Name: cochlear surface preparation in the adult mouse
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00
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O projeto de pesquisa descrito foi apoiado pela concessão R01 DC0009222 do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios da Comunicação, Institutos Nacionais de Saúde. Este trabalho foi realizado no Edifício WR no MUSC em espaço renovado apoiado pela concessão C06 RR014516. Os animais foram alojados em instalações animais MUSC CRI apoiadas pela concessão C06 RR015455 do Programa de Instalações de Pesquisa Extramural do Centro Nacional de Recursos de Pesquisa. Os autores agradecem ao Dr. Jochen Schacht por seus comentários valiosos e Andra Talaska pela revisão do manuscrito.

Todos os protocolos de pesquisa envolvendo camundongos CBA/J adultos do sexo masculino com idades entre 10 e 12 semanas e camundongos C57BL/6J com idades entre 6 e 8 semanas foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade Médica da Carolina do Sul (MUSC). O cuidado animal estava a supervisão da divisão de recursos animais do laboratório em MUSC.
Nota: Para os procedimentos apresentados abaixo, os camundongos são anestesiados com ce...

<ol>
	<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li><li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss.">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion.">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li><li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK.">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss.">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress.">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses.">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo.">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li><li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+neural+degeneration+with+aging,+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear.">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms.">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 7, 2063 (2016).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Engstr&#246;m, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection.">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).</li><li>. MassEyeAndEar.org Available from: <a target="_blank" href="https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories">https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories</a> (2019)</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea.">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>. Corning Cell Culture Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf</a> (2019)</li><li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li><li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+anatomy+of+the+'hook'+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation.">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li><li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing.">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li><li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death.">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1262 (2014).</li><li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea.">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).</li></ol>

A microdissecção coclearde de preparações de superfície de montagem inteira em combinação com imunorotulagem fornece uma ferramenta básica para a investigação de patologias do ouvido interno e mecanismos moleculares. Este método de dissecção coclear adulto modificado do rato usando o adesivo da pilha e do tecido simplifica este procedimento difícil.
Embora este método de preparação coclear modificado da superfície seja relativamente fácil e acessível, ainda exige a prática...

