Name: cochlear surface preparation in the adult mouse
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

Описанный исследовательский проект был поддержан грантом R01 DC009222 от Национального института глухоты и других коммуникационных расстройств, Национальные институты здравоохранения. Эта работа велась в здании WR в МЦУ в отремонтированном помещении при поддержке гранта C06 RR014516. Звери были размещены в musC CRI животных объектов при поддержке гранта C06 RR015455 от вневедомственные научно-исследовательские учреждения программы Национального центра научных ресурсов. Авторы благодарят д-ра Иохена Шахта за его ценные комментарии и Андру Талашу за коррективы рукописи.

Все протоколы исследований с участием взрослых мужчин CBA / J мышей в возрасте от 10 до 12 недель и C57BL/6J мышей в возрасте 6-8 недель были одобрены институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC) в Медицинском университете южной Каролины (MUSC). Уход за животными находился по?...

<ol>
	<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li><li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss.">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion.">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li><li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK.">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss.">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress.">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses.">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo.">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li><li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+neural+degeneration+with+aging,+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear.">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms.">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 7, 2063 (2016).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Engstr&#246;m, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection.">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).</li><li>. MassEyeAndEar.org Available from: <a target="_blank" href="https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories">https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories</a> (2019)</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea.">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>. Corning Cell Culture Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf</a> (2019)</li><li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li><li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+anatomy+of+the+'hook'+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation.">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li><li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing.">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li><li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death.">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1262 (2014).</li><li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea.">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).</li></ol>

Кохлеарная микродиссекция цельномонтажных препаратов поверхности в сочетании с иммуномаркировкой является основным инструментом для исследования патологий внутреннего уха и молекулярных механизмов. Этот модифицированный метод кохлеарного рассечения клеток и тканей с использован...

Улишайка посвящена обнаружению звука и отвечает за слух. Кохлеарный проток сжимается в спиральной форме в костлявом лабиринте и содержит слуховой сенсорный конечный орган, орган Корти (OC). OC опирается на базилярную мембрану, составляющую кохлеарный эпителий, с длиной около 5,7 мм, когда рассеялся у взрослых cbA/CaJ мышей1,2. Поскольку OC тонотопически организован с высокими частотами, обнаруженными в основании и низких частотах в вершине, кохлеарный эпителий часто делится на три части для аналитических сравнений: пикические, средние и базальные повороты, соответствующие низким, среднего и высокочастотного обнаружения, соответственно. В дополнение к массиву поддерживающих клеток, OC состоит из одного ряда внутренних волосковых клеток (IHCs), расположенных медиально и трех рядов наружных волосковых клеток (OHCs), расположенных боково по отношению к кохлеарной спирали.
Правильная слуховая обработка зависит от целостности сенсорных волосковых клеток в улине. Повреждение или потеря сенсорных волосковых клеток является общей патологической особенностью приобретенной потери слуха, вызванной многочисленными этиологиями, такими как воздействие чрезмерного шума, использование ототоксических препаратов, бактериальных или вирусных инфекций уха, травмы головы и старение процесс3. Кроме того, целостность и функции внутренней клетки волос / слуховых нервных синапсов могут быть нарушены мягкими оскорблениями4. С наличием молекулярной и генетической информации и манипуляции генов нокаутом и стук в методы, мыши были широко использованы в науке о слухе. Хотя улитка для взрослых мышей мизерна, а кохлеарный эпителий окружен костлявой капсулой, что приводит к технически сложным микрорасделяциям, поверхностным препаратам эпителия в сочетании с иммуномаркировкой или иммуногистохимией и конфокальные изображения широко использовались для исследования кохлеарных патологий, включая потери ленточных синапсов и волосковых клеток, изменения в уровнях белков в сенсорных волосковых клетках и поддерживающих клетках, а также регенерацию волосяных клеток. Кохлеарные поверхностные препараты также использовались для определения модели экспрессии генов репортеров (т.е. GFP) и подтверждения успешной трансдукции и выявления трансиндуцированных типов клеток. Эти методы ранее были использованы для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе шума индуцированной потерей слуха с использованием взрослых CBA / J мышей5,6,7,8,9.
В отличие от иммуногистохимии с использованием парафиновых секций или криосекций для получения небольших поперечных частей улишки, которые содержат три внешние волосковые клетки (OHCs) и одну внутреннюю клетку волос (IHC) на каждом участке, кохлеарные препараты поверхности позволяют визуализация всей длины OC для подсчета сенсорных волосковых клеток и ленточных синапсов и иммуномаркировки сенсорных волосковых клеток, соответствующих специфическим функциональным частотам. В таблице 1 показано отображение частот слуха как функция расстояния по длине кохлеарной спирали у взрослых CBA/J mouse согласно исследованиям Мюллера1 и Viberg и Canlon1,2. Кохлеарные поверхностные препараты широко используются для исследования кохлеарных патологий4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Метод кохлеарной рассечения всего гора был первоначально описан в книге под редакцией Ганса Энгстрома в 1966году 16. Этот метод был впоследствии усовершенствован и адаптирован к различным видам, как описано в литературе рядом ученых в слух науки10,11,12,13, 15,17 и Eaton-Peabody лабораторий в Массачусетсглаз и ухо18. Недавно, другой метод кохлеарного вскрытия было сообщено Монтгомери и др.19. Микродиссекция улиски является важным и критическим шагом для кохлеарных препаратов поверхности. Тем не менее, вскрытие мыши улики является технической задачей и требует значительной практики. Здесь представлен модифицированный метод подготовки кохлеарной поверхности для использования во взрослых уличках мышей. Этот метод требует декальцинации и использования клея клеток и тканей (т.е. Cell-Tak) для присоединения кусочков кохлеарного эпителия к 10 мм круглым крышкам для иммуномаркировки. Клейк клеток и тканей широко используется для иммуногистохимии20. Этот модифицированный метод микродиссекции кохлеарных относительно прост по сравнению с теми, которые ранее сообщалось18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-mm Rund Coverslips</td>
			<td>Microscopy products for science and industry</td>
			<td>260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboard Micro Slide Trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST fine science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-gel with Tris Buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-myosin VIIa Antibody</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CtBP2 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Glu2R Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100491-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cochlear surface preparation in the adult mouse

