Name: cochlear surface preparation in the adult mouse
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

Forskningsprojektet som beskrevs stöddes av Grant R01 DC009222 från det nationella institutet för dövhet och andra kommunikationsstörningar, National Institutes of Health. Detta arbete genomfördes i WR byggnaden på MUSC i renoverade rymden stöds av Grant C06 RR014516. Djur var inrymt i MUSC CRI djurfaciliteter som stöds av Grant C06 RR015455 från Extramural forskning anläggningar program för National Center for Research Resources. Författarna tackar Dr Jochen Schacht för hans värdefulla kommentarer och andra Talaska för korrekturläsning av manuskriptet.

Alla forskningsprotokoll som involverar manliga vuxna CBA/J möss i åldrarna 10 – 12 veckor och C57BL/6J möss i åldrarna 6 – 8 veckor godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid Medical University of South Carolina (MUSC). Djuromsorg var under överinseende av delningen av laboratorium djur resurserna på MUSC.
Anmärkning: För de förfaranden som presenteras nedan är möss sövda med ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) v...

<ol>
	<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li><li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss.">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion.">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li><li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK.">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss.">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress.">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses.">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo.">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li><li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+neural+degeneration+with+aging,+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear.">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms.">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 7, 2063 (2016).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Engstr&#246;m, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection.">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).</li><li>. MassEyeAndEar.org Available from: <a target="_blank" href="https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories">https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories</a> (2019)</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea.">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>. Corning Cell Culture Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf</a> (2019)</li><li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li><li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+anatomy+of+the+'hook'+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation.">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li><li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing.">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li><li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death.">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1262 (2014).</li><li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea.">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).</li></ol>

Cochlear microdissection av helmonterade ytpreparat i kombination med immunolabeling ger ett grundläggande verktyg för utredning av innerörat patologier och molekylära mekanismer. Denna modifierade vuxna mus Cochlear dissektion metod med hjälp av cell-och vävnadslim förenklar detta svåra förfarande.
Även om denna modifierade Cochlears ytbehandlingsmetod är relativt enkel och tillgänglig, krävs fortfarande övning för att uppnå färdighet. För att göra de rätta nedskärningarn...

