Name: cochlear surface preparation in the adult mouse
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

Forskningsprosjektet beskrevet ble støttet av stipend R01 DC009222 fra National Institute on døvhet og andre kommunikasjons forstyrrelser, National Institutes of Health. Dette arbeidet ble gjennomført i WR Building på MUSC i renovert plass støttes av stipend C06 RR014516. Dyr ble plassert i MUSC CRI dyr anlegg støttes av stipend C06 RR015455 fra ekstra Research fasiliteter program av National Center for Research Resources. Forfatterne takker Dr. Jochen Schacht for hans verdifulle kommentarer og Andra Talaska for korrekturlesing av manuskriptet.

Alle forsknings protokoller som involverer mannlig voksen CBA/J mus i alderen 10-12 uker og C57BL/6J mus i alderen 6-8 uker ble godkjent av institusjonelle Animal Care and use Committee (IACUC) ved Medical University of South Carolina (MUSC). Animal omsorg var under tilsyn av delingen av laboratorium Animal Resources på MUSC.
Merk: For prosedyrene som presenteres nedenfor, er mus anesthetized med ketamin (100 mg/kg) og xylazine (10 mg/kg) via intraperitoneal injeksjoner. Mus ...

<ol>
	<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li><li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss.">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion.">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li><li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK.">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss.">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress.">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses.">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo.">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li><li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+neural+degeneration+with+aging,+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear.">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms.">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 7, 2063 (2016).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Engstr&#246;m, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection.">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).</li><li>. MassEyeAndEar.org Available from: <a target="_blank" href="https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories">https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories</a> (2019)</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea.">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>. Corning Cell Culture Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf</a> (2019)</li><li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li><li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+anatomy+of+the+'hook'+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation.">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li><li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing.">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li><li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death.">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1262 (2014).</li><li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea.">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).</li></ol>

Cochlear-microdissection av overflate forberedelser i kombinasjon med immunolabeling gir et grunnleggende verktøy for etterforskning av indre øre sykdommer og molekylære mekanismer. Denne modifiserte voksen musen cochlear disseksjon metoden ved hjelp av celle og vev limet forenkler denne vanskelige prosedyren.
Selv om denne endrede cochlear forbehandling metoden er relativt enkel og tilgjengelig, krever det fortsatt praksis for å oppnå ferdigheter. For å gjøre de riktige kuttene, trenge...

