Name: cochlear surface preparation in the adult mouse
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

El proyecto de investigación descrito fue apoyado por la subvención R01 DC009222 del Instituto Nacional de Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud. Este trabajo se llevó a cabo en el edificio WR de MUSC en un espacio renovado apoyado por la subvención C06 RR014516. Los animales fueron alojados en instalaciones animales MUSC CRI apoyados por la subvención C06 RR015455 del Programa de Instalaciones de Investigación Extramuros del Centro Nacional de Recursos de Investigación. Los autores agradecen al Dr. Jochen Schacht por sus valiosos comentarios y a Andra Talaska por la corrección del manuscrito.

Todos los protocolos de investigación que involucran ratones CBA/J adultos adultos a las edades de 10-12 semanas y ratones C57BL/6J a las edades de 6-8 semanas fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) en la Universidad Médica de Carolina del Sur (MUSC). El cuidado de animales estaba bajo la supervisión de la División de Recursos Animales de Laboratorio del MUSC.
NOTA: Para los procedimientos que se presentan a continuación, los ratones...

<ol>
	<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li><li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss.">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion.">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li><li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK.">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss.">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress.">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses.">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo.">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li><li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+neural+degeneration+with+aging,+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear.">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms.">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 7, 2063 (2016).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Engstr&#246;m, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection.">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).</li><li>. MassEyeAndEar.org Available from: <a target="_blank" href="https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories">https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories</a> (2019)</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea.">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>. Corning Cell Culture Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf</a> (2019)</li><li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li><li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+anatomy+of+the+'hook'+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation.">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li><li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing.">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li><li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death.">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1262 (2014).</li><li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea.">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).</li></ol>

La microdisección coclear de preparaciones de superficie de montaje completo en combinación con el inmunoetiquetado proporciona una herramienta básica para la investigación de patologías del oído interno y mecanismos moleculares. Este método de disección coclear de ratón adulto modificado utilizando el adhesivo celular y tisular simplifica este difícil procedimiento.
Aunque este método de preparación de superficie coclear modificado es relativamente fácil y accesible, todavía req...

La cócleara se dedica a la detección de sonido y responsable de la audición. El conducto coclear se enrolla en forma de espiral en el laberinto óseo y sostiene el órgano final sensorial auditivo, el órgano de Corti (OC). El OC descansa sobre la membrana basilar, que compone el epitelio coclear, con una longitud de unos 5,7 mm cuando se desenrolla en ratones ADULTOs CBA/CaJ1,2. Debido a que el OC está organizado tonotópicamente con altas frecuencias detectadas en la base y frecuencias bajas en el ápice, el epitelio coclear a menudo se divide en tres partes para comparaciones analíticas: los giros apicales, medios y basales correspondientes a bajos, detección de frecuencia media y alta, respectivamente. Además de una serie de células de apoyo, la OC se compone de una fila de células pilosas internas (IHC) ubicadas medialmente y tres filas de células del cabello exteriores (OHC) ubicadas lateralmente con respecto a la espiral coclear.
El procesamiento auditivo correcto depende de la integridad de las células pilosas sensoriales en la cócleara. El daño o la pérdida de células pilosas sensoriales es una característica patológica común de la pérdida auditiva adquirida, causada por numerosas etiologías como la exposición al ruido excesivo, el uso de medicamentos ototóxicos, infecciones bacterianas o virales del oído, lesiones en la cabeza y el envejecimiento proceso3. Además, la integridad y la función de las sinapsis de la célula capilar interna/nervio auditivo pueden verse afectadas por leves insultos4. Con la disponibilidad de información molecular y genética y la manipulación de genes por técnicas de nocaut y knock-in, los ratones han sido ampliamente utilizados en la ciencia auditiva. Aunque la cócleara de ratón adulta es minúscula y el epitelio coclear está rodeado por una cápsula ósea que resulta en microdisecciones técnicamente difíciles, preparaciones superficiales del epitelio en combinación con inmunoetiquetado o inmunohistoquímica y las imágenes confocales se han utilizado ampliamente para la investigación de patologías cocleares, incluyendo pérdidas de sinapsis de cinta y células pilosas, cambios en los niveles de proteínas en las células pilosas sensoriales y células de apoyo, y la regeneración de células pilosas. También se han utilizado preparaciones de superficie coclear para determinar el patrón de expresión de los genes reporteros (es decir, GFP) y confirmar la transducción exitosa e identificar tipos de células transducidas. Estas técnicas se han utilizado previamente para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes a la pérdida auditiva inducida por ruido utilizando ratones CBA/J adultos5,6,7,8,9.
A diferencia de la inmunohistoquímica usando secciones de parafina o criosecciones para obtener pequeñas porciones transversales de la cócleara que contienen tres células del cabello exteriores (OHC) y una célula del cabello interno (IHC) en cada sección, las preparaciones de la superficie coclear permiten visualización de toda la longitud del OC para el recuento de células pilosas sensoriales y sinapsis de cinta e inmunoetiquetado de células pilosas sensoriales correspondientes a frecuencias funcionales específicas. La Tabla 1 muestra el mapeo de frecuencias auditivas en función de la distancia a lo largo de la longitud de la espiral coclear en el ratón adulto CBA/J según estudios de Muller1 y Viberg y Canlon1,2. Preparaciones de superficie coclear han sido ampliamente utilizados para la investigación de patologías cocleares4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. El método de disección coclear de montaje completo fue descrito originalmente en un libro editado por Hans Engstrom en 196616. Esta técnica fue posteriormente refinada y adaptada a una variedad de especies como se describe en la literatura por un número de científicos en ciencias auditivas10,11,12,13, 15,17 y por los Laboratorios Eaton-Peabody en Massachusetts Eye and Ear18. Recientemente, Montgomery et al.19informó otro método de disección coclear. La microdisección de la cócleara es un paso esencial y crítico para las preparaciones de superficie coclear. Sin embargo, la diseción de las cocleares de ratón es un desafío técnico y requiere una práctica considerable. Aquí, se presenta un método de preparación de superficie coclear modificado para su uso en cócleares de ratón adultos. Este método requiere la descalcificación y el uso de adhesivo celular y tisular (es decir, Cell-Tak) para adherir las piezas de epitelio coclear a 10 mm de cubres redondos para inmunoetiquetado. Adhesivo celular y tisular ha sido ampliamente utilizado para la inmunohistoquímica20. Este método de microdisección coclear modificado es relativamente simple en comparación con los reportados anteriormente18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-mm Rund Coverslips</td>
			<td>Microscopy products for science and industry</td>
			<td>260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboard Micro Slide Trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST fine science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-gel with Tris Buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-myosin VIIa Antibody</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CtBP2 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Glu2R Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100491-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cochlear surface preparation in the adult mouse