A cóconlea é dedicada à detecção de som e responsável pela audição. O duto coclear é enrolado em forma espiral no labirinto ósseo e contém o órgão auditivo da extremidade sensorial, o órgão de Corti (OC). O OC repousa sobre a membrana basilar, tornando-se o epitélio coclear, com um comprimento de cerca de 5,7 mm quando desenrolado em adultos CBA / CaJ ratos1,2. Como o OC é organizado tonotópicamente com altas frequências detectadas na base e baixas frequências no ápice, o epitélio coclear é muitas vezes dividido em três partes para comparações analíticas: as voltas apical, média e basal correspondentes a baixa, detecção média e de alta frequência, respectivamente. Além de uma variedade de células de apoio, o OC é composto por uma fileira de células ciliadas internas (IHCs) localizadas medialmente e três fileiras de células ciliadas externas (OHCs) localizadas lateralmente no que diz respeito à espiral coclear.
O processamento auditivo correto depende da integridade das células ciliadas sensoriais na cóconlea. Danos ou perda de células ciliais sensoriais é uma característica patológica comum da perda auditiva adquirida, causada por inúmeras etiologias, como exposição ao ruído excessivo, o uso de medicamentos ototóxicos, infecções bacterianas ou virais no ouvido, lesões na cabeça e o envelhecimento processo3. Além disso, a integridade e função da célula ciliada interna / sinapses nervosas auditivas podem ser prejudicadas por insultos leves4. Com a disponibilidade de informações moleculares e genéticas e manipulação de genes por nocaute e técnicas de knock-in, os ratos têm sido amplamente utilizados na ciência auditiva. Embora a cócrolea de camundongo adulto seja minúscula e o epitélio coclear seja cercado por uma cápsula óssea, resultando em microdisseses tecnicamente difíceis, preparações superficiais do epitélio em combinação com imunorotulagem ou imunohistoquímica e imagens confocais têm sido amplamente utilizadas para investigação de patologias cocleares, incluindo perdas de sinapses de fita e células ciliadas, alterações nos níveis de proteínas nas células ciliadas sensoriais e células de apoio, e regeneração de células ciliadas. As preparações da superfície coclear também têm sido usadas para determinar o padrão de expressão de genes de repórter (ou seja, GFP) e confirmar a transdução bem-sucedida e identificar tipos de células transinduzidas. Essas técnicas têm sido usadas anteriormente para o estudo de mecanismos moleculares subjacentes à perda auditiva induzida pelo ruído usando camundongos ADULTOS CBA/J5,6,7,8,9.
Ao contrário da imunohistoquímica usando seções de parafina ou criosecção para obter pequenas porções transversais da córcia que contêm três células ciliadas externas (OHCs) e uma célula ciliada interna (IHC) em cada seção, as preparações da superfície coclear visualização de todo o comprimento do OC para a contagem de células ciliadas sensoriais e sinapses de fita e imunorotulagem de células ciliadas sensoriais correspondentes a freqüências funcionais específicas. A Tabela 1 mostra o mapeamento das frequências auditivas em função da distância ao longo do comprimento da espiral coclear em camundongo adulto CBA/J de acordo com estudos de Muller1 e Viberg e Canlon1,2. As preparações da superfície coclear têm sido amplamente utilizadas para investigação de patologias cocleares4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. O método de dissecção coclear de montagem inteira foi originalmente descrito em um livro editado por Hans Engstrom em 196616. Esta técnica foi posteriormente refinada e adaptada a uma variedade de espécies descritas na literatura por um número de cientistas na ciência auditiva10,11,12,13, 15,17 e pelos Laboratórios Eaton-Peabody em Massachusetts Eye and Ear18. Recentemente, outro método de dissecção coclear foi relatado por Montgomery et al.19. A microdissecção da cóconlea é um passo essencial e crítico para as preparações da superfície coclear. No entanto, dissecar cócroes de rato é um desafio técnico e requer uma prática considerável. Aqui, um método de preparação de superfície coclear modificado é apresentado para uso em cócroes de camundongos adultos. Este método requer decalcificação e uso de adesivo celular e tecido (ou seja, Cell-Tak) para aderir aos pedaços de epitélio coclear para 10 mm cobres redondos para imunorotulagem. O adesivo da pilha e do tecido foi amplamente utilizado para a imunohistoquímica20. Este método modificado de microdissese coclear é relativamente simples em comparação com os relatados anteriormente18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-mm Rund Coverslips</td>
			<td>Microscopy products for science and industry</td>
			<td>260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboard Micro Slide Trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST fine science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-gel with Tris Buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-myosin VIIa Antibody</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CtBP2 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Glu2R Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100491-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cochlear surface preparation in the adult mouse

O processamento auditivo na cóconlea depende da integridade das células ciliadas mecanosensorias. Ao longo da vida, a perda auditiva pode ser adquirida a partir de inúmeras etiologias, como exposição ao ruído excessivo, o uso de medicamentos ototóxicos, infecções bacterianas ou virais no ouvido, lesões na cabeça e o processo de envelhecimento. A perda de células ciliadas sensoriais é uma característica patológica comum das variedades de perda auditiva adquirida. Além disso, a sinapse da célula ciliada interna pode ser danificada por insultos leves. Portanto, as preparações superficiais da epitélia coclear, em combinação com técnicas de imunorotulagem e imagens confocais, são uma ferramenta muito útil para a investigação de patologias cocleares, incluindo perdas de sinapses de fita e células ciliadas sensoriais, alterações nos níveis de proteína nas células ciliadas e células de apoio, regeneração de células ciliadas e determinação da expressão gênica do relatório (ou seja, GFP) para verificação de transdução e identificação bem-sucedidas de tipos de células transinduzidas. A cócrolea, uma estrutura óssea em forma de espiral no ouvido interno, contém o órgão auditivo da extremidade sensorial, o órgão de Corti (OC). Células ciliadas sensoriais e células de apoio circundantes no OC estão contidas no duto coclear e descansam na membrana basilar, organizada de forma tonotópica com detecção de alta frequência ocorrendo na base e baixa frequência no ápice. Com a disponibilidade de informações moleculares e genéticas e a capacidade de manipular genes por nocaute e técnicas de knock-in, os ratos têm sido amplamente utilizados em pesquisas biológicas, inclusive na ciência auditiva. No entanto, a cócroes de camundongo adulto é minúscula, e o epitélio coclear é encapsulado em um labirinto ósseo, dificultando a microdissecção. Embora as técnicas da dissecação foram desenvolvidas e usadas em muitos laboratórios, este método modificado da microdissecção usando o adesivo da pilha e do tecido é mais fácil e mais conveniente. Ele pode ser usado em todos os tipos de cócroes de camundongoadulto após a decalcificação.

