, zijn muizen op grote schaal gebruikt in biologisch onderzoek, inclusief in de hoorwetenschap. Echter, de volwassen muis slakkenhuis is miniscule, en het cochleaire epitheel is ingekapseld in een Bony labyrint, waardoor micro dissectie moeilijk. Hoewel dissectie technieken zijn ontwikkeld en gebruikt in vele laboratoria, deze gemodificeerde microdissection methode met behulp van cel en weefsellijm is gemakkelijker en handiger. Het kan worden gebruikt in alle soorten volwassen muis cochleae na decalcificatie.

Oppervlakte preparaten van het cochleaire epitheel, in combinatie met immunolabeling en confocale beeldvorming, zijn algemeen gebruikt in de hoorwetenschappen voor het onderzoek naar cochleaire pathologieën, zoals kwantificering van lint synapsen, sensorische haarcellen, en eiwit expressie in sensorische haarcellen5,6,7,8. Hoewel de dissectie van volwassen muis cochleae voor oppervlakte prepar...

Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Dit artikel presenteert een gemodificeerde cochleaire oppervlakte bereidingsmethode die de decalcificatie en het gebruik van een cel en weefsellijm vereist om de stukjes cochleaire epitheel te hechten aan 10 mm ronde afdek stroken voor immunohistochemie in volwassen muis cochleae.

