Name: cochlear surface preparation in the adult mouse
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00
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वर्णित अनुसंधान परियोजना को राष्ट्रीय बहरापन और अन्य संचार विकारों, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से अनुदान R01 DC009222 द्वारा समर्थित किया गया था । यह काम अनुदान C06 RR014516 द्वारा समर्थित पुनर्निर्मित अंतरिक्ष में MUSC में डब्ल्यूआर बिल्डिंग में आयोजित किया गया था। पशुओं को राष्ट्रीय अनुसंधान संसाधन केंद्र के एक्सट्राम्यूल रिसर्च फैसिलिटीज प्रोग्राम से अनुदान C06 RR015455 द्वारा समर्थित MUSC सीआरआई पशु सुविधाओं में रखे गए थे। लेखक पांडुलिपि के प्रूफरीडिंग के लिए डॉ जोचेन Schacht और आंद्रा तास्का को उनकी बहुमूल्य टिप्पणियों और आंद्रा तास्का के लिए धन्यवाद देते हैं ।

10-12 सप्ताह की उम्र में पुरुष वयस्क CBA/J चूहों और 6-8 सप्ताह की उम्र में C57BL/6J चूहों से जुड़े सभी अनुसंधान प्रोटोकॉल को दक्षिण कैरोलिना (MUSC) के मेडिकल विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्व?...

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	<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li><li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss.">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion.">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li><li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK.">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss.">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress.">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses.">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo.">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li><li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+neural+degeneration+with+aging,+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear.">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms.">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 7, 2063 (2016).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Engstr&#246;m, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection.">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).</li><li>. MassEyeAndEar.org Available from: <a target="_blank" href="https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories">https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories</a> (2019)</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea.">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>. Corning Cell Culture Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf</a> (2019)</li><li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li><li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+anatomy+of+the+'hook'+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation.">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li><li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing.">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li><li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death.">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1262 (2014).</li><li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea.">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).</li></ol>

इम्यूनोलेबलिंग के संयोजन में पूरे माउंट सतह की तैयारी का कॉकलियर माइक्रोडिसेक्शन आंतरिक कान विकृतियों और आणविक तंत्र की जांच के लिए एक बुनियादी उपकरण प्रदान करता है। कोशिका और ऊतक चिपकने वाला का उपय...

