Name: cochlear surface preparation in the adult mouse
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00
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Il progetto di ricerca descritto è stato sostenuto dalla sovvenzione R01 DC009222 dell'Istituto Nazionale di Sordità e Altri Disturbi della Comunicazione, National Institutes of Health. Questo lavoro è stato condotto nel WR Building di MUSC in uno spazio ristrutturato supportato dalla sovvenzione C06 RR014516. Gli animali erano ospitati in strutture animali MUSC CRI supportate dalla sovvenzione C06 RR015455 dell'Extramural Research Facilities Program del National Center for Research Resources. Gli autori ringraziano il Dr. Jochen Schacht per i suoi preziosi commenti e Andra Talaska per la revisione del manoscritto.

Tutti i protocolli di ricerca che coinvolgevano topi adulti maschi CBA/J all'età di 10-12 settimane e C57BL/6J topi all'età di 6-8 settimane sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Medical University of South Carolina (MUSC). La cura degli animali era sotto la supervisione della Divisione delle risorse animali di laboratorio del MUSC.
 NOT:</</c0> Per le procedure presentate di seguito, i topi sono anestesizzati con ketamina (100 mg/kg)...

<ol>
	<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li><li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss.">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion.">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li><li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK.">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss.">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress.">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses.">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo.">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li><li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+neural+degeneration+with+aging,+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear.">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms.">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 7, 2063 (2016).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Engstr&#246;m, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection.">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).</li><li>. MassEyeAndEar.org Available from: <a target="_blank" href="https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories">https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories</a> (2019)</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea.">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>. Corning Cell Culture Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf</a> (2019)</li><li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li><li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+anatomy+of+the+'hook'+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation.">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li><li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing.">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li><li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death.">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1262 (2014).</li><li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea.">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).</li></ol>

La microdissezione cocleare dei preparati superficiali a montaggio intero in combinazione con l'immunoetichettatura fornisce uno strumento di base per lo studio delle patologie dell'orecchio interno e dei meccanismi molecolari. Questo metodo di dissezione cocleare del topo adulto modificato utilizzando l'adesivo della cellula e del tessuto semplifica questa difficile procedura.
Anche se questo metodo di preparazione della superficie cocleare modificato è relativamente facile e accessibile, ri...