Cochleaire oppervlakte voorbereiding in de volwassen muis

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Cochleaire oppervlaktepreparaten maken visualisatie van de gehele lens van het orgaan van Corti mogelijk met behulp van immunohistochemie en confocale beeldvorming. Het is in grote lijnen gebruikt voor onderzoek naar specifieke cochleaire pathologieën van belang. We zullen de cochleaire microdissectionmethode aanpassen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de aanhankelijkheid van een stuk cochleair epitheel tot 10 millimeter ronde covers voor de immunolabeling procedure, terwijl het vermijden van weefselverlies tijdens de meerdere wasstappen. Daarnaast kunnen cochleaire pathologieën, cochleaire oppervlaktevoorbereiding, ook worden gebruikt voor de beoordelingsexpressie en haarcelregeneratie. Basismicroscoop vaardigheden zijn nodig voor deze techniek en visuele demonstratie van de methode kan helpen om ervoor te zorgen dat elke stap correct wordt uitgevoerd.Het aantonen van de procedure zal Qiaojun Fang zijn, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Voor temporele botextractie, onmiddellijk post-mortem trek de huid anteriorly om het schedelbot bloot te stellen en gebruik schaar om het bot te snijden van het achterste aspect naar voren langs de middellijn van de schedel. Gebruik tangen om het hersenweefsel te verwijderen voordat u de duim en wijsvinger gebruikt om de temporele botten van muizen van drie maanden of ouder handmatig te verwijderen.Plaats de botten in een petrischaal met een diameter van 30 millimeter met verse ijskoude 4%PFA en PBS onder een dissectiemicroscoop en verwijder de stapes uit het ovale venster. Prik het ronde raammembraan met nummer vijf tangen en gebruik een 27-meter naald aan een spuit van één milliliter met verse 4%PFA om een klein gaatje in de top van het slakkenvlies te maken. Doorsnee het slakkenvlies voorzichtig en langzaam met een fixatieve oplossing via de ronde en ovale ramen totdat de oplossing uit het kleine gaatje aan de top is gewasserd.Breng vervolgens maximaal twee geperfundeerde slakkenhuis over in individuele 20 milliliter scintillatiefolie met 10 milliliter van 4%PFA per flacon en roer de monsters voorzichtig gedurende twee uur bij kamertemperatuur, gevolgd door 's nachts opslag bij vier graden Celsius op een rotator. De volgende ochtend was je het slakkenkastje met drie wasbeurten van vijf minuten met verse PBS per wasbeurt. Voeg na de laatste wasbeurt 20 milliliter van 4%EDTA toe aan elke flacon en draai de monsters 48 uur bij vier graden Celsius met zachte agitatie.Raak aan het einde van de incubatie het benige vestibulaire gedeelte van elk slakkenkeltje aan met tangen om de elasticiteit van de monsters te beoordelen. Als de botten elastisch zijn in plaats van stevig, is het slakkenbeen ontkalkt. Vervang de EDTA voor elk monster door verse PBS.Voor microdissection van het cochleaire epitheel, pak het vestibulaire gedeelte van het temporele bot met tangen en gebruik een scalpel om de apicale draai in een hoek van 45 graden te snijden. Snijd verticaal langs de zwakke lijn tussen het ronde raam en het ovale venster om het slakkenvlies te scheiden van het vestibulaire gedeelte en oriënteer het cochleair gedeelte met de basale draai naar de bodem en het midden draait naar de bovenkant van de petrischaal. Snijd vanuit deze positie de benige capsule en de zijwand van de middenboel naar het einde van waaruit de apicale sectie werd verwijderd en blijf snijden om het middelste gedeelte volledig te scheiden van de basale en haakgebieden.Het plaatsen van de basale en haak gedeelte met de basilaire membraan site gericht op de bodem van de schotel, verticaal snijd de medialis af van de haak regio om de medialis te verwijderen en snijd de basale en haak regio's om de haak gedeelte te scheiden. Om vervorming van het weefsel te voorkomen, snijd de medialis af van het haakgebied voor de scheiding van de basale draai en haak regio. Snijd de relatief grote delen van benige capsule en laterale wandweefsel van de middelste draai en het houden van de laterale muur met tangen om de benige capsule en laterale wand uit te lijnen met de onderkant van de petrischaal, snijd deze weefsels van de basilaire membraan kant.Vervolgens plat het monster te oriënteren van de zintuiglijke haarcel oppervlak kant omhoog en trim weg de rest van de benige capsule en laterale muur. Gebruik vervolgens tangen om het tectorialmembraan te verwijderen om het middelste gebied volledig te scheiden en de benige capsule, lateraal wandweefsel en tectoriale gebieden van de resterende bochten te verwijderen, zoals zojuist is aangetoond. Wanneer alle cochleaire bochten zijn ontleed, verspreid 0,5 microliter cel- en weefselkleven op het midden van een ronde 10 millimeter coverslip en laat de lijm drie tot vijf minuten drogen bij kamertemperatuur.Plaats de gedroogde coverslips in de petrischaal en plak alle vier de stukken van elk zintuiglijk epitheelmonster op één coverslip. Gebruik vervolgens tangen om één rand van elke coverslip te grijpen om de exemplaren over te brengen in individuele putten van een celkweekschotel met vier putten voor immunotikken. Voor immunotikettering van oppervlaktecochleaire synapspreparaten wast u elk zintuiglijk epitheel drie maal gedurende vijf minuten in verse PBS per wasbeurt, gevolgd door de behandeling van elk monster met twee milliliter van 2%niet-ionische oppervlakteactieve stoffen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rotator.Aan het einde van de incubatie, aspiraat de oppervlakteactieve oplossing van elke put en blok elke niet-specifieke binding met 100 microliter van het blokkeren oplossing per goed gedurende een uur op de rotator met zachte agitatie bij kamertemperatuur. Aan het einde van de blokkerende incubatie, was de monsters drie keer met PBS zoals aangetoond onder zachte agitatie voordat het etiketteren van elk epitheel met 100 microliters van de primaire antilichamen van belang gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius beschermd tegen licht. De volgende dag, was de monsters drie keer met verse PBS en zachte agitatie per was en etiket de monsters met 100 microliter van de juiste secundaire antilichamen van belang voor twee uur op 37 graden Celsius beschermd tegen licht.Aan het einde van de incubatie, was de monsters met drie vijf minuten wasbeurten in verse PBS per wasbeurt voordat u elke coverslip op individuele glazen microscoop dia's met de monsters naar boven. Voeg vervolgens zorgvuldig acht microliters van een geschikt montagemedium toe in het midden van elke coverslip en gebruik tangen om nog eens 10 millimeter coverslip op elk monster te monteren. Sluit vervolgens de zijkanten van elke coverslip sandwich met duidelijke nagellak, plaats de monsters in een kartonnen dia map, en bewaar de dia's op vier graden Celsius.Hoewel de dissectie van volwassen muisbrochleer voor oppervlaktepreparaten niet eenvoudig is, zouden onderzoekers die nieuw zijn bij de techniek de methode moeten kunnen leren na het oefenen met 10 tot 15 oren. Immunolabeling van oppervlaktepreparaten van onbehandelde 10 tot 12 weken oude CBAJ-muizen met CTBP2 en GluA2 toont aan dat respectievelijk presynaptische linten en postsynaptische terminals zich onder de binnenhaarcelkernen bevinden en naast elkaar staan met functionele synapsen aan. Immunolabeling voor myosine 7A en contrastaining met falloidin en DAPI onthult de aanwezigheid van sensorische haarcellen, waaronder de buitenste haarcellen en binnenhaarcellen en hun kernen.Immunolabeling voor myosine 7A en contrastaining met falloidine toont geen verschillen in immunoreactiviteit of uniformiteit met of zonder het gebruik van cel- en weefselkleef. Bovendien tonen scanning elektronenmicroscopie van oppervlaktepreparaten van onbehandelde zes- tot acht weken oude C57-zwarte 6-muizen een goed georganiseerde V-vormige stereocilia van buitenste haarcellen in drie rijen van het monster. Vergeet niet om het cochleair te vullen met fixatieve oplossing voorzichtig en langzaam door de ronde en ovale ramen totdat de oplossing wast uit het kleine gaatje aan de top.Voordat u het haakgebied scheidt van de basale draai, moet u de medialis van het haakgebied afsnijden om de verwijdering van de medialis te vergemakkelijken.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Voorbereiding en Immunokleuring van de muis sensorische zenuwvezels innerveren de huid en ledematen Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse imaging van neuroblast migratie in Acute Schijfjes van de volwassen muis voorhersenen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Een<em&gt; In-vitro</em&gt; Voorbereiding van Geïsoleerde enterische neuronen en Glia uit de myenterische Plexus van de Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Adult Mouse spier-zenuw Voorbereiding voor het bestuderen van de Firing Eigenschappen van Muscle afferenten

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langdurige Time Lapse Imaging van Muis Cochlear Explantaten

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Behandelende zoogdieren Axon regeneratie: In Vivo Electroporation van volwassen muis achterwortelganglia Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...