Слуховая обработка в улине зависит от целостности механосенсорных волосковых клеток. В течение жизни, потеря слуха может быть приобретена из многочисленных этиологий, таких как воздействие чрезмерного шума, использование ототоксических препаратов, бактериальных или вирусных инфекций уха, травмы головы, и процесс старения. Потеря сенсорных волосковых клеток является общей патологической особенностью разновидностей приобретенной потери слуха. Кроме того, синапс внутренней клетки волос может быть поврежден мягкимоскорбления. Поэтому поверхностные препараты кохлеарных эпителий, в сочетании с иммуномаркировкой и конфокальными изображениями, являются очень полезным инструментом для исследования кохлеарных патологий, включая потери ленточных синапсов и сенсорных волосковых клеток, изменения в уровнях белка в волосковых клетках и поддерживающих клетках, регенерация волосяных клеток и определение экспрессии генов отчета (т.е. GFP) для проверки успешной трансдукции и идентификации трансиндуцированных типов клеток. Улита, костлявая спиральная структура во внутреннем ухе, содержит слуховой сенсорный конечный орган, орган Корти (OC). Сенсорные волосковые клетки и окружающие поддерживающие клетки в ОК содержатся в кохлеарном протоке и покоятся на базилярной мембране, организованном тонотопическим способом с высокочастотным обнаружением, происходящим в основании и низкочастотным на вершине. С наличием молекулярной и генетической информации и способностью манипулировать генами нокаутом и стучать в методы, мыши были широко использованы в биологических исследованиях, в том числе в науке о слухе. Тем не менее, взрослая улитка мыши является незначительным, и кохлеарный эпителий инкапсулируется в костлявом лабиринте, что затрудняет микрорассеилосцию. Хотя методы вскрытия были разработаны и использованы во многих лабораториях, этот модифицированный метод микродиссекции с использованием клея клеток и тканей проще и удобнее. Он может быть использован во всех типах взрослых улиток мыши после декальцинации.

Поверхностные препараты кохлеарного эпителия, в сочетании с иммуномаркировкой и конфокальной визуализацией, широко использовались в науке о слухе для исследования кохлеарных патологий, таких как количественная оценка ленточных синапсов, сенсорных волосковых клеток, и выражение бел?...

Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

В этой статье представлен модифицированный метод подготовки кохлеарной поверхности, который требует декальцинации и использования клея клетки и ткани, чтобы придерживаться кусочков кохлеарной эпителии к 10 мм круглым крышкам для иммуногистохимии у взрослых улиток мыши.