La coclea è dedicata alla rilevazione del suono e responsabile dell'udito. Il condotto cocleare è arrotolato a spirale nel labirinto osseo e detiene l'organo finale sensoriale uditivo, l'organo di Corti (OC). L'OC poggia sulla membrana basilare, che costituisce l'epitelio cocleare, con una lunghezza di circa 5,7 mm quando srotolato nei topi adulti CBA/CaJ1,2. Poiché l'OC è tonotopicamente organizzato con alte frequenze rilevate nella base e nelle basse frequenze nell'apice, l'epitelio cocleare è spesso diviso in tre parti per confronti analitici: i giri apicali, medi e basali corrispondenti a bassi, medio e ad alta frequenza, rispettivamente. Oltre a una serie di cellule di supporto, l'OC è composto da una fila di cellule ciliate interne (IHC) situate medialmente e tre file di cellule ciliate esterne (OHC) situate lateralmente rispetto alla spirale cocleare.
Una corretta elaborazione uditiva dipende dall'integrità delle cellule ciliate sensoriali nella coclea. Il danno o la perdita di cellule ciliate sensoriali è una caratteristica patologica comune della perdita dell'udito acquisita, causata da numerose eziologie come l'esposizione a rumori eccessivi, l'uso di farmaci ototossici, infezioni batteriche o virali dell'orecchio, lesioni alla testa e l'invecchiamento processo3. Inoltre, l'integrità e la funzione delle cellule ciliate interne / sinapsi nervose uditive possono essere compromesse da lievi insulti4. Con la disponibilità di informazioni molecolari e genetiche e la manipolazione dei geni mediante tecniche knockout e knock-in, i topi sono stati ampiamente utilizzati nella scienza dell'udito. Anche se la coclea adulta del topo è minuscola e l'epitelio cocleare è circondato da una capsula ossea con conseguente microdissezioni tecnicamente difficili, le preparazioni superficiali dell'epitelio in combinazione con immunoetichettatura o immunohistochimica e le immagini confocali sono state ampiamente utilizzate per lo studio di patologie cocleari, tra cui perdite di sinapsi a nastro e cellule ciliate, cambiamenti nei livelli di proteine nelle cellule ciliate sensoriali e nelle cellule di supporto, e rigenerazione delle cellule dei capelli. I preparati cocleari sono stati utilizzati anche per determinare il modello di espressione dei geni reporter (ad esempio, GFP) e confermare la trasduzione riuscita e identificare i tipi di cellule trasdotte. Queste tecniche sono state precedentemente utilizzate per lo studio di meccanismi molecolari alla base della perdita dell'udito indotta dal rumore utilizzando topi adulti CBA/J5,6,7,8,9.
A differenza dell'immunohistochimica che utilizza sezioni di paraffina o criosezioni per ottenere piccole porzioni trasversali della coclea che contengono tre cellule ciliate esterne (OHC) e una cellula pilifena interna (IHC) su ogni sezione, i preparati cocleari della superficie visualizzazione dell'intera lunghezza dell'OC per il conteggio delle cellule ciliate sensoriali e delle sinapsi a nastro e l'immunoetichettatura delle cellule ciliate sensoriali corrispondenti a specifiche frequenze funzionali. La tabella 1 mostra la mappatura delle frequenze uditive in funzione della distanza lungo la lunghezza della spirale cocleare nel topo CBA/J adulto secondo gli studi di Muller1 e Viberg e Canlon1,2. I preparati di superficie cocleare sono stati ampiamente utilizzati per lo studio delle patologie cocleari4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. L'intero metodo di dissezione cocleare è stato originariamente descritto in un libro edito da Hans Engstrom nel 196616. Questa tecnica è stata successivamente perfezionata e adattata a una varietà di specie, come descritto nella letteratura da un certo numero di scienziati nell'udito scientifico10,11,12,13, 15,17 e dagli Eaton-Peabody Laboratories presso Massachusetts Eye e Ear18. Recentemente, un altro metodo di dissezione cocleare è stato segnalato da Montgomery et al.19. La microdisezione della coclea è un passo essenziale e critico per le preparazioni della superficie cocleare. Tuttavia, la dissezione delle cocleari di topi è una sfida tecnica e richiede una pratica considerevole. Qui, viene presentato un metodo di preparazione della superficie cocleare modificato per l'uso nelle cocleae dei topi adulti. Questo metodo richiede la decalcificazione e l'uso di adesivi cellulari e tissutali (ad esempio, Cell-Tak) per aderire ai pezzi di epitelio cocleare a 10 mm rotazioni rotonde per l'immunoetichettatura. L'adesivo per cellule e tessuti è stato ampiamente utilizzato per l'immunoistochimica20. Questo metodo di microdissezione cocleare modificato è relativamente semplice rispetto a quelli precedentemente riportati18,19.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10-mm Rund Coverslips</td>
			<td>Microscopy products for science and industry</td>
			<td>260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboard Micro Slide Trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST fine science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-gel with Tris Buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-myosin VIIa Antibody</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CtBP2 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Glu2R Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100491-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cochlear surface preparation in the adult mouse

L'elaborazione uditiva nella coclea dipende dall'integrità delle cellule ciliate meccanosensoriali. Nel corso della vita, la perdita dell'udito può essere acquisita da numerose eziologie come l'esposizione a rumori eccessivi, l'uso di farmaci ototossici, infezioni batteriche o virali dell'orecchio, lesioni alla testa, e il processo di invecchiamento. La perdita di cellule ciliate sensoriali è una caratteristica patologica comune delle varietà di perdita dell'udito acquisita. Inoltre, la sinapsi delle cellule ciliate interne può essere danneggiata da lievi insulti. Pertanto, i preparati superficiali di epiteli cocleari, in combinazione con tecniche di immunoetichettatura e immagini confocali, sono uno strumento molto utile per lo studio di patologie cocleari, tra cui perdite di sinapsi del nastro e cellule ciliate sensoriali, cambiamenti nei livelli di proteine nelle cellule ciliate e nelle cellule di supporto, rigenerazione delle cellule dei capelli e determinazione dell'espressione genica del rapporto (cioè GFP) per la verifica della trasduzione e l'identificazione dei tipi di cellule trasdotte. La coclea, una struttura a spirale osa nell'orecchio interno, contiene l'organo finale sensoriale uditivo, l'organo di Corti (OC). Le cellule ciliate sensoriali e le cellule portante circostanti nell'OC sono contenute nel condotto cocleare e poggiano sulla membrana basilare, organizzate in modo tonotopico con rilevamento ad alta frequenza che si verifica nella base e a bassa frequenza nell'apice. Con la disponibilità di informazioni molecolari e genetiche e la capacità di manipolare i geni mediante tecniche di knockout e knock-in, i topi sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca biologica, anche nella scienza dell'udito. Tuttavia, la coclea adulta del topo è minuscola, e l'epitelio cocleare è incapsulato in un labirinto osseo, rendendo difficile la microdissezione. Anche se le tecniche di dissezione sono state sviluppate e utilizzate in molti laboratori, questo metodo di microdissezione modificato utilizzando l'adesivo per cellule e tessuti è più facile e più conveniente. Può essere utilizzato in tutti i tipi di cocleari di topi adulti dopo la decalcificazione.

