Name: cochlear surface preparation in the adult mouse
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00
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Das beschriebene Forschungsprojekt wurde durch das Stipendium R01 DC009222 vom National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health, unterstützt. Diese Arbeiten wurden im WR-Gebäude des MUSC in renoviertem Raum durchgeführt, der durch den Zuschuss C06 RR014516 unterstützt wurde. Die Tiere wurden in MUSC CRI-Tiereinrichtungen untergebracht, die durch das Stipendium C06 RR015455 aus dem Extramural Research Facilities Program des National Center for Research Resources unterstützt wurden. Die Autoren danken Dr. Jochen Schacht für seine wertvollen Kommentare und Andra Talaska für das Korrekturlesen des Manuskripts.

Alle Forschungsprotokolle, an denen männliche erwachsene CBA/J-Mäuse im Alter von 10–12 Wochen und C57BL/6J-Mäuse im Alter von 6–8 Wochen beteiligt waren, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Medical University of South Carolina (MUSC) genehmigt. Die Tierpflege stand unter der Aufsicht der Abteilung Labortierressourcen am MUSC.
HINWEIS: Für die nachstehend dargestellten Verfahren werden Mäuse durch intraperitoneale Injektionen mit Ketamin...

<ol>
	<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li><li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss.">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion.">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li><li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK.">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss.">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress.">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses.">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo.">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li><li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+neural+degeneration+with+aging,+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear.">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms.">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 7, 2063 (2016).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Engstr&#246;m, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection.">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).</li><li>. MassEyeAndEar.org Available from: <a target="_blank" href="https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories">https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories</a> (2019)</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea.">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>. Corning Cell Culture Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf</a> (2019)</li><li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li><li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+anatomy+of+the+'hook'+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation.">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li><li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing.">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li><li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death.">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1262 (2014).</li><li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea.">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).</li></ol>

Die Cochlea-Mikrodissektion von Flächenpräparaten mit ganzer Montage in Kombination mit Derimmunolabeling stellt ein grundlegendes Werkzeug zur Untersuchung von Innenohrpathologien und molekularen Mechanismen bereit. Diese modifizierte Cochlea-Sektionsmethode für Erwachsene mit zell- und Gewebeklebstoff vereinfacht dieses schwierige Verfahren.
Obwohl diese modifizierte Cochlea-Oberflächenvorbereitungsmethode relativ einfach und zugänglich ist, erfordert sie dennoch Praxis, um Fähigkeiten...

