Name: cochlear surface preparation in the adult mouse
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

פרויקט המחקר תיאר היה נתמך על ידי גרנט R01 DC009222 מן המכון הלאומי על חירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכון הלאומי לבריאות. עבודה זו נערכה בבניין WR ב MUSC בחלל משופץ נתמך על ידי גרנט C06 RR014516. בעלי חיים היו שוכנו במתקני בעלי חיים MUSC, הנתמכת על ידי מענק C06 RR015455 מתוכנית מחקר של אקסטרקיר של המרכז הלאומי למשאבי מחקר. המחברים מודים לד ר ג'צ'ן שכטר על הערותיו היקרות ועל הגהה של כתב היד.

כל פרוטוקולי המחקר מעורבים גברים מבוגרים CBA/J עכברים בגילאי 10 – 12 שבועות ו C57BL/6J עכברים בגילאי 6 – 8 שבועות אושרו על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה (MUSC). טיפול בבעלי חיים היה תחת פיקוחו של החטיבה למשאבי בעלי חיים במעבדה ב-MUSC.
הער...

<ol>
	<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li><li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss.">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion.">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li><li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK.">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss.">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress.">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses.">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo.">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li><li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+neural+degeneration+with+aging,+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear.">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms.">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 7, 2063 (2016).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Engstr&#246;m, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection.">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).</li><li>. MassEyeAndEar.org Available from: <a target="_blank" href="https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories">https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories</a> (2019)</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea.">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>. Corning Cell Culture Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf</a> (2019)</li><li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li><li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+anatomy+of+the+'hook'+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation.">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li><li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing.">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li><li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death.">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1262 (2014).</li><li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea.">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).</li></ol>

ניתוח שבלול של פני השטח הכולל בשילוב עם האימונואולבלינג מספק כלי בסיסי לחקירת הפתווגיות באוזן הפנימית ומנגנונים מולקולריים. זה שונה העכבר המבוגר לנתיחה שבלול שיטה באמצעות התא ואת הדבק מפשט את ההליך הזה קשה.
למרות שיטת ההכנה לפני שבלול זו שונה יחסית קלה ונגישה, היא עדיין דו?...