I preparati superficiali dell'epitelio cocleare, in combinazione con l'immunoetichettatura e l'imaging confocale, sono stati ampiamente utilizzati nella scienza dell'udito per lo studio di patologie cocleari, come la quantificazione delle sinapsi del nastro, le cellule ciliate sensoriali, ed espressione proteica nelle cellule ciliate sensoriali5,6,7,8. Anche se la dissezione delle cocleari di t...

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Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Questo articolo presenta un metodo di preparazione della superficie cocleare modificato che richiede la decalcificazione e l'uso di un adesivo per cellule e tessuti per aderire i pezzi di epitemi cocleari a 10 mm rotondi schede di copertura per l'immunostochimica nelle cocleee di topo adulto.

Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

I preparati superficiali cocleari consentono la visualizzazione dell'intera lente dell'organo di Corti utilizzando immunoistochimica e imaging confocale. È stato ampiamente utilizzato per lo studio di specifiche patologie cocleari di interesse. Modificheremo il metodo della microdisezione cocleare.Il principale vantaggio di questa tecnica è l'aderenza di un pezzo di epitelio cocleare a coverlips rotondi da 10 millimetri per la procedura di immunoetichettatura evitando la perdita di tessuto durante le molteplici fasi di lavaggio. Oltre alle patologie cocleari, la preparazione della superficie cocleare può anche essere utilizzata per l'espressione di valutazione e la rigenerazione delle cellule ciliate. Per questa tecnica sono necessarie competenze al microscopio di base e la dimostrazione visiva del metodo può aiutare a garantire che ogni passaggio sia eseguito correttamente.A dimostrare la procedura sarà Qiaojun Fang, uno studente laureato del mio laboratorio. Per l'estrazione temporale delle ossa, tirare immediatamente la pelle anteriormente per esporre l'osso del cranio e utilizzare le forbici per tagliare l'osso dall'aspetto posteriore in avanti lungo la linea centrale del cranio. Utilizzare le forcep per rimuovere il tessuto cerebrale prima di utilizzare il pollice e l'indice per rimuovere manualmente le ossa temporali dai topi di età tre mesi o più.Posizionare le ossa in una piastra di Petri di 30 millimetri di diametro contenente ghiaccio fresco freddo 4%PFA e PBS sotto un microscopio a dissezione e rimuovere le stapes dalla finestra ovale. Forare la membrana della finestra rotonda con pinzosa numero cinque e utilizzare un ago calibro 27 attaccato a una siringa millilitro contenente pfa fresco al 4% per fare un piccolo foro nell'apice della coclea. Perfondere delicatamente e lentamente la cochlea con una soluzione fissante attraverso le finestre rotonde e ovali fino a quando la soluzione non esce dal piccolo foro all'apice.Quindi trasferire fino a due coclleae perfuse in singole fiale a scintillazione da 20 millilitri contenenti 10 millilitri di 4%PFA per flaconcino e agitare delicatamente i campioni per due ore a temperatura ambiente, seguita da conservazione notturna a quattro gradi Celsius su un rotatore. La mattina seguente, lavare le cochleae con tre lavaggi di cinque minuti con PBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 20 millilitri di 4%EDTA a ciascuna fiala e ruotare i campioni per 48 ore a quattro gradi Celsius con delicata agitazione.Al termine dell'incubazione, toccare la porzione vestibolare ossea di ogni coclea con forceps per valutare l'elasticità dei campioni. Se le ossa sono elastiche piuttosto che ferme, i coclea sono stati decalcificati. Sostituire l'EDTA per ogni campione con PBS fresco.Per la microdisezione dell'epitelio cocleare, afferrare la porzione vestibolare dell'osso temporale con le forcep e utilizzare un bisturi per tagliare la rotazione apicale con un angolo di 45 gradi. Tagliare verticalmente lungo la debole linea tra la finestra rotonda e la finestra ovale per separare la coclea dalla porzione vestibolare e orientare la porzione cocleare con la svolta basale verso il basso e il centro gira verso la parte superiore della piastra di Petri. Da questa posizione, tagliare la capsula ossea e la parete laterale della curva centrale verso l'estremità da cui è stata rimossa la sezione apicale e continuare a tagliare per separare completamente la porzione centrale dalle regioni basale e uncino.Posizionando la porzione basale e uncino con il sito della membrana basilare orientato verso il fondo del piatto, tagliare verticalmente la medialis dalla regione del gancio per rimuovere la medialis e tagliare le regioni basali e uncino per separare la porzione di gancio. Per evitare distorsioni del tessuto, tagliare la medialis dalla regione del gancio prima della separazione della curva basale e della regione del gancio. Tagliare le porzioni relativamente grandi della capsula ossea e del tessuto della parete laterale della curva centrale e tenere la