Die Cochlea ist der Erkennung von Klang gewidmet und für das Hören verantwortlich. Der Cochlea-Kanal ist spiralförmig im knöchernen Labyrinth gewickelt und hält das auditive Sinnes-Endorgan, das Organ von Corti (OC). Das OC ruht auf der Basilarmembran, die das Cochlea-Epithel mit einer Länge von etwa 5,7 mm besteht, wenn es bei erwachsenen CBA/CaJ-Mäusen1,2abgewickelt wird. Da das OC tonotopisch mit hohen Frequenzen in der Basis und niedrigen Frequenzen in der Spitze detektiert ist, wird das Cochlea-Epithel oft in drei Teile für analytische Vergleiche unterteilt: die apikalen, mittleren und basalen Drehungen, die niedrigen, mittlere bzw. hochfrequente Erkennung. Zusätzlich zu einer Reihe von unterstützenden Zellen besteht das OC aus einer Reihe von inneren Haarzellen (IHCs), die sich medial befinden, und drei Reihen von äußeren Haarzellen (OHCs), die sich seitlich in Bezug auf die Cochlea-Spirale befinden.
Die korrekte auditive Verarbeitung hängt von der Integrität der sensorischen Haarzellen in der Cochlea ab. Die Schädigung oder der Verlust sensorischer Haarzellen ist ein häufiges pathologisches Merkmal erworbener Hörverluste, verursacht durch zahlreiche Ätiologien wie die Exposition gegenüber übermäßigem Lärm, die Verwendung von ototoxischen Medikamenten, bakterielle oder virale Ohrinfektionen, Kopfverletzungen und die Alterung Prozess3. Zusätzlich kann die Integrität und Funktion der inneren Haarzelle/Auditorennervensynapsen durch leichte Beleidigungen beeinträchtigt werden4. Mit der Verfügbarkeit molekularer und genetischer Informationen und der Manipulation von Genen durch Knockout- und Knock-in-Techniken sind Mäuse in der Hörwissenschaft weit verbreitet. Obwohl die adulte Mauscochlea winzig ist und das Cochlea-Epithel von einer knöchernen Kapsel umgeben ist, die zu technisch schwierigen Mikrodissektionen, Oberflächenpräparaten des Epithels in Kombination mit Immunlabeling oder Immunhistochemie führt. und konfokale Bilder wurden weit verbreitet für die Untersuchung von Cochlea-Pathologien verwendet, einschließlich Verluste von Bandsynapsen und Haarzellen, Veränderungen in der Menge an Proteinen in sensorischen Haarzellen und unterstützenden Zellen, und Haarzellenregeneration. Cochlea-Oberflächenpräparate wurden auch verwendet, um das Muster der Expression von Reportergenen (d. h. GFP) zu bestimmen und eine erfolgreiche Transduktion zu bestätigen und transduzierte Zelltypen zu identifizieren. Diese Techniken wurden zuvor für die Untersuchung molekularer Mechanismen verwendet, die einem lärminduzierten Hörverlust zugrunde liegen, mit erwachsenen CBA/J-Mäusen5,6,7,8,9.
Im Gegensatz zur Immunhistochemie mit Paraffinabschnitten oder Kryoschnitten, um kleine Querschnittsteile der Cochlea zu erhalten, die drei äußere Haarzellen (OHCs) und eine innere Haarzelle (IHC) auf jedem Abschnitt enthalten, ermöglichen Cochlea-Oberflächenpräparate Visualisierung der gesamten Länge des OC zum Zählen sensorischer Haarzellen und Bandsynapsen und Immunolabeling von sensorischen Haarzellen entsprechend bestimmten Funktionellen Frequenzen. Tabelle 1 zeigt die Kartierung von Hörfrequenzen als Funktion der Entfernung entlang der Länge der Cochlea-Spirale in erwachsenen CBA/J-Maus nach Studien von Müller1 und Viberg und Canlon1,2. Cochlea-Oberflächenpräparate wurden weit verbreitet für die Untersuchung von Cochlea-Pathologien4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Die ganzmontierte Cochlea-Sektionsmethode wurde ursprünglich in einem Buch beschrieben, das 1966 von Hans Engstrom herausgegeben wurde16. Diese Technik wurde anschließend verfeinert und an eine Vielzahl von Arten angepasst, wie in der Literatur von einer Reihe von Wissenschaftlern in der Hörwissenschaftbeschrieben 10,11,12,13, 15,17 und von den Eaton-Peabody Laboratories at Massachusetts Eye and Ear18. Kürzlich wurde eine weitere Cochlea-Sektionsmethode von Montgomery et al.19berichtet. Die Mikrodissektion der Cochlea ist ein wesentlicher und kritischer Schritt für Cochlea-Oberflächenpräparate. Die Sezieren von Mauscochleae ist jedoch eine technische Herausforderung und erfordert umfangreiche Übung. Hier wird ein modifiziertes Cochlea-Oberflächenpräparat zur Verwendung bei erwachsenen Mauscochleae vorgestellt. Diese Methode erfordert eine Entkalkung und Verwendung von Zell- und Gewebeklebstoff (d. h. Cell-Tak), um die Stücke des Cochlea-Epithels an 10 mm runden Abdeckungen für die Immunkennzeichnung zu kleben. Zell- und Gewebeklebstoff wurde weit verbreitet für die Immunhistochemieverwendet 20. Diese modifizierte Cochlea-Mikrodissektionsmethode ist relativ einfach im Vergleich zu denen zuvor berichtet18,19.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10-mm Rund Coverslips</td>
			<td>Microscopy products for science and industry</td>
			<td>260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboard Micro Slide Trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST fine science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-gel with Tris Buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-myosin VIIa Antibody</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CtBP2 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Glu2R Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100491-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cochlear surface preparation in the adult mouse