Cochlea er dedikert til påvisning av lyd og ansvarlig for hørsel. Cochlea-kanalen er spiral i en spiralform i bein labyrinten og holder hørsels sensorisk ende organ, orgelet i Corti (OC). OC hviler på basilar membranen, noe som gjør opp cochlear epitel, med en lengde på ca 5,7 mm når rulles i voksen CBA/CaJ mus1,2. Fordi OC er tonotopically organisert med høye frekvenser oppdages i basen og lave frekvenser i Apex, er cochlear epitel ofte delt inn i tre deler for analytiske sammenligninger: Den apikale, midtre og basale svinger tilsvarende lav, Middels, og høy frekvens deteksjon, henholdsvis. I tillegg til en rekke støtte celler, er OC sammensatt av en rad med indre hårceller (IHCs) som ligger anteriort og tre rader med ytre hårceller (OHCs) som ligger sidelengs med hensyn til cochlear spiral.
Riktig hørselsbehandling avhenger av integriteten til de sensoriske hårcellene i sneglehuset. Skade på eller tap av sensoriske hårceller er en vanlig patologisk funksjon av ervervet hørselstap, forårsaket av en rekke årsaker som for eksempel eksponering for overdreven støy, bruk av ototoxic medisiner, bakteriell eller viral øret infeksjoner, hodeskader, og den aldrende prosess3. I tillegg kan integriteten og funksjonen til det indre hår celle/hørselsnerven synapser svekkes av milde fornærmelser4. Med tilgjengeligheten av molekylær og genetisk informasjon og manipulering av gener ved knockout og knock-in teknikker, har mus vært mye brukt i hørsel vitenskap. Selv om den voksne musen cochlea er ørsmå og cochlear epitel er omgitt av en bein kapsel som resulterer i teknisk vanskelig microdissections, overflate preparater av epitel i kombinasjon med immunolabeling eller immunhistokjemi og konfokalmikroskopi bilder har blitt brukt i stor grad for undersøkelse av cochlear patologi, inkludert tap av bånd synapser og hårceller, endringer i nivåer av proteiner i sensoriske hårceller og støtte celler, og hår celle regenerering. Cochlear overflate forberedelser har også blitt brukt til å bestemme mønsteret for uttrykk for reporter gener (dvs. GFP) og bekrefte vellykket Transduction og identifisere transduced celletyper. Disse teknikkene har tidligere blitt brukt til studiet av molekylære mekanismer underliggende støy-indusert hørselstap ved hjelp av voksen CBA/J mus5,6,7,8,9.
I motsetning til immunhistokjemi som bruker para fin seksjoner eller cryosections for å oppnå små tverrsnitt deler av cochlea som inneholder tre ytre hårceller (OHCs) og en indre hår celle (IHC) på hver del, tillater visualisering av hele lengden av OC for telling av sensoriske hårceller og bånd synapser og immunolabeling av sensoriske hårceller som tilsvarer spesifikke funksjonelle frekvenser. Tabell 1 viser kartlegging av hørsel frekvenser som en funksjon av avstand langs lengden av cochlear spiral i voksen CBA/J Mouse Ifølge studier fra Muller1 og Viberg og Canlon1,2. Cochlear Surface-preparater har blitt mye brukt til undersøkelse av cochlear patologi4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Den hel-Mount cochlear disseksjon metoden ble opprinnelig beskrevet i en bok redigert av hans Engstrom i 196616. Denne teknikken ble senere raffinert og tilpasset en rekke arter som beskrevet i litteraturen av en rekke forskere i høring Science10,12,13, 15,17 og ved Eaton-Peabody Laboratories ved Massachusetts Eye og Ear18. Nylig ble en annen cochlear disseksjon metode rapportert av Montgomery et al.19. Microdissection av cochlea er et viktig og kritisk trinn for forberedelser til overflate forberedelse av cochlea. Imidlertid, dissekere musen cochleae er en teknisk angripe og behøver betydelig praksis. Her presenteres en modifisert cochlear overflate forberedelse metoden for bruk i voksen mus cochleae. Denne metoden krever Avkalking og bruk av celle og vev lim (dvs. Cell-tak) for å overholde bitene av cochlear epitel til 10 mm runde coverslips for immunolabeling. Celle og vev limet har vært mye brukt for immunhistokjemi20. Denne modifiserte cochlear microdissection-metoden er relativt enkel sammenlignet med de tidligere rapporterte18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-mm Rund Coverslips</td>
			<td>Microscopy products for science and industry</td>
			<td>260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboard Micro Slide Trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST fine science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-gel with Tris Buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-myosin VIIa Antibody</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CtBP2 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Glu2R Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100491-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cochlear surface preparation in the adult mouse

Hørselsbehandling i sneglehuset avhenger av integriteten til de mechanosensory hårcellene. Over en levetid, hørselstap kan skaffes fra mange årsaker som eksponering for overdreven støy, bruk av ototoxic medisiner, bakteriell eller viral øret infeksjoner, hodeskader, og aldringsprosessen. Tap av sensoriske hårceller er en vanlig patologisk funksjon i varianter av ervervet hørselstap. I tillegg kan den indre hår celle synapse bli skadet av milde fornærmelser. Derfor er overflate preparater av cochlear prolifererende, i kombinasjon med immunolabeling teknikker og konfokalmikroskopi bilder, et svært nyttig verktøy for etterforskning av cochlear patologi, inkludert tap av bånd synapser og sanse hårceller, endringer i proteinnivåer i hårceller og støtte celler, hår celle regenerering, og fastsettelse av rapport genuttrykk (dvs. GFP) for verifisering av vellykket Transduction og identifisering av transduced celletyper. Cochlea, en tynn spiral-formet struktur i det indre øret, holder hørsels sensorisk ende organ, orgelet i Corti (OC). Sensoriske hårceller og omkringliggende støtte celler i OC finnes i cochlea-kanalen og hviler på basilar membranen, organisert i en tonotopic mote med høyfrekvent deteksjon som forekommer i basen og lav frekvens i Apex. Med tilgjengeligheten av molekylær og genetisk informasjon og evnen til å manipulere gener ved knockout og knock-in teknikker, har mus vært mye brukt i biologisk forskning, blant annet i hørsels vitenskap. Men den voksne musen cochlea er minimale, og cochlear epitel er innkapslet i en tynn labyrint, noe som gjør microdissection vanskelig. Selv om disseksjon teknikker har blitt utviklet og brukt i mange laboratorier, er denne modifiserte microdissection metoden ved hjelp av celle og vev lim enklere og mer praktisk. Den kan brukes i alle typer voksen mus cochleae følgende Avkalking.