parete laterale con le forcep per allineare la capsula ossea e la parete laterale con il fondo della piastra di Petri, tagliare questi tessuti dal lato della membrana basilare.Quindi, appiattire il campione per orientare il lato della superficie sensoriale della cellula capillare verso l'alto e tagliare via il resto della capsula ossea e della parete laterale. Quindi utilizzare le forcelle per rimuovere la membrana tectoriale per separare completamente la regione centrale e rimuovere la capsula ossea, il tessuto della parete laterale e le regioni tectoriali delle curve rimanenti come appena dimostrato. Una volta sezionate tutte le curve cocleari, stendere 0,5 microlitri di adesivo cellulare e tissutale al centro di un coperchio rotondo di 10 millimetri e lasciare asciugare l'adesivo per tre o cinque minuti a temperatura ambiente.Posizionare le coverlips essiccate nella piastra di Petri e attaccare tutti e quattro i pezzi di ogni campione di epitelio sensoriale su un coperchio. Quindi utilizzare le forcep per afferrare un bordo di ogni coverlip per trasferire i campioni in singoli pozzi di un piatto di coltura cellulare a quattro pozzi per l'immunoetichettatura. Per l'immunoetichettatura dei preparati di sinapsi cocleare superficiale, lavare ogni epitelio sensoriale tre volte per cinque minuti in PBS fresco per lavaggio, seguito dal trattamento di ciascun campione con due millilitri del 2% di tensioattivo non ionico per 30 minuti a temperatura ambiente su un rotatore.Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione tensioattiva da ogni pozzo e bloccare qualsiasi legame non specifico con 100 microlitri di soluzione di blocco per bene per un'ora sul rotatore con delicata agitazione a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione di blocco, lavare i campioni tre volte con PBS come dimostrato sotto delicata agitazione prima di etichettare ogni epitelio con 100 microlitri degli anticorpi primari di interesse per 24 ore a 37 gradi Celsius protetti dalla luce. Il giorno successivo, lavare i campioni tre volte con PBS fresco e agitazione delicata per lavaggio ed etichettare i campioni con 100 microlitri degli anticorpi secondari appropriati di interesse per due ore a 37 gradi Celsius protetti dalla luce.Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con tre lavaggi di cinque minuti in PBS fresco per lavaggio prima di posizionare ogni coverlip su singoli vetrini al microscopio di vetro con i campioni rivolti verso l'alto. Successivamente, aggiungere con cura otto microlitri di un mezzo di montaggio appropriato al centro di ogni coverlip e utilizzare le forcep per montare un altro coverslip di 10 millimetri su ciascun campione. Quindi sigillare i lati di ogni sandwich di coverlip con smalto chiaro, posizionare i campioni in una cartella di diapositive di cartone e conservare le diapositive a quattro gradi Celsius.Sebbene la dissezione delle cocleae di topo adulte per i preparati superficiali non sia semplice, i ricercatori nuovi alla tecnica dovrebbero essere in grado di imparare il metodo dopo aver praticato con 10-15 orecchie. L'immunoetichettatura dei preparati superficiali di topi CBAJ non trattati di 10-12 settimane con CTBP2 e GluA2 dimostra che sia i nastri presnaptici che i terminali postsinaptici si trovano rispettivamente sotto i nuclei interni delle cellule ciliate e sono giustapposti indicando sinapsi funzionali. L'immunoetichettatura per la miosina 7A e la contromanifestazione con phalloidina e DAPI rivela la presenza di cellule ciliate sensoriali tra cui le cellule ciliate esterne e le cellule ciliate interne e i loro nuclei.L'immunoetichettatura per la miosina 7A e la contromanifestazione con phalloidina non mostra differenze nell'immunoreattività o uniformità con o senza l'uso di adesivo cellulare e tissutale. Inoltre, la microscopia elettronica a scansione di preparati superficiali da topi C57 black 6 non trattati di sei-otto settimane dimostra una stereocilia ben organizzata a forma di V delle cellule ciliate esterne in tre file del campione. Ricordarsi di riempire il cocleare con soluzione fissante delicatamente e lentamente attraverso le finestre rotonde e ovali fino a quando la soluzione non esce dal piccolo foro all'apice.Prima di separare la regione del gancio dalla curva basale, fare attenzione a tagliare la medialis fuori dalla regione del gancio per facilitare la rimozione della medialis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

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Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Ricerca

Neuroscienze

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

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An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

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Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

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