El procesamiento auditivo en la cócleara depende de la integridad de las células pilosas mecanosensoriales. A lo largo de toda la vida, la pérdida auditiva se puede obtener de numerosas etiologías, como la exposición al ruido excesivo, el uso de medicamentos ototóxicos, infecciones bacterianas o virales del oído, lesiones en la cabeza y el proceso de envejecimiento. La pérdida de células pilosas sensoriales es una característica patológica común de las variedades de pérdida auditiva adquirida. Además, la sinapsis de la célula del cabello interno puede ser dañada por leves insultos. Por lo tanto, las preparaciones superficiales de la epitelía coclear, en combinación con técnicas de inmunoetiquetado e imágenes confocales, son una herramienta muy útil para la investigación de patologías cocleares, incluyendo pérdidas de sinapsis de cinta y células pilosas sensoriales, cambios en los niveles de proteínas en las células pilosas y células de apoyo, regeneración de células pilosas y determinación de la expresión génica del informe (es decir, GFP) para la verificación de la transducción exitosa y la identificación de tipos de células transducidas. La cócleara, una estructura ósea en forma de espiral en el oído interno, sostiene el órgano final sensorial auditivo, el órgano de Corti (OC). Las células pilosas sensoriales y las células de soporte circundantes en la OC están contenidas en el conducto coclear y descansan sobre la membrana basilar, organizadas de manera tonotópica con detección de alta frecuencia que se produce en la base y baja frecuencia en el ápice. Con la disponibilidad de información molecular y genética y la capacidad de manipular genes mediante técnicas de nocaut y knock-in, los ratones han sido ampliamente utilizados en la investigación biológica, incluso en la ciencia auditiva. Sin embargo, la cócleara de ratón adulta es minúscula, y el epitelio coclear está encapsulado en un laberinto óseo, lo que dificulta la microdisección. Aunque las técnicas de disección se han desarrollado y utilizado en muchos laboratorios, este método de microdisección modificada utilizando adhesivo celular y tisular es más fácil y más conveniente. Se puede utilizar en todo tipo de cocleares de ratón adultos después de la descalcificación.