Кохлеарная поверхность Подготовка в взрослой мыши

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Кохлеарный поверхностный препарат позволяет визуализировать весь хрусталик органа Корти с помощью иммуногистохимии и конфокальной визуализации. Он широко используется для исследования конкретных кохлеарных патологий, представляющих интерес. Мы изменим метод микродиссеции кохлеарных.Основным преимуществом этого метода является присоединение куска кохлеарного эпителия к 10-миллиметровым круглым крышкам для процедуры иммунолабеля, избегая при этом потери тканей во время многочисленных шагов стирки. Кроме кохлеарных патологий, кохлеарная подготовка поверхности также может быть использована для оценки экспрессии и регенерации волосяных клеток. Основные навыки микроскопа необходимы для этой техники и визуальной демонстрации метода может помочь гарантировать, что каждый шаг выполняется правильно.Демонстрация процедуры будет Цяоцзюнь Фан, аспирант из моей лаборатории. Для извлечения височной кости, немедленно посмертно вытяните кожу передней подвергать кости черепа и использовать ножницы, чтобы вырезать кость из заднего аспекта вперед вдоль центральной линии черепа. Используйте миппы для удаления ткани мозга перед использованием большого и указательного пальцев, чтобы вручную удалить височные кости у мышей в возрасте трех месяцев и старше.Поместите кости в чашку Петри диаметром 30 миллиметров, содержащую свежий ледяной 4%PFA и PBS под микроскопом вскрытия и удалите стапы из овального окна. Проколите круглую оконную мембрану с миппами номер пять и используйте 27 калибровочной иглы, прикрепленной к одному миллилитровому шприцу, содержащем свежие 4%PFA, чтобы сделать небольшое отверстие в вершине улитки. Аккуратно и медленно пронизывают улитку с фиксаторным раствором через круглые и овальные окна, пока раствор не вымывается из небольшого отверстия на вершине.Затем перенесите до двух пропитанных улитки в отдельные 20 миллилитров сцинтилляционных флаконов, содержащих 10 миллилитров по 4%PFA на флакон и осторожно агитировать образцы в течение двух часов при комнатной температуре, а затем на ночь хранения при четырех градусах по Цельсию на ротатор. На следующее утро, мыть улитки с тремя пятиминутные моет со свежим PBS за стирку. После последней стирки добавьте 20 миллилитров по 4%EDTA к каждому флакону и поверните образцы в течение 48 часов при четырех градусах Цельсия с нежным возбуждением.В конце инкубации коснитесь костной вестибулярной части каждой улитки с помощью типсов для оценки эластичности образцов. Если кости упругие, а не твердые, улитка была декальцифицирована. Замените EDTA для каждого образца свежим PBS.Для микроперепись кохлеарного эпителия, схватить вестибулярной части височной кости с миппами и использовать скальпель, чтобы сократить апический поворот под углом 45 градусов. Вырезать вертикально вдоль слабой линии между круглым окном и овальным окном, чтобы отделить улитку от вестибулярной части и сориентировать кохлеарную часть с базальным поворотом в сторону нижней и средней поворотов к верхней части чашки Петри. Из этого положения, вырезать костлявую капсулу и боковой стенки среднего поворота к концу, из которого апический раздел был удален и продолжать резки полностью отделить среднюю часть от базальных и крючок регионов.Размещение базальной и крючок часть с базилярной мембраны сайт, ориентированный на дно блюда, вертикально сократить medialis от области крючка, чтобы удалить medialis и сократить базальные и крючок регионов, чтобы отделить часть крючка. Чтобы избежать искажения ткани, отрежьте medialis от области крючка перед разделением базального поворота и области крючка. Отрежьте относительно большие части костной капсулы и боковой стенки ткани среднего поворота и удерживая боковую стенку с типсами, чтобы выровнять костлявую капсулу и боковую стенку с нижней частью чашки Петри, вырежьте эти ткани со стороны базилярной мембраны.Затем сровняйте образец, чтобы сориентировать сенсорную поверхность волосяной клетки вверх и обрезать остальную часть костлявой капсулы и боковой стенки. Затем используйте типсы, чтобы удалить текториальную мембрану, чтобы полностью отделить среднюю область и удалить костлявую капсулу, ткани боковой стенки и текторные области остальных поворотов, как это только что продемонстрировано. Когда все кохлеарные повороты были вскрыты, выложить 0,5 микролитров клеточного и тканевого клея на центр одного круглого 10-миллиметрового крышки и позволить клею высохнуть в течение трех-пяти минут при комнатной температуре.