שבלול מוקדש זיהוי של קול ואחראי לשמיעה. תעלת השבלול מתפתל בצורת ספירלה במבוך הגרמי ומחזיקה את האיבר החושי הסופי של השמיעה, העוגב של קורטי (OC). OC נח על קרום בזיאר, הפיכת האפיתל שבלול, עם אורך של כ 5.7 מ"מ כאשר הסרת מתפתל ב cba/caj עכברים מבוגרים1,2. בגלל OC הוא tonotopically מריחה על הרקמות עם תדרים גבוהים זוהה בבסיס תדרים נמוכים בפיסגה, אפיתל שבלול מחולק לעתים קרובות לשלושה חלקים עבור השוואות אנליטיות: apical, האמצעי, ו בסיס הופך מתאים נמוך, בינוני, וזיהוי תדר גבוה, בהתאמה. בנוסף למערך של תאים תומכים, ה-OC מורכב משורה אחת של תאי שיער פנימיים (IHCs) הממוקמת באופן מדעי ושלוש שורות של תאי שיער חיצוניים (OHCs) ממוקמים באופן משני ביחס לספירלה השבלול.
עיבוד שמיעתי נכון תלוי בשלמות תאי השיער החושי בתוך שבלול. נזק או אובדן של תאי שיער חושי היא תכונה פתולוגית נפוצה של אובדן שמיעה נרכש, שנגרמו על ידי הרבה חבלות כגון חשיפה לרעש מוגזם, שימוש בתרופות אוטוטוקסיות, דלקות אוזניים חיידקי או נגיפי, פציעות ראש, והזדקנות תהליך3. בנוסף, את היושרה והתפקוד של תא השיער הפנימי/מעצבי העצב השמיעה יכול להיות לקוי על ידי העלבונות קל4. עם הזמינות של מידע מולקולרי וגנטי ומניפולציה של גנים על ידי הסתרה וטכניקות דפיקה, עכברים כבר בשימוש נרחב במדע שמיעה. למרות שבלול העכבר המבוגר הוא זעיר ואת האפיתל שבלול הוא מוקף כמוסה גרמי וכתוצאה מכך מיקרוניתוח קשה מבחינה טכנית, משטח ההכנות של האפיתל בשילוב עם אימונויניום או אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית וקד שימשו באופן נרחב לחקירת הפתווגיות שבלול, כולל הפסדים של הסינפסות של הסרט ותאי השיער, שינויים ברמות של חלבונים בתאי שיער חושי ותאים תומכים, והתחדשות תא השיער. ההכנות פני השטח שבלול שימשו גם כדי לקבוע את תבנית הביטוי של גנים הכתב (כלומר, GFP) ולאשר התמרה מוצלחת ולזהות סוגי תאים התמרה. טכניקות אלה שימשו בעבר למחקר של מנגנונים מולקולריים בבסיס אובדן שמיעה המושרה רעש באמצעות מבוגרים cba/J עכברים5,6,7,8,9.
בניגוד אימונוהיסטוכימיה באמצעות מקטעים פרפין או קריוקטדורים כדי לקבל חלקים החוצה חתך קטן של שבלול המכילים שלושה תאים השיער החיצוני (OHCs) ואחד תא השיער הפנימי (IHC) על כל קטע, משטח שבלול ההכנות לאפשר ויזואליזציה של האורך כולו של OC לספירת תאים שיער חושי וסינפסות סרט ואימונויניום של תאי שיער חושי המתאימים תדרים פונקציונליים ספציפיים. טבלה 1 מראה את המיפוי של תדרי שמיעה כפונקציה של מרחק לאורך הספירלה שבלול ב-cba/J עכבר למבוגרים על פי לימודים מולר1 ו Viberg ו canlon1,2. ההכנות פני השטח שבלול כבר בשימוש נרחב לחקירת הפתווגיות שבלול4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13.14,15 שיטת הניתוח השבלול המלא תוארה במקור בספר שנערך על ידי הנס אנגלסטרום ב-196616. טכניקה זו הייתה מעודנת ומותאמת למגוון של מינים כמתואר בספרות על ידי מספר מדענים במדעי השמיעה10,11,12,13, 15,17 ועל ידי מעבדות איטון-פיבודי ב מסצ עין ואוזן18. לאחרונה דווח על שיטה נוספת לחיתוך שבלול על-ידי מונטגומרי ואח '19. מיקרודיסקציה של שבלול הוא צעד חיוני וקריטי עבור ההכנות פני השטח של שבלול. עם זאת, מבתר כנימת העכבר הוא אתגר טכני ודורש פרקטיקה ניכרת. כאן, שיטת הכנה לפני השבלול שונה מוצגת לשימוש כנימת העכבר למבוגרים. שיטה זו דורשת decalcification ושימוש בדבק תא ורקמות (כלומר, Cell-Tak) כדי לדבוק פיסות של אפיתל שבלול כדי 10 מ"מ שמיכות עגול מחליק עבור immunolabeling. דבק תא ורקמה שימש באופן נרחב עבור אימונוהיסטוכימיה20. שיטה זו שונה לנתיחה המיקרודיסקציה היא פשוטה יחסית לאלה שדווחו בעבר18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-mm Rund Coverslips</td>
			<td>Microscopy products for science and industry</td>
			<td>260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboard Micro Slide Trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST fine science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-gel with Tris Buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-myosin VIIa Antibody</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CtBP2 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Glu2R Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100491-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cochlear surface preparation in the adult mouse