Overflate preparater av cochlea-epitel, i kombinasjon med immunolabeling og konfokalmikroskopi avbildning, har blitt brukt i stor grad i hørsels vitenskap for etterforskning av cochlea-patologi, slik som kvantifisering av bånd synapser, sanse hårceller, og protein uttrykk i sensoriske hårceller5,6,7,8. Selv om Disseksjon av voksen mus cochleae for overflate forberedelser er ikke enkel, nye ...

Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Denne artikkelen presenterer en modifisert cochlear overflate Forberedelses metode som krever Avkalking og bruk av en celle og vev lim for å overholde deler av cochlear prolifererende til 10 mm runde deksel slips for immunhistokjemi i voksen mus cochleae.

Cochlear forbehandling i voksen mus

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Cochlea overflatepreparater tillater visualisering av hele linsen av organet i Corti ved hjelp av immunohistochemistry og konfokal avbildning. Det har blitt bredt brukt til undersøkelse av spesifikke cochleapatologier av interesse. Vi vil endre cochlea mikrodisseksjonsmetoden.Den største fordelen med denne teknikken er tilslutning av et stykke cochlea epitel til 10 millimeter runde dekkslepper for immunolabeling prosedyren samtidig unngå vevstap under flere vasketrinn. I tillegg kan cochleapatologier, cochleaoverflatepreparat også benyttes til vurderingsuttrykk og hårcelleregenerering. Grunnleggende mikroskopferdigheter er nødvendig for denne teknikken, og visuell demonstrasjon av metoden kan bidra til å sikre at hvert trinn utføres riktig.Å demonstrere prosedyren vil være Qiaojun Fang, en utdannet student fra laboratoriet mitt. For temporal bein ekstraksjon, umiddelbart post-mortem trekke huden fremre for å utsette skallen bein og bruke saks for å kutte beinet fra bakre aspekt fremover langs midtlinjen av skallen. Bruk tang til å fjerne hjernevevet før du bruker tommelen og pekefingeren til å manuelt fjerne temporale bein fra mus tre måneder eller eldre.Legg beinene i en petriskål med 30 millimeter diameter som inneholder frisk iskald 4% PFA og PBS under et disseksjonsmikroskop og fjern stiftene fra det ovale vinduet. Punkter den runde vindusmembranen med nummer fem tang og bruk en 27 gauge nål festet til en en en milliliter sprøyte som inneholder friske 4% PFA for å lage et lite hull i toppen av sneglehuset. Forsiktig og sakte perfuse sneglehuset med en fikseringsløsning via runde og ovale vinduer til løsningen vasker ut av det lille hullet på toppunktet.Deretter overfører du opptil to perfused cochlea til individuelle 20 milliliter scintillation hetteglass som inneholder 10 milliliter 4% PFA per hetteglass og forsiktig agiter prøvene i to timer ved romtemperatur, etterfulgt av overnatting lagring ved fire grader Celsius på en rotator. Neste morgen vasker du sneglehuset med tre fem minutters vasker med frisk PBS per vask. Etter siste vask, tilsett 20 milliliter 4% EDTA til hvert hetteglass og roter prøvene i 48 timer ved fire grader Celsius med mild agitasjon.På slutten av inkubasjonen berører du den benete vestibulære delen av hvert sneglerør med tang for å vurdere elastisiteten til prøvene. Hvis beinene er elastiske i stedet for fast, har sneglehuset blitt avkalket. Bytt ut EDTA for hver prøve med fersk PBS.For mikrodisseksjon av cochlea epitelet, ta tak i den vestibulære delen av det timelige beinet med tang og bruk en skalpell for å kutte den apiske svingen i en 45 graders vinkel. Skjær vertikalt langs den svake linjen mellom det runde vinduet og det ovale vinduet for å skille sneglehuset fra den vestibulære delen og orientere cochleadelen med basalsvingen mot bunnen og midten svinger mot toppen av petriskålen. Fra denne posisjonen, kutt benete kapsel og lateral vegg av den midterste svingen mot slutten som den apikale delen ble fjernet og fortsett å kutte for å helt skille den midterste delen fra basal- og krokområdene.Plassere basal og krok delen med basilær membran området orientert mot bunnen av parabolen, vertikalt kutte medialis av kroken regionen for å fjerne medialis og kutte basal og krok områder for å skille kroken delen. For å unngå forvrengning av vevet, kutt medialis av krokområdet før separasjon av basal sving og krokregion. Skjær bort de relativt store delene av benete kapsel og lateral veggvev i midten sving og holder sideveggen med tang for å justere benete kapsel og lateral vegg med bunnen av Petri parabolen, kutte disse vev fra basilær membran side.Deretter flater du prøven for å orientere den sensoriske hårcelleoverflaten med side opp og trimme bort resten av benete kapselen og sideveggen. Bruk deretter tang for å fjerne den tectoriale membranen for å fullstendig