Die auditive Verarbeitung in der Cochlea hängt von der Integrität der mechanosensorischen Haarzellen ab. Im Laufe eines Lebens kann Hörverlust aus zahlreichen Ätiologien wie der Exposition gegenüber übermäßigem Lärm, der Verwendung von ototoxischen Medikamenten, bakteriellen oder viralen Ohrinfektionen, Kopfverletzungen und dem Alterungsprozess erworben werden. Der Verlust sensorischer Haarzellen ist ein häufiges pathologisches Merkmal der Varianten des erworbenen Hörverlusts. Zusätzlich kann die innere Haarzellsynapse durch leichte Beleidigungen beschädigt werden. Daher sind Oberflächenpräparate von Cochlea-Epithelien in Kombination mit Immunetikettierungstechniken und konfokalen Bildern ein sehr nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Cochlea-Pathologien, einschließlich des Verlustes von Bandsynapsen und sensorischen Haarzellen, Veränderungen des Proteinspiegels in Haarzellen und unterstützenden Zellen, die Regeneration der Haarzellen und die Bestimmung der Berichtsgenexpression (d. h. GFP) zur Überprüfung der erfolgreichen Transduktion und Identifizierung von transduzierten Zelltypen. Die Cochlea, eine knöcherne spiralförmige Struktur im Innenohr, hält das auditive Sinnes-Endorgan, das Organ von Corti (OC). Sensorische Haarzellen und umgebende Stützzellen im OC sind im Cochlea-Kanal enthalten und ruhen auf der Basilarmembran, die tonotopisch mit hochfrequenter Detektion in der Basis und niederfrequenter Inderin im Scheitelpunkt organisiert ist. Mit der Verfügbarkeit molekularer und genetischer Informationen und der Fähigkeit, Gene durch Knockout- und Knock-in-Techniken zu manipulieren, wurden Mäuse in der biologischen Forschung weit verbreitet, auch in der Hörwissenschaft. Die erwachsene Mauscochlea ist jedoch winzig, und das Cochlea-Epithel ist in einem knöchernen Labyrinth eingekapselt, was die Mikrodissektion erschwert. Obwohl In vielen Laboratorien Seziertechniken entwickelt und eingesetzt wurden, ist diese modifizierte Mikrodissektionsmethode mit Zell- und Gewebeklebstoff einfacher und bequemer. Es kann in allen Arten von erwachsenen Maus Cochleae nach Entkalkung verwendet werden.

Oberflächenpräparate des Cochlea-Epithels in Kombination mit Immunolabeling und konfokaler Bildgebung wurden in der Hörwissenschaft zur Untersuchung von Cochlea-Pathologien, wie z. B. Quantifizierung von Bandsynapsen, sensorischen Haarzellen, und Proteinexpression in sensorischen Haarzellen5,6,7,8. Obwohl die Zerlegung der erwachsenen Mauscochleae für Oberflächenpräparate nicht einfach is...

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Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Dieser Artikel stellt eine modifizierte Cochlea-Oberflächenvorbereitungsmethode vor, die eine Entkalkung und Verwendung eines Zell- und Gewebeklebers erfordert, um die Stücke der Cochlea-Epithel an 10 mm runden Abdeckungsscheinen für die Immunhistochemie bei erwachsenen Mauscochleae zu haften.