עיבוד השמיעה בתוך שבלול תלוי בשלמות של תאי השיער המכניים. במשך החיים, אובדן שמיעה ניתן לרכוש הרבה חבלות כגון חשיפה לרעש מוגזם, השימוש בתרופות האוטוטוקסינים, זיהומים חיידקיים או נגיפי האוזן, פציעות ראש, ואת תהליך ההזדקנות. אובדן תאים שיער חושי היא תכונה פתולוגית נפוצה של זנים של אובדן שמיעה נרכש. בנוסף, תא השיער הפנימי סינפסה יכול להיפגע על ידי עלבונות קלים. לכן, ההכנות פני השטח של epithelia שבלול, בשילוב עם טכניקות אימונויניום ודימויים קונפוקלית וקד, הם כלי שימושי מאוד לחקירת הפתווגיות שבלול, כולל הפסדים של הסינפסות של רצועת הכלים ותאי שיער חושי, שינויים ברמות החלבונים בתאי השיער והתאים התומכים, התחדשות תאי השיער וקביעת הביטוי הגנטי של הדוח (כלומר, GFP) לאימות התמרה מוצלחת וזיהוי של סוגי תאים שעברו התמרה. שבלול, מבנה בצורת ספירלה גרמי באוזן הפנימית, מחזיק את האיבר החושי קצה השמיעה, האיבר של Corti (OC). תאים שיער חושי התאים התומכים המקיפים ב-OC הם כלולים צינור שבלול ולנוח על קרום בזיאר, מאורגן באופנה tonotopic נושא עם זיהוי תדר גבוה המתרחשים בבסיס ובתדר נמוך בקודקוד. עם הזמינות של מידע מולקולרי וגנטי ואת היכולת לתמרן גנים על ידי הסתרה וטכניקות דפיקה, עכברים כבר בשימוש נרחב במחקר ביולוגי, כולל במדעי השמיעה. עם זאת, העכבר המבוגר שבלול הוא זעיר, ואת האפיתל שבלול הוא כימוס במבוך הגרמי, הפיכת מיקרו לנתיחה קשה. למרות טכניקות הניתוח פותחו ונעשה שימוש במעבדות רבות, זו שיטה מיקרודיסקציה שונה באמצעות דבק תא ורקמות קל יותר ונוח יותר. ניתן להשתמש בו בכל סוגי שבלול העכבר המבוגר בעקבות decalcification.

משטח ההכנות של האפיתל שבלול, בשילוב עם אימונויניום והדמיה קונפוקלית וקד, כבר נעשה שימוש נרחב במדע שמיעה לחקירה של פתווגיות שבלול, כגון כימות של הסינפסות של סרט, תאי שיער חושי, וחלבון ביטוי בתאי השיער הסנסוריים5,6,7,8. למרו?...

Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

מאמר זה מציג משטח שונה הכנה שבלול שיטה הדורשת decalcification ושימוש של תא ודבק רקמה לדבוק פיסות של epithelia לכסות 10 מ"מ כיסוי עגול עבור אימונוהיסטוכימיה העכבר למבוגרים כנימת.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