As preparações superficiais do epitélio coclear, em combinação com imunorotulagem e imagem confocal, têm sido amplamente utilizadas na ciência auditiva para a investigação de patologias cocleares, como quantificação de sinapses de fita, células ciliadas sensoriais, e expressão de proteína em células ciliadas sensoriais5,6,7,8. Embora a dissecação de cóciqueiros de camundongos ...

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Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Este artigo apresenta um método de preparação da superfície coclear modificado que requer decaltificação e uso de um adesivo de células e tecidos para aderir aos pedaços de epélia coclear a 10 mm de cobertura redonda para imunohistoquímica em córquia de camundongo adulto.

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Preparações de superfície coclear permitem a visualização de toda a lente do órgão de Corti usando imunohistoquímica e imagem confocal. Tem sido amplamente utilizado para a investigação de patologias cocleares específicas de interesse. Vamos modificar o método de microdisseção coclear.A principal vantagem desta técnica é a adesão de um pedaço de epitélio coclear a tampas redondas de 10 milímetros para o procedimento de imunolabeling, evitando a perda de tecido durante as múltiplas etapas de lavagem. Além das patologias cocleares, a preparação da superfície coclear também pode ser utilizada para a expressão de avaliação e regeneração das células ciliar. Habilidades básicas de microscópio são necessárias para esta técnica e a demonstração visual do método pode ajudar a garantir que cada etapa seja executada corretamente.Demonstrando o procedimento será Qiaojun Fang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para extração óssea temporal, imediatamente post-mortem puxar a pele anteriormente para expor o osso do crânio e usar a tesoura para cortar o osso do aspecto posterior para a frente ao longo da linha central do crânio. Use fórceps para remover o tecido cerebral antes de usar o polegar e o dedo indicador para remover manualmente os ossos temporais de camundongos com três meses de idade ou mais.Coloque os ossos em uma placa de Petri de 30 milímetros de diâmetro contendo gelo fresco frio 4%PFA e PBS sob um microscópio de dissecção e remova os estribos da janela oval. Perfure a membrana da janela redonda com fórceps número cinco e use uma agulha de calibre 27 presa a uma seringa de um mililitro contendo PFA fresco de 4%para fazer um pequeno buraco no ápice da cóclea. Permeia suavemente e lentamente a cóclea com uma solução fixativa através das janelas redondas e ovais até que a solução saia do pequeno orifício no ápice.Em seguida, transfira até dois frascos de cochleae perfusados em frascos individuais de cintilação de 20 mililitros contendo 10 mililitros de 4%PFA por frasco e agitar suavemente as amostras por duas horas à temperatura ambiente, seguido de armazenamento noturno a quatro graus Celsius em um rotador. Na manhã seguinte, lave a cóclea com três lavagens de cinco minutos com PBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, adicione 20 mililitros de 4%EDTA a cada frasco e gire as amostras por 48 horas a quatro graus Celsius com agitação suave.Ao final da incubação, toque na porção vestibular óssea de cada cóclea com fórceps para avaliar a elasticidade das amostras. Se os ossos são elásticos ao invés de firmes, a cóclea foi decalcificada. Substitua o EDTA por cada amostra por PBS fresco.Para microdisseção do epitélio coclear, segure a porção vestibular do osso temporal com fórceps e use um bisturi para cortar a curva apical em um ângulo de 45 graus. Corte verticalmente ao longo da linha tênue entre a janela redonda e a janela oval para separar a cóclea da porção vestibular e orientar a porção coclear com a curva basal em direção ao fundo e ao meio vira em direção ao topo da placa de Petri. A partir desta posição, corte a cápsula óssea e a parede lateral da curva média em direção ao final a partir do qual a seção apical foi removida e continue cortando para separar completamente a porção média das regiões basais e de gancho.Colocando a porção basal e gancho com o local da membrana basilar orientada para o fundo do prato, corte verticalmente os medialis da região do gancho para remover os medialis e cortar as regiões basais e ganchos para separar a porção do gancho. Para evitar distorção do tecido, corte os medialis da região do gancho antes da separação da região basal de curva e gancho. Corte as porções relativamente grandes de cápsula óssea e tecido lateral da parede da curva média e segurando a parede lateral com fórceps para alinhar a cápsula óssea e a parede lateral com o