कॉकलया ध्वनि का पता लगाने और सुनवाई के लिए जिम्मेदार के लिए समर्पित है। कॉकलियर डक्ट बोनी भूलभुलैया में एक सर्पिल आकार में कुंडलित है और श्रवण संवेदी अंत अंग, कोर्टी (ओसी) के अंग रखती है । ओसी बेसिलियर झिल्ली पर टिकी हुई है, जो कॉकलियर एपिथेलियम बना रही है, जिसकी लंबाई लगभग 5.7 मिमी होती है जब वयस्क सीबीए/सीएजे चूहों1,2में अनकॉइल किया जाता है। क्योंकि ओसी को आधार में पाए गए उच्च आवृत्तियों और शीर्ष में कम आवृत्तियों के साथ आयोजित किया जाता है, कॉकलियर एपिथेलियम को अक्सर विश्लेषणात्मक तुलना के लिए तीन भागों में विभाजित किया जाता है: एपिकल, मध्य और बेसल कम करने के लिए संबंधित हो जाता है, मध्य, और उच्च आवृत्ति का पता लगाने, क्रमशः। सहायक कोशिकाओं की एक सरणी के अलावा, ओसी आंतरिक बाल कोशिकाओं (आईएचसी) की एक पंक्ति से बना है जो मध्यस्थ सर्पिल के संबंध में पार्श्व रूप से स्थित बाहरी बाल कोशिकाओं (OHCs) की तीन पंक्तियां स्थित हैं।
सही श्रवण प्रसंस्करण कॉकलिया में संवेदी बाल कोशिकाओं की अखंडता पर निर्भर करता है। संवेदी बाल कोशिकाओं के नुकसान या नुकसान अधिग्रहीत सुनवाई हानि की एक आम रोग सुविधा है, अत्यधिक शोर के संपर्क के रूप में कई etiologies की वजह से, ओटोटॉक्सिक दवाओं का उपयोग, जीवाणु या वायरल कान संक्रमण, सिर चोटों, और उंर बढ़ने प्रोसेस3. इसके अतिरिक्त, आंतरिक बाल कोशिका/श्रवण तंत्रिका सिनेप्स की अखंडता और कार्य हल्के अपमान से बिगड़ा जा सकता है4। आणविक और आनुवंशिक जानकारी की उपलब्धता और नॉकआउट और नॉकआउट तकनीकों द्वारा जीन के हेरफेर के साथ, चूहों व्यापक रूप से विज्ञान सुनवाई में इस्तेमाल किया गया है । यद्यपि वयस्क माउस कॉकललिया मामूली है और कॉकलियर एपिथेलियम एक बोनी कैप्सूल से घिरा हुआ है जिसके परिणामस्वरूप तकनीकी रूप से कठिन माइक्रोडिसेक्शन, इम्यूनोलेबलिंग या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के संयोजन में एपिथेलियम की सतह की तैयारी और कॉन्फोकल इमेजरी का उपयोग मोटे तौर पर कॉकलियर विकृतियों की जांच के लिए किया गया है, जिसमें रिबन सिनेप्स और हेयर सेल्स के नुकसान, संवेदी बालों की कोशिकाओं और सहायक कोशिकाओं और बाल कोशिका उत्थान में प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन शामिल हैं। कॉकलियर सतह की तैयारी का उपयोग रिपोर्टर जीन (यानी जीएफपी) की अभिव्यक्ति के पैटर्न को निर्धारित करने और सफल ट्रांसड्यूक्शन की पुष्टि करने और ट्रांसड्यूड सेल प्रकारों की पहचान करने के लिए भी किया गया है। इन तकनीकों का उपयोग पहले वयस्क सीबीए/जे चूहों5,6,7,8,9का उपयोग करके शोर-प्रेरित सुनवाई हानि में अंतर्निहित आणविक तंत्रों के अध्ययन के लिए किया गया है ।
कॉकलिया के छोटे क्रॉस-सेक्शनल भागों को प्राप्त करने के लिए पैराफिन सेक्शन या क्रायोसेक्शन का उपयोग करने वाले इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के विपरीत जिसमें प्रत्येक खंड पर तीन बाहरी बाल कोशिकाएं (OHCs) और एक आंतरिक हेयर सेल (आईएचसी) होती हैं, कॉकलियर सतह की तैयारी की अनुमति देता है संवेदी बाल कोशिकाओं और रिबन सिनेप्स की गिनती और विशिष्ट कार्यात्मक आवृत्तियों के अनुरूप संवेदी बाल कोशिकाओं की इम्यूनोलेबलिंग के लिए ओसी की पूरी लंबाई का दृश्य। तालिका 1 मुलर1 और विबर्ग और कैनलॉन1,2के अध्ययनों के अनुसार वयस्क सीबीए/जे माउस में कॉकलियर सर्पिल की लंबाई के साथ दूरी के एक समारोह के रूप में सुनवाई आवृत्तियों की मैपिंग को दर्शाता है । कॉकलियर सतह की तैयारी का व्यापक रूप से कॉकलियर विकृतियों4,5,6,7,8,9,10 की जांच के लिए उपयोग किया गया है ,11,12,13,14,15. पूरे माउंट कॉकलियर विच्छेदन विधि मूल रूप से 196616में हंस Engstrom द्वारा संपादित एक पुस्तक में वर्णित किया गया था। बाद में इस तकनीक को परिष्कृत किया गया और विभिन्न प्रजातियों के अनुकूल किया गया जैसा कि विज्ञान10,11,12,13श्रवण में कई वैज्ञानिकों द्वारा साहित्य में वर्णित किया गयाथा , 15,17 और मैसाचुसेट्स आई एंड इयर18में ईटन-पीबॉडी प्रयोगशालाओं द्वारा । हाल ही में, मोंटगोमरी एट अल19द्वारा एक और कॉकलियर विच्छेदन विधि की सूचना दी गई थी । कॉकलियर सतह की तैयारी के लिए कॉकललिया का माइक्रोडिसेक्शन एक आवश्यक और महत्वपूर्ण कदम है। हालांकि, माउस कॉकले को विच्छेदन एक तकनीकी चुनौती है और इसके लिए काफी अभ्यास की आवश्यकता होती है। यहां, वयस्क माउस कॉकले में उपयोग के लिए एक संशोधित कॉकलियर सतह तैयारकरने की विधि प्रस्तुत की जाती है। इस विधि के लिए इम्यूनोलेबलिंग के लिए कॉकलियर एपिथेलियम से 10 मिमी गोल कवरस्लिप तक कॉकलियर एपिथेलियम के टुकड़ों का पालन करने के लिए सेल और ऊतक चिपकने वाले (यानी सेल-टाक) के कैजालिफिकेशन और उपयोग की आवश्यकता होती है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री20के लिए सेल और टिश्यू चिपकने वाला व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है । यह संशोधित कॉकलियर माइक्रोडिसेक्शन विधि18,19की रिपोर्ट की गई तुलना में अपेक्षाकृत सरल है ।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10-mm Rund Coverslips</td>
			<td>Microscopy products for science and industry</td>
			<td>260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboard Micro Slide Trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST fine science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-gel with Tris Buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-myosin VIIa Antibody</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CtBP2 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Glu2R Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100491-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cochlear surface preparation in the adult mouse