תכשירי משטח שרוך מאפשרים הדמיה של כל העדשה של האיבר של קורטי באמצעות אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקאלית. זה שימש באופן נרחב לחקירה של פתולוגיות cochlear ספציפיות של עניין. אנו משנים את שיטת המיקרו-דיסקטוריה של השבב.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הדבקות של חתיכת אפיתל שבך ל 10 מילימטר כיסויים עגולים עבור הליך immunolabeling תוך הימנעות אובדן רקמות במהלך שלבי כביסה מרובים. בנוסף פתולוגיות cochlear, הכנת משטח שרוך יכול גם להיות מנוצל עבור ביטוי הערכה והתחדשות תאי השיער. מיומנויות מיקרוסקופ בסיסיות נדרשות עבור טכניקה זו והדגמה חזותית של השיטה יכולה לעזור להבטיח שכל שלב מבוצע כראוי.הדגמת ההליך תהיה צ'יאוג'ון פאנג, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. עבור עקירת עצם זמנית, מיד לאחר המוות למשוך את העור הקדמי כדי לחשוף את עצם הגולגולת ולהשתמש מספריים לחתוך את העצם מההיבט האחורי קדימה לאורך הקו המרכזי של הגולגולת. השתמש מדפים כדי להסיר את רקמת המוח לפני השימוש באגודל ובאצבע המורה כדי להסיר באופן ידני את עצמות הזמן מעכברים שלושה חודשים של גיל ומעלה.מניחים את העצמות לתוך צלחת פטרי בקוטר 30 מ"מ המכילה קרח טרי קר 4% PFA ו PBS תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהסיר את stapes מהחלון הסגלגל. לנקב את קרום החלון העגול עם מלקחים מספר חמש ולהשתמש מחט מד 27 מחובר מזרק מיליליטר אחד המכיל טרי 4% PFA לעשות חור קטן לתוך שיאו של cochlea. בעדינות ולאט לאט לעיין ב cochlea עם פתרון תיקון דרך החלונות העגולים והאליפטיים עד הפתרון נשטף מתוך החור הקטן על apex.לאחר מכן להעביר עד שני cochleae מנוון לתוך בקבוקונים בודדים 20 מיליליטר נצנוץ המכיל 10 מיליליטר של 4% PFA לכל בקבוקון בעדינות להתסיס את הדגימות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ואחריו אחסון לילה בארבע מעלות צלזיוס על מסובב. למחרת בבוקר, לשטוף את cochleae עם שלוש שטיפות חמש דקות עם PBS טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים 20 מיליליטר של 4% EDTA לכל בקבוקון ומסובבים את הדגימות במשך 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה.בסוף הדגירה, לגעת בחלק שיוויץ גרמי של כל cochlea עם מדפים כדי להעריך את הגמישות של הדגימות. אם העצמות אלסטיות ולא מוצקות, שבלול השיניים נודק. החלף את ה- EDTA עבור כל דגימה ב- PBS טרי.עבור microdissection של אפיתל שרוך, לתפוס את החלק שיוויץ של עצם הזמן עם מטלפים ולהשתמש אזמל לחתוך את הסיבוב apical בזווית של 45 מעלות. חותכים אנכית לאורך הקו הקלוש שבין החלון העגול לחלון הסגלגל כדי להפריד את הקלאה מחלק שיוויון ומכווןים את חלק הלול עם הסיבוב הבסיסי לכיוון החלק התחתון והאמצע פונה לכיוון החלק העליון של צלחת פטרי. מעמדה זו, חותכים את הקפסולה הגרמי ואת הקיר רוחבי של האמצעי לפנות לכיוון הסוף שממנו החלק apical הוסר ולהמשיך לחתוך כדי להפריד לחלוטין את החלק האמצעי מאזורי בסיס וו.הצבת החלק הבסיסי וו עם האתר קרום בזילאר מכוון לכיוון החלק התחתון של המנה, לחתוך אנכית את medialis את אזור הוו כדי להסיר את medialis לחתוך את אזורי בסיס וו להפריד את חלק הוו. כדי למנוע עיוות של הרקמה, לחתוך את medialis את אזור הוו לפני ההפרדה של אזור סיבוב בסיס וו. חותכים את החלקים הגדולים יחסית של כמוסה גרמית רקמת קיר צדדית של הפנה האמצעי ומחזיק את הקיר הצדדי עם מטלטולים כדי ליישר את הקפסולה גרמית ואת הקיר הצדדי עם החלק התחתון של צלחת פטרי, לחתוך את הרקמות האלה מהצד קרום בזיליקום.