Cochlea-Oberflächenvorbereitung in der Erwachsenenmaus

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Cochlea-Oberflächenpräparate ermöglichen die Visualisierung der gesamten Linse des Corti-Organs mittels Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung. Es wurde im Großen und Ganzen für die Untersuchung spezifischer Cochlea-Pathologien von Interesse verwendet. Wir werden die Cochlea-Mikrodissektionsmethode modifizieren.Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Einhaltung eines Stücks Cochlea-Epithel auf 10 Millimeter runde Abdeckungen für das Immunlabeling-Verfahren bei gleichzeitiger Vermeidung von Gewebeverlust während der mehrfachen Waschschritte. Zusätzlich zu Cochlea-Pathologien kann die Cochlea-Oberflächenpräparation auch für die Beurteilungsexpression und Haarzellregeneration genutzt werden. Für diese Technik sind grundlegende Mikroskopkenntnisse erforderlich, und die visuelle Demonstration der Methode kann dazu beitragen, dass jeder Schritt korrekt ausgeführt wird.Demonstriert wird das Verfahren von Qiaojun Fang, einem Doktoranden aus meinem Labor. Für die zeitliche Knochenextraktion ziehen Sie die Haut sofort nach dem Tod nach vorne, um den Schädelknochen freizulegen, und verwenden Sie eine Schere, um den Knochen vom hinteren Aspekt nach vorne entlang der Mittellinie des Schädels zu schneiden. Verwenden Sie Zangen, um das Gehirngewebe zu entfernen, bevor Sie Daumen und Zeigefinger verwenden, um die zeitlichen Knochen von Mäusen ab drei Monaten manuell zu entfernen.Legen Sie die Knochen in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 30 Millimetern mit frischen eiskalten 4%PFA und PBS unter einem Seziermikroskop und entfernen Sie die Bänder aus dem ovalen Fenster. Punktieren Sie die runde Fenstermembran mit der Nummer fünf Zangen und verwenden Sie eine 27-Spur-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, die frische 4%PFA enthält, um ein kleines Loch in die Spitze der Cochlea zu bilden. Sanft und langsam durchdringen Sie die Cochlea mit einer fixativen Lösung über die runden und ovalen Fenster, bis die Lösung aus dem kleinen Loch an der Spitze wäscht.Dann bis zu zwei durchlässige Cochleae in einzelne 20 Milliliter-Szintillationsfläschchen mit 10 Millilitern 4%PFA pro Durchstechflasche übertragen und die Proben bei Raumtemperatur zwei Stunden lang sanft aufrichten, gefolgt von einer Nachtlagerung bei vier Grad Celsius auf einem Rotator. Am nächsten Morgen die Cochleae mit drei fünfminütigen Wäschen mit frischem PBS pro Wäsche waschen. Nach der letzten Wäsche 20 Milliliter 4%EDTA in jede Durchstechflasche geben und die Proben 48 Stunden bei vier Grad Celsius mit sanfter Rührung drehen.Berühren Sie am Ende der Inkubation den knöchernen vestibulären Teil jeder Cochlea mit Zangen, um die Elastizität der Proben zu beurteilen. Wenn die Knochen elastisch und nicht fest sind, wurde die Cochlea entkalkt. Ersetzen Sie die EDTA für jede Probe durch frische PBS.Für die Mikrodissektion des Cochlea-Epithels greifen Sie den vestibulären Teil des temporalen Knochens mit Zangen und verwenden Sie ein Skalpell, um die apikale Drehung in einem 45-Grad-Winkel zu schneiden. Schneiden Sie vertikal entlang der schwachen Linie zwischen dem runden Fenster und dem ovalen Fenster, um die Cochlea vom vestibulären Teil zu trennen und den Cochlea-Teil mit der Basaldrehung nach unten und in die Mitte zu richten, um sich an der Spitze der Petrischale zu drehen. Aus dieser Position die knöcherne Kapsel und die Seitenwand der mittleren Drehung zum Ende schneiden, von dem der apikale Abschnitt entfernt wurde, und weiter schneiden, um den mittleren Teil vollständig von den Basal- und Hakenbereichen zu trennen.Platzieren Sie den Basal- und Hakenteil mit der Basilarmembran-Stelle, die an der Unterseite der Schale orientiert ist, schneiden Sie die Medialis vertikal aus dem Hakenbereich ab, um die Medialis zu entfernen und schneiden Sie die Basal- und Hakenbereiche, um den Hakenteil zu trennen. Um eine Verzerrung des Gewebes zu vermeiden, schneiden Sie die Medialis aus dem Hakenbereich, bevor Sie den Basal- und Hakenbereich trennen. Schneiden Sie die relativ großen Teile der knöchernen Kapsel und seitlichen Wandgewebe der mittleren Drehung und halten Sie die seitliche Wand mit Zangen, um die knöcherne Kapsel und die seitliche Wand mit dem Boden der Petrischale auszurichten, schneiden Sie diese Gewebe von der Basilarmembranseite.Als nächstes glätten Sie