कॉकलिया में श्रवण प्रसंस्करण मेचनोसेंसरी बालों की कोशिकाओं की अखंडता पर निर्भर करता है। जीवन भर में, अत्यधिक शोर के संपर्क, ओटोटॉक्सिक दवाओं के उपयोग, बैक्टीरियल या वायरल कान संक्रमण, सिर की चोटों और उम्र बढ़ने की प्रक्रिया जैसे कई एटिओलोजी से सुनवाई हानि प्राप्त की जा सकती है। संवेदी बाल कोशिकाओं का नुकसान अधिग्रहीत सुनवाई हानि की किस्मों की एक आम रोग सुविधा है। इसके अतिरिक्त, आंतरिक बाल कोशिका सिनेप्स हल्के अपमान से क्षतिग्रस्त हो सकता है। इसलिए, इम्यूनोलेबलिंग तकनीकों और कॉन्फोकल इमेजरी के संयोजन में कॉकलियर एपिथेलिया की सतह तैयारी, कॉकलियर विकृतियों की जांच के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है, जिसमें रिबन सिनेप्स और संवेदी बाल कोशिकाओं का नुकसान शामिल है, सफल ट्रांसड्यूक्शन के सत्यापन और ट्रांसड्यूड सेल प्रकारों की पहचान के लिए बाल कोशिकाओं और सहायक कोशिकाओं, बाल कोशिका उत्थान और रिपोर्ट जीन अभिव्यक्ति (यानी, जीएफपी) के निर्धारण में प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन। कोचलिया, आंतरिक कान में एक बोनी सर्पिल के आकार की संरचना, श्रवण संवेदी अंत अंग, कोर्टी (ओसी) के अंग रखती है। ओसी में संवेदी बाल कोशिकाओं और आसपास के सहायक कोशिकाओं को कॉकलियर डक्ट में निहित किया जाता है और बेसिलिसर झिल्ली पर आराम किया जाता है, जो आधार में होने वाली उच्च आवृत्ति का पता लगाने और शीर्ष में कम आवृत्ति के साथ एक टोनोटोपिक फैशन में आयोजित किया जाता है। आणविक और आनुवंशिक जानकारी की उपलब्धता और नॉकआउट और नॉकआउट तकनीकों द्वारा जीन में हेरफेर करने की क्षमता के साथ, चूहों व्यापक रूप से जैविक अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया है, सुनवाई विज्ञान में भी शामिल है । हालांकि, वयस्क माउस कॉकलेया छोटा है, और कॉकलियर एपिथेलियम को बोनी भूलभुलैया में समझाया जाता है, जिससे माइक्रोडिसेक्शन मुश्किल हो जाता है। यद्यपि विच्छेदन तकनीकों को कई प्रयोगशालाओं में विकसित और उपयोग किया गया है, सेल और ऊतक चिपकने वाला का उपयोग करने वाली यह संशोधित माइक्रोडिसेक्शन विधि आसान और अधिक सुविधाजनक है। यह decalcification के बाद वयस्क माउस कॉकले के सभी प्रकार में इस्तेमाल किया जा सकता है।

इम्यूनोलेबलिंग और कॉन्फोकल इमेजिंग के संयोजन में कॉकलियर एपिथेलियम की सतह तैयारी का उपयोग मोटे तौर पर कॉकलियर विकृतियों की जांच के लिए विज्ञान की सुनवाई में किया गया है, जैसे रिबन सिनेप्स, संवेदी बाल ...