לאחר מכן, משטחים את הדגימה כדי לכוון את צד פני השטח של תא השיער החושי למעלה ולקצץ את שאר הקפסולה הגרמי והקיר הצדדי. לאחר מכן השתמש במקלות כדי להסיר את קרום tectorial כדי להפריד לחלוטין את האזור האמצעי ולהסיר את הקפסולה גרמית, רקמת קיר מצד שני, ואזורים tectorial של פניות הנותרים כפי שהודגם רק. כאשר כל הסיבובים cochlear נותאו, להפיץ 0.5 microliters של תאים ורקמות דבק על המרכז של סיבוב אחד 10 מילימטר מכסה ולאפשר דבק להתייבש במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר.מניחים את הכיסויים המיובשים בצלחת פטרי ומדביקים את כל ארבעת החלקים של כל דגימת אפיתל חושית על כיסוי אחד. לאחר מכן השתמש במטסים כדי לתפוס קצה אחד של כל כיסוי כדי להעביר את הדגימות לתוך בארות בודדות של צלחת תרבות תא ארבע בארות עבור immunolabeling. לקבלת immunolabeling של הכנות סינפסה שרוך פני השטח, לשטוף כל אפיתל חושי שלוש פעמים במשך חמש דקות PBS טרי לכל לשטוף, ואחריו הטיפול של כל מדגם עם שני מיליליטר של 2% לא יוני פעילי שטח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב.בסוף הדגירה, שאפו את התמיסה האקטיבית מכל באר וחסמו כל כריכה לא ספציפית עם 100 מיקרוליטרים של פתרון חסימה לאורך שעה על המסובב עם תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה חסימה, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS כפי שהודגם תחת תסיסה עדינה לפני תיוג כל אפיתל עם 100 microliters של הנוגדנים העיקריים של עניין במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. למחרת, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS טרי תסיסה עדינה לכל לשטוף ולתייג את הדגימות עם 100 microliters של נוגדנים משניים המתאימים של עניין במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות עם שלוש שטיפות חמש דקות PBS טרי לכל לשטוף לפני הנחת כל כיסוי על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית בודדות עם דגימות פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הוסיפו בזהירות שמונה מיקרוליטרים של מדיום הרכבה מתאים למרכז כל כיסוי ולהשתמש במדפים כדי להרכיב כיסוי נוסף של 10 מילימטרים על כל דגימה. לאחר מכן לאטום את הצדדים של כל כריך coverslip עם לק ברור, למקם את הדגימות לתוך תיקיית שקופיות קרטון, ולאחסן את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס.למרות הניתוח של שבלול עכבר בוגר להכנת פני השטח אינו פשוט, חוקרים חדשים בטכניקה צריכים להיות מסוגלים ללמוד את השיטה לאחר תרגול עם 10 עד 15 אוזניים. Immunolabeling של הכנות פני השטח של עכברים CBAJ לא מטופלים 10-12 שבועות עם CTBP2 ו GluA2 מדגים כי הן סרטים presynaptic וטרמינלים postsynaptic בהתאמה ממוקמים מתחת הגרעינים תא השיער הפנימי והם צירוף המציין סינפסות פונקציונליות. Immunolabeling עבור מיוסין 7A ונגד עם פאלודין ו DAPI מגלה את נוכחותם של תאי שיער חושיים כולל תאי השיער החיצוניים ותאי השיער הפנימיים ואת הגרעינים שלהם.Immunolabeling עבור myosin 7A ונגד הגנה עם פאלודין מראה שום הבדלים immunoreactivity או אחידות עם או בלי שימוש דבק תאים ורקמות. בנוסף, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים של תכשירי פני השטח מעכברים שחורים שחורים C57 בני שישה עד שמונה שבועות מדגמים סטריאוסיליה מאורגנת היטב בצורת V של תאי שיער החיצוניים בשלוש שורות של המדגם. זכור למלא את העצם בפתרון מתקן בעדינות ולאט לאט דרך החלונות העגולים והאליפטיים עד שהפתרון יישטף מהחור הקטן ב- apex.לפני הפרדת אזור הוו מפניית הבזל, טפל בחיתוך המדיאליס מאזור הוו כדי להקל על הסרת המדיאליס.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

<em&gt; במבחנה</emהכנת שרירים עצבים&gt; עכבר למבוגרים ללימוד מאפייני ירי afferents השריר

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: In Vivo אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...