Поместите высушенные крышки в чашку Петри и вставьте все четыре части каждого сенсорного образца эпителия на одну крышку. Затем используйте типсы, чтобы схватить один край каждого крышки для передачи образцов в отдельные колодцы из четырех хорошо клеточной культуры блюдо для иммунолабеля. Для иммунолабеля поверхностных кохлеарных препаратов синапса, мыть каждый сенсорный эпителий три раза в течение пяти минут в свежем PBS за стирку, а затем лечение каждого образца с двумя миллилитров 2%неионной сурфактант в течение 30 минут при комнатной температуре на ротатор.В конце инкубации, аспирировать серфактант раствор из каждой хорошо и блокировать любые неспецифические связывания с 100 микролитров блокирующего раствора на колодец в течение одного часа на ротатор с нежным возбуждением при комнатной температуре. В конце блокирующего инкубации, мыть образцы три раза с PBS, как попродемонстрировано под нежным волнением перед маркировкой каждого эпителия с 100 микролитров первичных антител, представляющих интерес в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия защищены от света. На следующий день, мыть образцы три раза со свежим PBS и нежное возбуждение на стирку и этикетки образцов с 100 микролитров соответствующих вторичных антител, представляющих интерес в течение двух часов при 37 градусов по Цельсию защищены от света.В конце инкубации, мыть образцы с тремя пятиминутными моет в свежем PBS за стирку, прежде чем поместить каждый coverslip на отдельные стеклянные слайды микроскопа с образцами вверх. Затем аккуратно добавьте восемь микролитров соответствующей крепления среды в центр каждого крышки и используйте типсы, чтобы установить еще 10-миллиметровый крышку на каждый образец. Затем запечатать стороны каждого сэндвича с крышкой с четким лаком для ногтей, поместите образцы в папку картонной горки, и хранить слайды при четырех градусах по Цельсию.Хотя вскрытие взрослых улитки мыши для поверхностных препаратов не просто, исследователи, новые для техники должны быть в состоянии узнать метод после практики с 10 до 15 ушей. Иммунолабелирование поверхностных препаратов необработанных 10-12-недельных мышей CBAJ с CTBP2 и GluA2 показывает, что как пресинаптические ленты, так и постсинаптические терминалы соответственно расположены под ядрами внутренних волосяных клеток и сопоставляются с указанием функциональных синапсов. Иммунолабелирование миозин 7А и противоустирование фаллоидином и ДАПИ показывает наличие сенсорных волосковых клеток, включая внешние волосковые клетки и внутренние волосковые клетки и их ядра.Иммунолабелирование миозин 7А и противоустирование фаллоидином не показывает различий в иммунореактивности или однородности с использованием клея клеток и тканей или без него. Кроме того, сканирующая электронная микроскопия поверхностных препаратов от необработанных шести-восьминедельных черных 6 мышей C57 демонстрирует хорошо организованную V-образную стереоцилию наружных волосковых клеток в трех рядах образца. Не забудьте заполнить кохлеар с фиксаторным раствором мягко и медленно через круглые и овальные окна, пока раствор не вымывается из небольшого отверстия на вершине.Прежде чем отделить область крючка от базального поворота, позаботьтесь о том, чтобы отрезать medialis от области крючка, чтобы облегчить удаление medialis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Подготовка тканей и Иммуноокрашивание Мыши чувствительные нервные волокна, иннервирующие кожу и кости конечностей

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Покадровый Визуализация нейробластов миграции в остром ломтики мозга взрослых мышей

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Подготовка Изолированные Кишечные нейронов и глии от мышечно-кишечного сплетения взрослой мыши

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

<em&gt; In Vitro</em&gt; Взрослый мышь Muscle-нерв Подготовка к Изучая стрельбы Свойства Muscle афференты

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Долгосрочный длительной Визуализация мыши Cochlear эксплантов

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Всего горе Вскрытие и Иммунофлуоресценции взрослых мышей улитки

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Получение первичных смешанных глиальных культур от взрослых спинного мозга мыши ткани

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Простой Одношаговый Вскрытие Протокол целом монтажа подготовки взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Мозги

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Подготовка горизонтальных слоев взрослых мышей Retina для электрофизиологических исследований

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Следственный млекопитающих Axon регенерации: В Vivo электропорации взрослых мыши Спинной корень ганглия

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...