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Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

यह लेख एक संशोधित कॉकलियर सतह तैयारकरने की विधि प्रस्तुत करता है जिसमें वयस्क माउस कॉकलेमें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए 10 मिमी गोल कवर स्लिप में कॉकलियर एपिथेलिया के टुकड़ों का पालन करने के लिए एक कोशिका और ऊतक चिपकने वाले के कैकालसिफिकेशन और उपयोग की आवश्यकता होती है।

वयस्क माउस में कॉकलियर सतह तैयारी

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

कॉकलियर सतह की तैयारी इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके कोर्टी के अंग के पूरे लेंस के दृश्य की अनुमति देती है। इसका उपयोग मोटे तौर पर ब्याज की विशिष्ट कॉकलियर विकृतियों की जांच के लिए किया गया है। हम कॉकलियर माइक्रोडिसेक्शन विधि को संशोधित करेंगे।इस तकनीक का मुख्य लाभ कई धोने के चरणों के दौरान ऊतक हानि से बचने के दौरान इम्यूनोलेबेलिंग प्रक्रिया के लिए कॉकलियर एपिथेलियम से 10 मिलीमीटर गोल कवरस्लिप के टुकड़े का पालन करना है। इसके अलावा कॉकलियर विकृतियों, कॉकलियर सतह की तैयारी का उपयोग मूल्यांकन अभिव्यक्ति और हेयर सेल पुनर्जनन के लिए भी किया जा सकता है। इस तकनीक के लिए बुनियादी माइक्रोस्कोप कौशल की आवश्यकता होती है और विधि का दृश्य प्रदर्शन यह सुनिश्चित करने में मदद कर सकता है कि प्रत्येक चरण सही ढंग से किया जाए।प्रक्रिया का प्रदर्शन Qiaojun फेंग, मेरी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा । लौकिक हड्डी निकालने के लिए, तुरंत पोस्टमार्टम खोपड़ी की हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा को पूर्वकाल तक खींचें और खोपड़ी की केंद्र रेखा के साथ पीछे के पहलू से हड्डी को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें। अंगूठे और तर्जनी का उपयोग करने से पहले मस्तिष्क के ऊतकों को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करने के लिए मैन्युअल रूप से चूहों से लौकिक हड्डियों को हटाने के तीन महीने या पुराने ।हड्डियों को 30 मिलीमीटर व्यास पेट्री डिश में रखें जिसमें ताजा बर्फ ठंड 4% पीएफए और पीबीएस एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत और अंडाकार खिड़की से स्टेप्स को हटा दें। नंबर पांच संदंश के साथ गोल खिड़की झिल्ली पंचर और एक 27 गेज एक मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक कॉकलियर सिरिंज का उपयोग करने के लिए cochlea के शीर्ष में एक छोटा सा छेद बनाते हैं । धीरे-धीरे और धीरे-धीरे गोल और अंडाकार खिड़कियों के माध्यम से एक स्थिर समाधान के साथ कॉकलिया को छिद्रित करें जब तक कि समाधान शीर्ष पर छोटे छेद से बाहर न निकल जाए।फिर दो perfused cochleae को व्यक्तिगत 20 मिलीलीटर प्रस्फुटन शीशियों में स्थानांतरित करें जिसमें 4% पीएफए प्रति शीशी के 10 मिलीलीटर होते हैं और धीरे-धीरे कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए नमूनों को उत्तेजित करते हैं, इसके बाद एक रोटेटर पर चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर भंडारण होता है। अगली सुबह, प्रति वॉश ताजा पीबीएस के साथ कॉकली को ३ ५ मिनट की धोता के साथ धोएं । अंतिम धोने के बाद, प्रत्येक शीशी में 4% ईडीटीए के 20 मिलीलीटर जोड़ें और कोमल आंदोलन के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए नमूनों को घुमाएं।इनक्यूबेशन के अंत में, नमूनों की लोच का आकलन करने के लिए प्रत्येक कोचलिया के बोनी वेस्टिबुलर हिस्से को संदंश के साथ स्पर्श करें। यदि हड्डियां दृढ़ होने के बजाय लोचदार हैं, तो कॉकलिया को डिक्लेशेक्ट कर दिया गया है । ताजा पीबीएस के साथ प्रत्येक नमूने के लिए EDTA बदलें।कॉकलियर एपिथेलियम के माइक्रोडिसेक्शन के लिए, शंख हड्डी के वेस्टिबुलर हिस्से को संदंश के साथ समझें और 45 डिग्री कोण पर एपिकल टर्न को काटने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। गोल खिड़की और अंडाकार खिड़की के बीच बेहोश लाइन के साथ खड़ी कट वेस्टिब्यूलर भाग से कॉकली को अलग करने और पेट्री डिश के शीर्ष की ओर नीचे और मध्य मोड़ की ओर बेसल मोड़ के साथ कॉकलियर भाग उन्मुख। इस स्थिति से, अंत की ओर मध्य मोड़ की बोनी कैप्सूल और पार्श्व दीवार को काट दें जिसमें से एपिकल सेक्शन को हटा दिया गया था और बेसल और हुक क्षेत्रों से मध्य भाग को पूरी तरह से अलग करने के लिए काटना जारी रखता है।बेसल और हुक भाग को बेसलर झिल्ली साइट के साथ रखें जो पकवान के नीचे की ओर उन्मुख होते हैं, मध्यस्थता को हटाने के लिए हुक क्षेत्र के मध्यान्हार को काटते हैं और हुक हिस्से को अलग करने के लिए बेसल और हुक क्षेत्रों को काटते हैं। ऊतक की विकृति से बचने के लिए, बेसल टर्न और हुक क्षेत्र के अलग होने से पहले हुक क्षेत्र के मध्यस्थों को काट दें। बोनी कैप्सूल और मध्य मोड़ के पार्श्व दीवार ऊतक के अपेक्षाकृत बड़े हिस्से को काट लें और पेट्री डिश के नीचे बोनी कैप्सूल और पार्श्व दीवार को संरेखित करने के लिए संदंश के साथ पार्श्व दीवार को पकड़ें, इन ऊतकों को बेसिलर झिल्ली की ओर से काट लें।