Name: cochlear surface preparation in the adult mouse
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

Le projet de recherche décrit a été soutenu par la subvention R01 DC009222 du National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Ces travaux ont été réalisés dans l'édifice WR du MUSC dans un espace rénové soutenu par la subvention C06 RR014516. Les animaux ont été logés dans des installations musC CRI pour animaux, appuyés par la subvention C06 RR015455 du Programme des installations de recherche extra-muros du National Center for Research Resources. Les auteurs remercient le Dr Jochen Schacht pour ses précieux commentaires et Andra Talaska pour la relecture du manuscrit.

Tous les protocoles de recherche impliquant des souris adultes mâles de l'ABC/J à l'âge de 10-12 semaines et des souris c57BL/6J à l'âge de 6-8 semaines ont été approuvés par le comité institutionnel de soin et d'utilisation des animaux (IACUC) à l'université médicale de Caroline du Sud (MUSC). Les soins aux animaux étaient sous la supervision de la Division des ressources animales de laboratoire du MUSC.
REMARQUE: Pour les procédures présentées ci-dessous, les...

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	<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li><li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss.">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion.">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li><li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK.">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss.">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress.">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses.">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo.">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li><li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+neural+degeneration+with+aging,+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear.">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms.">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 7, 2063 (2016).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Engstr&#246;m, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection.">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).</li><li>. MassEyeAndEar.org Available from: <a target="_blank" href="https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories">https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories</a> (2019)</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea.">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>. Corning Cell Culture Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf</a> (2019)</li><li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li><li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+anatomy+of+the+'hook'+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation.">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li><li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing.">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li><li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death.">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1262 (2014).</li><li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea.">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).</li></ol>

La microdissection cochléaire des préparations de surface de montage entier en combination avec l'immunolabeling fournit un outil de base pour l'étude des pathologies d'oreille interne et des mécanismes moléculaires. Cette méthode de dissection cochléaire de souris adulte modifiée utilisant l'adhésif de cellules et de tissu simplifie cette procédure difficile.
Bien que cette méthode modifiée de préparation de surface cochléaire soit relativement facile et accessible, elle nécess...

La cochlée est dédiée à la détection du son et responsable de l'audition. Le conduit cochléaire est enroulé dans une forme spirale dans le labyrinthe osseux et tient l'organe d'extrémité sensorielle auditive, l'organe de Corti (OC). Le CO repose sur la membrane basilaire, constituant l'épithélium cochléaire, d'une longueur d'environ 5,7 mm lorsqu'il est désenroulé chez les souris adultes CBA/ CaJ1,2. Parce que le CO est tonotopiquement organisé avec des hautes fréquences détectées dans la base et les basses fréquences dans l'apex, l'épithélium cochléaire est souvent divisé en trois parties pour des comparaisons analytiques: les tours asphériques, moyens et basaux correspondant à faible, détection moyenne et haute fréquence, respectivement. En plus d'un éventail de cellules de soutien, le CO est composé d'une rangée de cellules ciliées internes (IHC) situées médially et de trois rangées de cellules ciliées externes (CCO) situées latéralement par rapport à la spirale cochléaire.
Le traitement auditif correct dépend de l'intégrité des cellules ciliées sensorielles dans la cochlée. Les dommages ou la perte de cellules ciliées sensorielles sont une caractéristique pathologique commune de la perte auditive acquise, causée par de nombreuses étiologies telles que l'exposition à un bruit excessif, l'utilisation de médicaments ototoxiques, les infections bactériennes ou virales de l'oreille, les traumatismes crâniens et le vieillissement processus3. En outre, l'intégrité et la fonction de la cellule capillaire interne / synapses nerveuses auditives peuvent être altérées par des insultes légères4. Avec la disponibilité de l'information moléculaire et génétique et la manipulation des gènes par KO et knock-in techniques, les souris ont été largement utilisés dans la science de l'audition. Bien que la cochlée adulte de souris soit minuscule et que l'épithélium cochléaire soit entouré d'une capsule osseuse entraînant des microdissections techniquement difficiles, des préparations de surface de l'épithélium en combinaison avec l'immunolabeling ou l'immunohistochimie et l'imagerie confocale ont été largement utilisées pour l'étude des pathologies cochléaires, y compris les pertes de synapses de ruban et de cellules ciliées, les changements dans les niveaux de protéines dans les cellules ciliées sensorielles et les cellules de soutien, et la régénération des cellules capillaires. Des préparations de surface cochléaires ont également été utilisées pour déterminer le modèle d'expression des gènes des journalistes (c.-à-d. GFP) et confirmer la transduction réussie et identifier les types de cellules transductées. Ces techniques ont été précédemment utilisées pour l'étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à la perte auditive induite par le bruit à l'aide de souris adultes CBA / J5,6,7,8,9.
Contrairement à l'immunohistochimie utilisant des sections de paraffine ou des cryosections pour obtenir de petites parties transversales de la cochlée qui contiennent trois cellules ciliées externes (CCO) et une cellule capillaire interne (IHC) sur chaque section, les préparations de surface cochléaire permettent visualisation de toute la longueur de l'OC pour le comptage des cellules ciliées sensorielles et des synapses de ruban et de l'immunolabeling des cellules ciliées sensorielles correspondant à des fréquences fonctionnelles spécifiques. Le tableau 1 montre la cartographie des fréquences auditives en fonction de la distance le long de la spirale cochléaire chez la souris adulte CBA/J selon des études de Muller1 et Viberg et Canlon1,2. Les préparations de surface cochléaires ont été largement utilisées pour l'étude des pathologies cochléaires4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. La méthode de dissection cochléaire à monture entière a été décrite à l'origine dans un livre édité par Hans Engstrom en 196616. Cette technique a ensuite été affinée et adaptée à une variété d'espèces telles que décrites dans la littérature par un certain nombre de scientifiques en sciences de l'audition10,11,12,13, 15,17 et par les laboratoires Eaton-Peabody au Massachusetts Eye and Ear18. Récemment, une autre méthode de dissection cochléaire a été rapportée par Montgomery et coll.19. La microdissection de la cochlée est une étape essentielle et critique pour les préparations de surface cochléaires. Cependant, disséquer les cochléées de souris est un défi technique et nécessite une pratique considérable. Ici, une méthode modifiée de préparation de surface cochléaire est présentée pour une utilisation dans les cochléae adultes de souris. Cette méthode nécessite la décalcification et l'utilisation d'adhésif cellulaire et tissulaire (c.-à-d. Cell-Tak) pour adhérer aux morceaux d'épithélium cochléaire à des couvertures rondes de 10 mm pour l'immunoétiquetage. L'adhésif de cellules et de tissu a été employé couramment pour l'immunohistochimie20. Cette méthode de microdissection cochléaire modifiée est relativement simple par rapport à celles précédemment rapportées18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-mm Rund Coverslips</td>
			<td>Microscopy products for science and industry</td>
			<td>260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboard Micro Slide Trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST fine science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-gel with Tris Buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-myosin VIIa Antibody</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CtBP2 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Glu2R Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100491-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cochlear surface preparation in the adult mouse