fundo da placa de Petri, corte esses tecidos do lado da membrana basilar.Em seguida, achate a amostra para orientar a superfície da célula ciliada sensorial para cima e corte o resto da cápsula óssea e da parede lateral. Em seguida, use fórceps para remover a membrana tectorial para separar completamente a região média e remover a cápsula óssea, tecido lateral da parede e regiões tectoriais das curvas restantes como apenas demonstrado. Quando todas as curvas cocleares tiverem sido dissecadas, espalhe 0,5 microliters de células e adesivos de tecido no centro de uma fenda redonda de 10 milímetros e deixe o adesivo secar por três a cinco minutos à temperatura ambiente.Coloque as tampas secas na placa de Petri e coloque todos os quatro pedaços de cada amostra de epitélio sensorial em uma mancha de cobertura. Em seguida, use fórceps para agarrar uma borda de cada deslizamento de cobertura para transferir os espécimes para poços individuais de um prato de cultura celular de quatro poços para imunolabeling. Para a imunolabelação das preparações de sinapse coclear superficial, lave cada epitélio sensorial três vezes por cinco minutos em PBS fresco por lavagem, seguido pelo tratamento de cada amostra com dois mililitros de surfactante não iônico de 2% por 30 minutos à temperatura ambiente em um rotador.Ao final da incubação, aspire a solução surfactante de cada poço e bloqueie qualquer ligação inespecífica com 100 microliters de solução de bloqueio por poço durante uma hora no rotador com agitação suave à temperatura ambiente. No final da incubação de bloqueio, lave as amostras três vezes com PBS como demonstrado sob agitação suave antes de rotular cada epitélio com 100 microliters dos anticorpos primários de interesse por 24 horas a 37 graus Celsius protegidos da luz. No dia seguinte, lave as amostras três vezes com PBS fresco e agitação suave por lavagem e rotule os espécimes com 100 microliters dos anticorpos secundários apropriados de interesse por duas horas a 37 graus Celsius protegidos da luz.No final da incubação, lave as amostras com três lavagens de cinco minutos em PBS fresco por lavagem antes de colocar cada tampa em lâminas individuais de microscópio de vidro com as amostras viradas para cima. Em seguida, adicione cuidadosamente oito microliters de um meio de montagem apropriado no centro de cada deslizamento de cobertura e use fórceps para montar outra cobertura de 10 milímetros em cada amostra. Em seguida, sele as laterais de cada sanduíche de deslizamento com esmalte transparente, coloque as amostras em uma pasta de slides de papelão e armazene os slides a quatro graus Celsius.Embora a dissecção da cóclea de camundongos adultos para preparações superficiais não seja simples, os pesquisadores novos na técnica devem ser capazes de aprender o método depois de praticar com 10 a 15 ouvidos. A imunolabelagem de preparações superficiais de camundongos CBAJ não tratados de 10 a 12 semanas de idade com CTBP2 e GluA2 demonstra que tanto as fitas pré-sinápticas quanto os terminais postsináspicos, respectivamente, estão localizados abaixo dos núcleos internos das células ciliadas e são justapostas indicando sinapses funcionais. A imunolabelagem para minosina 7A e a contra-retenção com faloideína e DAPI revelam a presença de células ciliar sensoriais, incluindo as células ciliares externas e células ciliares internas e seus núcleos.A imunolabelagem para minosina 7A e a contra-retenção com a faloidina não mostram diferenças na imunoreatividade ou uniformidade com ou sem o uso de adesivo celular e tecido. Além disso, a microscopia eletrônica de preparações superficiais de camundongos c57 pretos c57 de seis a oito semanas de idade demonstram um esterecilia bem organizada em forma de V de células ciliadas externas em três fileiras da amostra. Lembre-se de encher o coclear com solução fixação suavemente e lentamente através das janelas redondas e ovais até que a solução saia do pequeno orifício no ápice.Antes de separar a região do gancho da curva basal, tome cuidado para cortar os medialis da região do gancho para facilitar a remoção dos medialis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Neurociência

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Um<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do Rato Adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Um<em&gt; In Vitro</emPreparação Muscle-nervo&gt; Adulto mouse para estudar as propriedades de queima de músculos aferentes

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigação regeneração do axônio mamíferos: In Vivo Electroporation do gânglio de raiz Dorsal do rato adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...