इसके बाद, संवेदी बाल कोशिका सतह की ओर उन्मुख करने के लिए नमूना समतल और बोनी कैप्सूल और पार्श्व दीवार के बाकी दूर ट्रिम । फिर मध्य क्षेत्र को पूरी तरह से अलग करने के लिए टेक्टोरियल झिल्ली को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें और बोनी कैप्सूल, पार्श्व दीवार ऊतक, और शेष मोड़ों के टेक्टोरियल क्षेत्रों को हटा दें जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया है। जब कॉकलियर के सभी बदल जाता है विच्छेदन किया गया है, सेल और ऊतक के ०.५ माइक्रोलीटर एक दौर 10 मिलीमीटर कवरलिप के केंद्र पर चिपकने वाला फैल गया है और चिपकने वाला कमरे के तापमान पर तीन से पांच मिनट के लिए सूखने के लिए अनुमति देते हैं ।सूखे कवरस्लिप को पेट्री डिश में रखें और प्रत्येक संवेदी एपिथेलियम नमूने के सभी चार टुकड़ों को एक कवरस्लिप पर चिपकाएं। फिर इम्यूनोलबेलिंग के लिए चार-अच्छी सेल संस्कृति पकवान के व्यक्तिगत कुओं में नमूनों को स्थानांतरित करने के लिए प्रत्येक कवरस्लिप के एक किनारे को समझने के लिए संदंश का उपयोग करें। सतह कॉकलियर सिनेप्स की तैयारी के इम्यूनोलेबेलिंग के लिए, प्रत्येक संवेदी एपिथेलियम को प्रति वॉश ताजा पीबीएस में पांच मिनट के लिए तीन बार धोएं, इसके बाद प्रत्येक नमूने के उपचार के बाद एक रोटेटर पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 2% गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट के दो मिलीलीटर के साथ प्रत्येक नमूने का उपचार किया जाता है।इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक कुएं से सर्फेक्टेंट समाधान को हटा दें और कमरे के तापमान पर कोमल आंदोलन के साथ रोटेटर पर एक घंटे के लिए समाधान को अवरुद्ध करने के 100 माइक्रोलीटर के साथ किसी भी गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध करें। अवरुद्ध इनक्यूबेशन के अंत में, पीबीएस के साथ तीन बार नमूनों को धोएं जैसा कि प्रकाश से संरक्षित 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक एपिथेलियम लेबलिंग से पहले कोमल आंदोलन के तहत प्रदर्शित किया गया था। अगले दिन, ताजा पीबीएस और कोमल आंदोलन प्रति धोने के साथ तीन बार नमूनों को धोएं और प्रकाश से संरक्षित ३७ डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए ब्याज की उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के १०० माइक्रोलीटर के साथ नमूनों को लेबल करें ।इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक कवरस्लिप को व्यक्तिगत ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखने से पहले प्रति वॉश ताजा पीबीएस में ३ ५ मिनट की वॉश के साथ नमूनों को धोएं । इसके बाद, प्रत्येक कवरस्लिप के केंद्र में एक उपयुक्त बढ़ते माध्यम के आठ माइक्रोलीटर सावधानी से जोड़ें और प्रत्येक नमूने पर एक और 10 मिलीमीटर कवरलिप माउंट करने के लिए संदंश का उपयोग करें। फिर प्रत्येक कवरस्लिप सैंडविच के किनारों को स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील करें, नमूनों को एक कार्डबोर्ड स्लाइड फ़ोल्डर में रखें, और स्लाइड को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।हालांकि सतह की तैयारी के लिए वयस्क माउस कॉकलाई का विच्छेदन सरल नहीं है, तकनीक के लिए नए शोधकर्ताओं को 10 से 15 कानों के साथ अभ्यास करने के बाद विधि सीखने में सक्षम होना चाहिए। सीटीबीपी 2 और ग्लूए2 के साथ अनुपचारित 10 से 12 सप्ताह पुराने सीबीएज चूहों की सतह की तैयारी की इम्यूनोलेबेलिंग यह दर्शाती है कि क्रमशः प्रेस्सिनैप्टिक रिबन और पोस्टसिनैप्टिक टर्मिनल दोनों आंतरिक बाल कोशिका नाभिक के नीचे स्थित हैं और कार्यात्मक सिनेप्स का संकेत देते हैं। मायोसिन 7A के लिए इम्यूनोबेलिंग और फालोडिन और DAPI के साथ काउंटरिंग बाहरी बाल कोशिकाओं और भीतरी बाल कोशिकाओं और उनके नाभिक सहित संवेदी बाल कोशिकाओं की उपस्थिति का पता चलता है ।मायोसिन 7A के लिए इम्यूनोलाबेलिंग और फल्लोइडिन के साथ काउंटरयुक्त होने से कोशिका और ऊतक चिपकने वाले के उपयोग के साथ या बिना इम्यूनोरेएक्टिविटी या एकरूपता में कोई अंतर नहीं दिखाता है। इसके अलावा, अनुपचारित छह से आठ सप्ताह पुराने C57 काले 6 चूहों से सतह की तैयारी के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग नमूने की तीन पंक्तियों में बाहरी बाल कोशिकाओं के एक अच्छी तरह से संगठित वी के आकार का स्टीरियोसिलिया प्रदर्शित करता है । कॉकलियर को धीरे-धीरे और धीरे-धीरे गोल और अंडाकार खिड़कियों के माध्यम से भरना याद रखें जब तक कि समाधान शीर्ष पर छोटे छेद से बाहर न निकल जाए।बेसल मोड़ से हुक क्षेत्र को अलग करने से पहले, मध्यस्थों को हटाने की सुविधा के लिए हुक क्षेत्र के मध्यस्थों को काटने का ध्यान रखें।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