Le traitement auditif de la cochlée dépend de l'intégrité des cellules ciliées mécanosensorielles. Au cours d'une vie, la perte auditive peut être acquise à partir de nombreuses étiologies telles que l'exposition à un bruit excessif, l'utilisation de médicaments ototoxiques, les infections bactériennes ou virales de l'oreille, les traumatismes crâniens et le processus de vieillissement. La perte de cellules ciliées sensorielles est une caractéristique pathologique commune des variétés de perte auditive acquise. En outre, la synapse de cellules de cheveux internes peuvent être endommagées par des insultes légères. Par conséquent, les préparations de surface de l'épithélie cochléaire, en combinaison avec les techniques d'étiquetage immunoetsetaux et l'imagerie confocale, sont un outil très utile pour l'étude des pathologies cochléaires, y compris les pertes de synapses de ruban et de cellules capillaires sensorielles, changements des niveaux de protéines dans les cellules ciliées et les cellules de soutien, la régénération des cellules ciliées et la détermination de l'expression du gène de rapport (c.-à-d., GFP) pour la vérification de la transduction réussie et l'identification des types de cellules transductées. La cochlée, une structure osseuse en forme de spirale dans l'oreille interne, détient l'organe auditif de fin sensorielle, l'organe de Corti (OC). Les cellules ciliées sensorielles et les cellules de soutien environnantes dans le CO sont contenues dans le conduit cochléaire et reposent sur la membrane basilaire, organisée de façon tonotopique avec détection à haute fréquence se produisant dans la base et basse fréquence dans l'apex. Avec la disponibilité de l'information moléculaire et génétique et la capacité de manipuler des gènes par KO et knock-in techniques, les souris ont été largement utilisés dans la recherche biologique, y compris dans la science de l'audition. Cependant, la cochlée de souris adulte est minuscule, et l'épithélium cochléaire est encapsulé dans un labyrinthe osseux, rendant la microdissection difficile. Bien que des techniques de dissection aient été développées et utilisées dans de nombreux laboratoires, cette méthode modifiée de microdissection utilisant l'adhésif de cellules et de tissu est plus facile et plus commode. Il peut être utilisé dans tous les types de cochlée de souris adultes après la décalcification.