Las preparaciones superficiales del epitelio coclear, en combinación con el inmunoetiquetado y la imagen confocal, se han utilizado ampliamente en la audición para la investigación de patologías cocleares, como la cuantificación de sinapsis de cinta, células pilosas sensoriales, y expresión proteica en células pilosas sensoriales5,6,7,8. Aunque la disección de cócleares de ratón adul...

Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Este artículo presenta un método de preparación de superficie coclear modificado que requiere descalcificación y uso de un adhesivo celular y tisular para adherir las piezas de epitelía coclear a 10 mm de resbalones de cubierta redonda para inmunohistoquímica en cocleares de ratón adultos.

Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Las preparaciones de superficies cocleares permiten la visualización de toda la lente del órgano de Corti utilizando inmunohistoquímica e imágenes confocales. Se ha utilizado ampliamente para la investigación de patologías cocleares específicas de interés. Modificaremos el método de microdisección coclear.La principal ventaja de esta técnica es la adherencia de un pedazo de epitelio coclear a los cubreobjetos redondos de 10 milímetros para el procedimiento de inmunoetiquetado evitando la pérdida de tejido durante los múltiples pasos de lavado. Además de patologías cocleares, la preparación de la superficie coclear también se puede utilizar para la expresión de evaluación y la regeneración de células pilosas. Se requieren habilidades básicas de microscopio para esta técnica y la demostración visual del método puede ayudar a garantizar que cada paso se realiza correctamente.Demostrando el procedimiento estará Qiaojun Fang, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para la extracción ósea temporal, inmediatamente post-mortem tirar de la piel antes para exponer el hueso del cráneo y utilizar tijeras para cortar el hueso desde el aspecto posterior hacia adelante a lo largo de la línea central del cráneo. Usa fórceps para extirpar el tejido cerebral antes de usar el pulgar y el dedo índice para extraer manualmente los huesos temporales de ratones de tres meses de edad o más.Coloque los huesos en un plato Petri de 30 milímetros de diámetro que contenga hielo fresco 4%PFA y PBS bajo un microscopio de disección y retire las estapas de la ventana ovalada. Perfore la membrana de la ventana redonda con el número cinco fórceps y utilice una aguja de calibre 27 unida a una jeringa de un mililitro que contenga 4%PFA fresco para hacer un pequeño agujero en el ápice de la cóclea. Perfume suavemente y lentamente la cóclea con una solución fijadora a través de las ventanas redondas y ovaladas hasta que la solución se lave fuera del pequeño orificio en el ápice.A continuación, transfiera hasta dos cócleas perfundidas en viales individuales de centelleo de 20 mililitros que contengan 10 mililitros de 4%PFA por vial y agitar suavemente las muestras durante dos horas a temperatura ambiente, seguido de un almacenamiento nocturno a cuatro grados Celsius en un rotador. A la mañana siguiente, lave la cóclea con tres lavados de cinco minutos con PBS fresco por lavado. Después del último lavado, añadir 20 mililitros de 4%EDTA a cada vial y rotar las muestras durante 48 horas a cuatro grados Centígrados con agitación suave.Al final de la incubación, toque la porción vestibular ósea de cada cóclea con fórceps para evaluar la elasticidad de las muestras. Si los huesos son elásticos en lugar de firmes, la cóclea se ha descalcificado. Sustituya el EDTA para cada muestra por PBS fresco.Para la microdisección del epitelio coclear, agarre la porción vestibular del hueso temporal con fórceps y use un bisturí para cortar el giro apical en un ángulo de 45 grados. Corte verticalmente a lo largo de la línea débil entre la ventana redonda y la ventana ovalada para separar la cóclea de la parte vestibular y orientar la porción coclear con el giro basal hacia la parte inferior y media gira hacia la parte superior de la placa Petri. Desde esta posición, corte la cápsula ósea y la pared lateral del giro medio hacia el extremo del cual se quitó la sección apical y continúe cortando para separar completamente la parte media de las regiones basales y de gancho.Colocación de la porción basal y de gancho con el sitio de membrana basilar orientado hacia la parte inferior de la placa, corte verticalmente los medialis de la región de gancho para eliminar los medialis y corte las regiones basales y de gancho para separar la porción del gancho. Para evitar la distorsión del tejido, corte los medialis de la región de gancho antes de separar la región basal de giro y gancho. Cortar las porciones relativamente grandes de la cápsula ósea y el tejido de pared lateral de la vuelta media y sosteniendo la pared lateral con fórceps para alinear la cápsula ósea y la pared lateral con la parte inferior de la placa Petri, cortar estos tejidos del lado de la membrana basilar.A continuación, aplanar la muestra para orientar la superficie de la célula del cabello sensorial hacia arriba y