skille den midterste regionen og fjerne benete kapsel, lateral veggvev og tectorial regioner av de resterende svingene som nettopp demonstrert. Når alle cochleasvingene er dissekert, spred 0,5 mikroliter celle- og vevslim på midten av en rund 10 millimeter dekkslipp og la limet tørke i tre til fem minutter ved romtemperatur.Legg de tørkede dekkslipper i petriskålen og stikke alle fire delene av hver sensoriske epitelprøve på en dekkslip. Bruk deretter tang til å gripe en kant av hver dekkslips for å overføre prøvene til individuelle brønner av en fire-brønns cellekulturrett for immunolabeling. For immunolabeling av overflatekochleasynapsepreparater, vask hvert sensoriske epitel tre ganger i fem minutter i frisk PBS per vask, etterfulgt av behandling av hver prøve med to milliliter på 2% ikke-ionisk overflateaktivt middel i 30 minutter ved romtemperatur på en rotator.På slutten av inkubasjonen, aspirer overflateaktivt middel løsning fra hver brønn og blokkere eventuelle uspesifikke binding med 100 mikroliter blokkerer løsning per brønn i en time på rotatoren med mild agitasjon ved romtemperatur. På slutten av blokkeringsinkubasjonen vask prøvene tre ganger med PBS som demonstrert under mild agitasjon før merking av hvert epitel med 100 mikroliter av de primære antistoffene av interesse i 24 timer ved 37 grader Celsius beskyttet mot lys. Neste dag vask prøvene tre ganger med fersk PBS og mild agitasjon per vask og merk prøvene med 100 mikroliter av de aktuelle sekundære antistoffene av interesse i to timer ved 37 grader Celsius beskyttet mot lys.På slutten av inkubasjonen vask prøvene med tre fem minutters vasker i fersk PBS per vask før du plasserer hver dekkslip på individuelle glassmikroskoplyser med prøvene vendt opp. Deretter legger du forsiktig til åtte mikroliter av et passende monteringsmedium i midten av hver dekkslipp og bruker tang til å montere en annen 10 millimeter deksler på hver prøve. Deretter forsegler du sidene av hver coverslip sandwich med klar neglelakk, plasser prøvene i en papplysbildemappe, og lagre lysbildene på fire grader Celsius.Selv om disseksjon av voksen mus cochlea for overflatepreparater er ikke enkelt, bør forskere som er nye i teknikken kunne lære metoden etter å ha praktisert med 10 til 15 ører. Immunolabeling av overflatepreparater av ubehandlede 10 til 12 uker gamle CBAJ-mus med CTBP2 og GluA2 viser at både presynaptiske bånd og postsynaptiske terminaler ligger under de indre hårcellekjernene og er sidestilt som indikerer funksjonelle synapser. Immunolabeling for myosin 7A og motstaining med falloidin og DAPI avslører tilstedeværelsen av sensoriske hårceller, inkludert de ytre hårcellene og indre hårceller og deres kjerner.Immunolabeling for myosin 7A og motstaining med falloidin viser ingen forskjeller i immunoreaktivitet eller ensartethet med eller uten bruk av celle- og vevslim. I tillegg viser skanning av elektronmikroskopi av overflatepreparater fra ubehandlede seks til åtte uker gamle C57 svarte 6-mus en velorganisert V-formet stereocilia av ytre hårceller i tre rader av prøven. Husk å fylle cochlea med fikseringsmiddelløsning forsiktig og sakte gjennom de runde og ovale vinduene til løsningen vasker ut av det lille hullet på toppunktet.Før du skiller krokområdet fra basalsvingen, må du være forsiktig med å kutte medialis av krokområdet for å lette fjerningen av medialisen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Preparering og farging av Mouse Sensoriske nervefibre Innervating Hud og Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse Imaging av Neuroblast Migrasjon i Akutt Skiver av Adult Mouse forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

En<em&gt; In-vitro</em&gt; Utarbeidelse av Isolerte Enteriske nevroner og gliaceller fra myenteric Plexus av Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Adult Mouse Muskel-nerve Forberedelse til Studerer avfyring egenskaper Muscle afferenter

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langsiktig Time Lapse Imaging av Mouse Cochlea eksplantater

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hele Mount Dissection og Immunfluorescens av Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Utarbeidelse av Primary Mixed Glial kulturer fra Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel ett-trinns Dissection Protokoll for Whole-mount Utarbeidelse av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Utarbeidelse av Horisontale Skiver av Adult Mouse Retina for Elektro Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Undersøker pattedyr Axon gjenfødelse: I Vivo Electroporation av voksen mus Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...