Les préparations de surface de l'épithélium cochléaire, combinées à l'immunolabeling et à l'imagerie confocale, ont été largement utilisées dans la science auditive pour l'étude des pathologies cochléaires, telles que la quantification des synapses de ruban, des cellules capillaires sensorielles, et l'expression des protéines dans les cellules ciliées sensorielles5,6,7,8. Bien que...

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Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Cet article présente une méthode modifiée de préparation de surface cochléaire qui exige la décalcification et l'utilisation d'un adhésif de cellules et de tissu pour adhérer aux morceaux d'épithélium cochléaire aux feuillets ronds de couverture de 10 mm pour l'immunohistochimie dans les cochléées adultes de souris.

Préparation de surface cochléaire dans la souris adulte

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Les préparations de surface cochléaires permettent la visualisation de l’objectif entier de l’organe de Corti à l’aide de l’immunohistochimie et de l’imagerie confocale. Il a été largement utilisé pour l’investigation de pathologies cochléaires spécifiques d’intérêt. Nous modifierons la méthode de microdissection cochléaire.Le principal avantage de cette technique est l’adhérence d’un morceau d’épithélium cochléaire à 10 millimètres de couvertures rondes pour la procédure d’immunolabeling tout en évitant la perte de tissu pendant les étapes multiples de lavage. En outre, les pathologies cochléaires, la préparation de surface cochléaire peut également être utilisé pour l’expression d’évaluation et la régénération des cellules capillaires. Des compétences de base au microscope sont requises pour cette technique et la démonstration visuelle de la méthode peut aider à s’assurer que chaque étape est effectuée correctement.Qiaojun Fang, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour l’extraction temporelle d’os, immédiatement post-mortem tirer la peau antérieurement pour exposer l’os du crâne et utiliser des ciseaux pour couper l’os de l’aspect postérieur vers l’avant le long de la ligne centrale du crâne. Utilisez des forceps pour enlever le tissu cérébral avant d’utiliser le pouce et l’index pour enlever manuellement les os temporels des souris âgées de trois mois ou plus.Placez les os dans une boîte Petri de 30 millimètres de diamètre contenant de la glace fraîche froide 4%PFA et PBS sous un microscope de dissection et retirez les stapes de la fenêtre ovale. Percer la membrane de la fenêtre ronde avec le nombre cinq forceps et utiliser une aiguille de calibre 27 attaché à une seringue d’un millilitre contenant frais 4%PFA pour faire un petit trou dans le sommet de la cochlée. Imprèflez doucement et lentement la cochlée avec une solution fixative via les fenêtres rondes et ovales jusqu’à ce que la solution se lave du petit trou à l’apex.Ensuite, transférez jusqu’à deux cochlées perfusées dans des flacons individuels de scintillation de 20 millilitres contenant 10 millilitres de 4 %PFA par flacon et agitez doucement les échantillons pendant deux heures à température ambiante, suivis d’un stockage de nuit à quatre degrés Celsius sur un rotateur. Le lendemain matin, lavez le cochlée avec trois lavages de cinq minutes avec du PBS frais par lavage. Après le dernier lavage, ajouter 20 millilitres de 4%EDTA à chaque flacon et faire pivoter les échantillons pendant 48 heures à quatre degrés Celsius avec une agitation douce.À la fin de l’incubation, toucher la partie vestibulaire osseuse de chaque cochlée avec des forceps pour évaluer l’élasticité des échantillons. Si les os sont élastiques plutôt que fermes, la cochlée a été décalcifiée. Remplacez l’EDTA pour chaque échantillon par du PBS frais.Pour la microdissection de l’épithélium cochléaire, saisir la partie vestibulaire de l’os temporal avec des forceps et utiliser un scalpel pour couper le virage apical à un angle de 45 degrés. Couper verticalement le long de la ligne faible entre la fenêtre ronde et la fenêtre ovale pour séparer la cochlée de la partie vestibulaire et orienter la partie cochléaire avec le virage basal vers le bas et le milieu tourne vers le haut de la boîte de Pétri. De cette position, couper la capsule osseuse et la paroi latérale du virage moyen vers l’extrémité d’où la section apical a été enlevée et continuer à couper pour séparer complètement la partie moyenne des régions basales et crochet.Placer la partie basale et crochetée avec le site de la membrane basilaire orientée vers le fond du plat, couper verticalement le médialis de la région du crochet pour enlever les médialis et couper les régions basales et crochet pour séparer la partie du crochet. Pour éviter la distorsion du tissu, coupez le médialis hors de la région d’hameçon avant la séparation du tour basal et de la région d’hameçon. Couper les portions relativement grandes de capsule osseuse et de tissu latéral de la paroi du virage moyen et tenir la paroi latérale