recortar el resto de la cápsula ósea y la pared lateral. A continuación, utilice fórceps para eliminar la membrana tectorial para separar completamente la región media y eliminar la cápsula ósea, el tejido de pared lateral y las regiones tectoriales de los giros restantes como se acaba de demostrar. Cuando todos los giros cocleares hayan sido diseccionados, esparza 0,5 microlitros de adhesivo celular y tisular en el centro de un cubreobjetos redondo de 10 milímetros y deja que el adhesivo se seque durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente.Coloque los cubreobjetos secos en la placa de Petri y pegue las cuatro piezas de cada muestra de epitelio sensorial en un cubreobjetos. A continuación, utilice fórceps para agarrar un borde de cada cubreobjetos para transferir los especímenes a pozos individuales de un plato de cultivo celular de cuatro pocús para el etiquetado inmunológico. Para el inmunoetiquetado de preparaciones de sinapsis coclear superficial, lave cada epitelio sensorial tres veces durante cinco minutos en PBS fresco por lavado, seguido del tratamiento de cada muestra con dos mililitros de 2% de tensioactivo no iónico durante 30 minutos a temperatura ambiente en un rotador.Al final de la incubación, aspirar la solución surfactante de cada pocadura y bloquear cualquier unión no específica con 100 microlitros de solución de bloqueo por pozo durante una hora en el rotador con agitación suave a temperatura ambiente. Al final de la incubación de bloqueo, lave las muestras tres veces con PBS como se demuestra bajo agitación suave antes de etiquetar cada epitelio con 100 microlitros de los anticuerpos primarios de interés durante 24 horas a 37 grados Celsius protegidos de la luz. Al día siguiente, lave las muestras tres veces con PBS fresco y agitación suave por lavado y etiquete las muestras con 100 microlitros de los anticuerpos secundarios de interés apropiados durante dos horas a 37 grados Centígrados protegidos de la luz.Al final de la incubación, lave las muestras con tres lavados de cinco minutos en PBS fresco por lavado antes de colocar cada tapa en diapositivas individuales del microscopio de vidrio con las muestras hacia arriba. A continuación, agregue cuidadosamente ocho microlitros de un medio de montaje adecuado en el centro de cada cubreobjetos y utilice fórceps para montar otro cubreobjetos de 10 milímetros en cada muestra. A continuación, selle los lados de cada sándwich de cubreobjetos con esmalte de uñas transparente, coloque las muestras en una carpeta de diapositivas de cartón y guarde las diapositivas a cuatro grados centígrados.Aunque la disección de cócleo de ratón adulto para preparaciones superficiales no es simple, los investigadores nuevos en la técnica deben ser capaces de aprender el método después de practicar con 10 a 15 orejas. El inmunoetiquetado de las preparaciones superficiales de ratones CBAJ de 10 a 12 semanas de edad sin tratar con CTBP2 y GluA2 demuestra que tanto las cintas presinápticas como los terminales postsinápticos se encuentran respectivamente debajo de los núcleos de células capilares internas y se yuxtaponen indicando sinapsis funcionales. El inmunoetiquetado para la miosina 7A y la contramancha con falhalloidina y DAPI revela la presencia de células pilosas sensoriales, incluidas las células externas del cabello y las células internas del cabello y sus núcleos.El inmunoetiquetado para la miosina 7A y la contramancha con falhalloidina no muestra diferencias en inmunoreactividad o uniformidad con o sin el uso de adhesivo celular y tisular. Además, la microscopía electrónica de barrido de preparaciones superficiales de ratones C57 negros 6 de seis a ocho semanas de edad demuestran una estereocilia en forma de V bien organizada de células del cabello exteriores en tres filas de la muestra. Recuerde llenar el coclear con solución fijadora suavemente y lentamente a través de las ventanas redondas y ovaladas hasta que la solución se lave fuera del pequeño agujero en el ápice.Antes de separar la región de gancho del giro basal, tenga cuidado de cortar los medialis de la región de gancho para facilitar la eliminación de los medialis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Preparación y tejido de fibras inmunotinción ratón nerviosas sensoriales que inervan la piel y los huesos de extremidades

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Investigación

Neurociencias

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Mouse Adulto Preparación músculo-nervio para estudiar las propiedades de cocción de los aferentes musculares

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Preparación de mezcla de culturas gliales primarios de ratón adulto espinal tejido del cordón

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Preparación de cortes horizontales de ratón adulto Retina de Estudios electrofisiológicos

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigadora de axón mamífero de regeneración: En Vivo electroporación de ganglio de raíz Dorsal de ratón adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...