ऊतक और माउस संवेदी तंत्रिका फाइबर त्वचा और अंग की हड्डी Innervating तैयार Immunostaining

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

वयस्क माउस अग्रमस्तिष्क के तीव्र स्लाइस में समय चूक Neuroblast प्रवासन की इमेजिंग

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

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एक<em&gt; इन विट्रो</emवयस्क माउस का myenteric जाल से पृथक आंत्र न्यूरॉन्स और glia की&gt; तैयारी

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

एक<em&gt; इन विट्रो</emस्नायु afferents की गोलीबारी गुणों के लिए अध्ययन&gt; वयस्क माउस स्नायु तंत्रिका तैयारी

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

माउस Cochlear explants की लंबी अवधि के समय चूक इमेजिंग

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

पूरा पर्वत विच्छेदन और वयस्क माउस कोक्लीअ के immunofluorescence

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी ऊतक से प्राथमिक मिश्रित glial संस्कृति की तैयारी

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

एक साधारण एक कदम प्रौढ़ की साबुत माउंट तैयारी के लिए विच्छेदन प्रोटोकॉल<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; दिमाग

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Electrophysiological अध्ययन के लिए वयस्क माउस रेटिना की क्षैतिज स्लाइस की तैयारी

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

जांच स्तनधारी Axon पुनर्जनन: Vivo Electroporation में वयस्क माउस पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...