avec des forceps pour aligner la capsule osseuse et la paroi latérale avec le fond de la boîte de Pétri, couper ces tissus du côté de la membrane basilaire.Ensuite, aplatissez le spécimen pour orienter le côté sensoriel de la surface des cellules capillaire vers le haut et coupez le reste de la capsule osseuse et de la paroi latérale. Ensuite, utilisez des forceps pour enlever la membrane tectoriale pour séparer complètement la région moyenne et enlever la capsule osseuse, le tissu latéral de la paroi, et les régions tectoriales des virages restants comme vient de le démontrer. Lorsque tous les virages cochléaires ont été disséqués, répartir 0,5 microlitres d’adhésif cellulaire et tissulaire sur le centre d’un couvercle rond de 10 millimètres et laisser sécher l’adhésif pendant trois à cinq minutes à température ambiante.Placez les coverslips séchés dans la boîte de Petri et collez les quatre morceaux de chaque échantillon sensoriel d’épithélium sur un seul coverslip. Ensuite, utilisez des forceps pour saisir un bord de chaque coverslip pour transférer les spécimens dans les puits individuels d’un plat de culture cellulaire de quatre puits pour l’immunolabeling. Pour l’immunolabeling des préparations cochléaires de synapse de surface, lavez chaque épithélium sensoriel trois fois pendant cinq minutes dans le PBS frais par lavage, suivi du traitement de chaque échantillon avec deux millilitres de surfactant non ionique de 2% pendant 30 minutes à température ambiante sur un rotateur.À la fin de l’incubation, aspirer la solution surfactant de chaque puits et bloquer toute liaison non spécifique avec 100 microlitres de solution de blocage par puits pendant une heure sur le rotateur avec une agitation douce à température ambiante. À la fin de l’incubation de blocage, lavez les échantillons trois fois avec du PBS tel que démontré sous une agitation douce avant d’étiqueter chaque épithélium de 100 microlitres des anticorps primaires d’intérêt pendant 24 heures à 37 degrés Celsius protégés de la lumière. Le lendemain, lavez les échantillons trois fois avec du PBS frais et de l’agitation douce par lavage et étiquetez les spécimens avec 100 microlitres des anticorps secondaires appropriés d’intérêt pendant deux heures à 37 degrés Celsius protégés de la lumière.À la fin de l’incubation, lavez les échantillons avec trois lavages de cinq minutes en PBS frais par lavage avant de placer chaque coverslip sur des diapositives individuelles au microscope en verre avec les échantillons orientés vers le haut. Ensuite, ajoutez soigneusement huit microlitres d’un milieu de montage approprié au centre de chaque coverslip et utilisez des forceps pour monter un autre coverslip de 10 millimètres sur chaque échantillon. Ensuite, sceller les côtés de chaque sandwich coverslip avec du vernis à ongles clair, placer les échantillons dans un dossier de diapositives en carton, et stocker les diapositives à quatre degrés Celsius.Bien que la dissection de cochlée de souris adulte pour les préparations de surface n’est pas simple, les chercheurs nouveaux à la technique devraient être en mesure d’apprendre la méthode après la pratique avec 10 à 15 oreilles. L’immunolabeling des préparations de surface des souris CBAJ non traitées de 10 à 12 semaines avec CTBP2 et GluA2 démontre que les rubans présynaptiques et les terminaux postsynaptiques respectivement sont situés sous les noyaux intérieurs de cellules capillaires et sont juxtaposés indiquant des synapses fonctionnelles. L’immunolabeling pour la myosine 7A et le contre-coloration avec la phalloidine et le DAPI indique la présence des cellules sensorielles de cheveux comprenant les cellules externes de cheveux et les cellules intérieures de cheveux et leurs noyaux.L’immunolabeling pour la myosine 7A et le contre-coloration avec la phalloidin ne montrent aucune différence dans l’immunoréactivité ou l’uniformité avec ou sans l’utilisation de l’adhésif de cellules et de tissu. En outre, la microscopie électronique de balayage des préparations de surface des souris noires 6 noires de C57 non traitées de six à huit semaines démontre une stéréocilie en forme de V bien organisée des cellules de cheveux externes dans trois rangées de l’échantillon. N’oubliez pas de remplir le cochléaire avec une solution fixative doucement et lentement à travers les fenêtres rondes et ovales jusqu’à ce que la solution se lave du petit trou à l’apex.Avant de séparer la région du crochet du virage basal, prenez soin de couper les médialis de la région de crochet pour faciliter l’enlèvement des medialis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Recherche

Neurosciences

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An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

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Une<em&gt; In-vitro</em&gt; Préparation des neurones entériques isolés et cellules gliales du Plexus myentérique de la souris adulte

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