die Probe, um die sensorische Haarzellenoberfläche seitlich nach oben zu richten und den Rest der knöchernen Kapsel und der Seitenwand wegzuschneiden. Dann verwenden Sie Zangen, um die tektoriale Membran vollständig zu entfernen, um den mittleren Bereich vollständig zu trennen und entfernen Sie die knöcherne Kapsel, seitliches Wandgewebe und tektoriale Bereiche der verbleibenden Drehungen, wie gerade gezeigt. Wenn alle Cochlea-Drehungen seziert sind, verteilen Sie 0,5 Mikroliter Zell- und Gewebekleber auf die Mitte eines runden 10-Millimeter-Deckels und lassen Sie den Klebstoff drei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur trocknen.Die getrockneten Deckel in die Petrischale geben und alle vier Stücke jeder sensorischen Epithelprobe auf einen Deckelschlupf kleben. Dann verwenden Sie Zangen, um eine Kante jedes Coverslips zu erfassen, um die Proben in einzelne Brunnen einer Vier-Well-Zell-Kulturschale für die Immunetikettierung zu übertragen. Zur Immunolabelierung von Oberflächen-Cochlea-Synapsepräparaten jedes sensorische Epithel dreimal für fünf Minuten in frischem PBS pro Waschgang waschen, gefolgt von der Behandlung jeder Probe mit zwei Millilitern 2%nichtionisches Tensid für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator.Am Ende der Inkubation die Tensidlösung aus jedem Brunnen absaugen und jede unspezifische Bindung mit 100 Mikroliter Blockierlösung pro Brunnen pro Brunnen für eine Stunde auf den Rotator mit sanfter Rührung bei Raumtemperatur blockieren. Waschen Sie die Proben am Ende der blockierenden Inkubation dreimal mit PBS, wie unter sanfter Erregung demonstriert, bevor Sie jedes Epithel mit 100 Mikrolitern der primären, vor Licht geschützten primären Antikörper 24 Stunden bei 37 Grad Celsius beschriften. Am nächsten Tag die Proben dreimal mit frischem PBS und sanfter Rührung pro Waschgang waschen und die Proben mit 100 Mikrolitern der entsprechenden Sekundärantikörper von Interesse für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius vor Licht geschützt kennzeichnen.Waschen Sie die Proben am Ende der Inkubation mit drei fünfminütigen Waschungen in frischem PBS pro Waschgang, bevor Sie jeden Deckelrutsch auf einzelne Glasmikroskopschlitten mit nach oben zeigenden Proben legen. Als nächstes fügen Sie vorsichtig acht Mikroliter eines geeigneten Montagemediums in die Mitte jedes Coverslips und verwenden Sie Zangen, um weitere 10 Millimeter Abdeckungsrutsch e.B. auf jede Probe zu montieren. Dann versiegeln Sie die Seiten jedes Coverslip-Sandwiches mit klarem Nagellack, legen Sie die Proben in einen Papp-Diaordner und lagern Sie die Dias bei vier Grad Celsius.Obwohl die Zerlegung der erwachsenen Maus cochleae für Oberflächenpräparate nicht einfach ist, sollten Forscher, die neu in der Technik sind, in der Lage sein, die Methode nach dem Üben mit 10 bis 15 Ohren zu erlernen. Die Immunolabelierung von Oberflächenpräparaten unbehandelter 10 bis 12 Wochen alter CBAJ-Mäuse mit CTBP2 und GluA2 zeigt, dass sich sowohl präsynaptische Bänder als auch postsynaptische Klemmen unterhalb der inneren Haarzellkerne befinden und auf funktionelle Synapsen hinweisend gegenübergestellt werden. Die Immunolabelierung für Myosin 7A und die Gegenfärbung mit Phalloidin und DAPI zeigt das Vorhandensein von sensorischen Haarzellen, einschließlich der äußeren Haarzellen und inneren Haarzellen und ihrer Kerne.Die Immunolabelierung für Myosin 7A und die Gegenfärbung mit Phalloidin zeigt keine Unterschiede in der Immunreaktivität oder Homogenität mit oder ohne Verwendung von Zell- und Gewebeklebstoff. Darüber hinaus zeigt die Rasterelektronenmikroskopie von Oberflächenpräparaten von unbehandelten sechs bis acht Wochen alten C57 black 6 Mäusen eine gut organisierte V-förmige Stereocilia äußerer Haarzellen in drei Reihen der Probe. Denken Sie daran, den Cochlea mit fixativer Lösung sanft und langsam durch die runden und ovalen Fenster zu füllen, bis die Lösung aus dem kleinen Loch an der Spitze wärtig.Bevor Sie den Hakenbereich von der Basaldrehung trennen, achten Sie darauf, die Medialis aus dem Hakenbereich zu schneiden, um die Entfernung der Medialis zu erleichtern.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Forschung

Neurowissenschaften

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Adult Maus Muskel-Nerven Vorbereitung für das Studium der Brenneigenschaften des Muskel-Afferenzen

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...