Snäckan är tillägnad detektering av ljud och ansvarig för hörsel. Cochleaimplantat är lindad i en spiralform i beniga labyrinten och håller den auditiva sensoriska änden orgel, organ Corti (OC). OC vilar på basilaris membran, vilket gör upp Cochlear epitel, med en längd av ca 5,7 mm när utrullas i vuxen CBA/Caj möss1,2. Eftersom OC är tonotopically organiseras med höga frekvenser upptäcks i basen och låga frekvenser i spetsen, är cochleaimepitel ofta uppdelad i tre delar för analytiska jämförelser: den apikala, mellersta och basala svängar som motsvarar låg, respektive hög frekvens detektering. Förutom en rad stödjande celler, är OC består av en rad av inre hårceller (IHCs) ligger medialt och tre rader av yttre hårceller (OHCs) ligger i sidled med avseende på Cochlear spiral.
Korrekt hörsel behandling beror på integriteten hos de sensoriska hårcellerna i hörselsnäckan. Skador eller förlust av sensoriska hårceller är ett vanligt patologiskt inslag i förvärvade hörselnedsättning, orsakas av många etiologier såsom exponering för överdriven buller, användning av ototoxiska mediciner, bakteriella eller virala öroninfektioner, huvudskador, och åldrande process3. Dessutom kan integriteten och funktionen hos den inre hår cellen/hörselnerven synapser försämras av milda förolämpningar4. Med tillgången till molekylär och genetisk information och manipulering av gener genom knockout-och Knock-in-tekniker har möss ofta använts i hörsel vetenskapen. Även om den vuxna musen snäckan är mycket liten och Cochlear epitel är omgiven av en benig kapsel som resulterar i tekniskt svåra mikrodissektioner, ytpreparationer av epitelet i kombination med immunolabeling eller immunohistokemi och konfokala bilder har i stor utsträckning använts för utredning av Cochlears patologier, inklusive förluster av band synapser och hårceller, förändringar i nivåer av proteiner i sensoriska hårceller och stödjande celler, och hår cellförnyelse. Cochlear Surface-preparat har också använts för att bestämma mönstret för uttryck av rapportörer (dvs. GFP) och bekräfta lyckad transduktion och identifiera celltyper som är omvandade till celler. Dessa tekniker har tidigare använts för studiet av molekylära mekanismer bakom bullerinducerad hörselnedsättning med hjälp av vuxna CBA/J möss5,6,7,8,9.
Till skillnad från immunohistokemi med hjälp av paraffin sektioner eller kryosektioner att få små tvärsnitts delar av hörselsnäckan som innehåller tre yttre hårceller (OHCs) och en inre hårcell (IHC) på varje sektion, Cochlear Surface preparat tillåter visualisering av hela längden av OC för att räkna sensoriska hårceller och band synapser och immunolabeling av sensoriska hårceller som motsvarar specifika funktionella frekvenser. Tabell 1 visar kartläggningen av hörsel frekvenser som en funktion av avståndet längs Cochlears spiral i vuxen CBA/J-mus enligt studier från Muller1 och Viberg och Canlon1,2. Cochlear ytbehandling har använts i stor utsträckning för undersökning av Cochlear-patologier4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Den hela-Mount Cochlear dissektion metoden beskrevs ursprungligen i en bok redigerad av hans Engström i 196616. Denna teknik har därefter förfinats och anpassats till en rad olika arter som beskrivs i litteraturen av ett antal forskare inom hörselvetenskap10,11,12,13, 15,17 och av Eaton-Peabody Laboratories i Massachusetts Eye och Ear18. Nyligen rapporterades en annan Cochlear dissekeringsmetod av Montgomery et al.19. Microdissektion av snäckan är ett viktigt och kritiskt steg för cochleaimplantat. Emellertid, dissekera mus cochleae är en teknisk utmaning och kräver betydande praxis. Här presenteras en modifierad Cochlear Surface-prepareringsmetod för användning i Adult Mouse cochleae. Denna metod kräver urkalkning och användning av cell-och vävnadslim (dvs cell-tak) att fästa bitar av cochlea epitel till 10 mm runda täckband för immunolabeling. Cell-och vävnadslim har använts i stor utsträckning för immunohistokemi20. Denna modifierade Cochlear microdissekeringsmetod är relativt enkel jämfört med de som tidigare rapporterades18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-mm Rund Coverslips</td>
			<td>Microscopy products for science and industry</td>
			<td>260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboard Micro Slide Trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST fine science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-gel with Tris Buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-myosin VIIa Antibody</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CtBP2 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Glu2R Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100491-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cochlear surface preparation in the adult mouse

Hörsel behandling i hörselsnäckan beror på integriteten hos de mechanosensoriska hårcellerna. Under en livstid, hörselnedsättning kan förvärvas från många etiologier såsom exponering för överdriven buller, användning av ototoxiska mediciner, bakteriella eller virala öroninfektioner, huvudskador, och åldrandet. Förlust av sensoriska hårceller är ett vanligt patologiskt inslag i de sorter av förvärvad hörselnedsättning. Dessutom kan den inre hår cells synapsen skadas av milda förolämpningar. Därför är ytbehandling av Cochlear epithelia, i kombination med immunolabeling tekniker och konfokala bilder, ett mycket användbart verktyg för utredning av Cochlear patologier, inklusive förluster av band synapser och sensoriska hårceller, förändringar i proteinnivåer i hårceller och stödjande celler, hår cellförnyelse, och bestämning av rapport genuttryck (dvs., GFP) för verifiering av framgångsrik transduktion och identifiering av sensorik celltyper. Hörselsnäckan, en benig Spiral-formad struktur i innerörat, håller auditiva sensoriska änden orgel, organ Corti (OC). Sensoriska hårceller och omgivande stödjande celler i OC finns i cochleaimplantat och vila på basilaris membran, organiserade i en tonotopic mode med högfrekvent detektion som sker i basen och lågfrekventa i spetsen. Med tillgången till molekylär och genetisk information och förmågan att manipulera gener genom knockout-och Knock-in-tekniker har möss ofta använts i biologisk forskning, bland annat i hörselvetenskap. Men den vuxna musen snäckan är miniscule, och Cochlear epitel är inkapslad i en benig labyrint, vilket gör microdissection svårt. Även dissektion tekniker har utvecklats och används i många laboratorier, denna modifierade microdissection metod med hjälp av cell-och vävnadslim är lättare och bekvämare. Det kan användas i alla typer av vuxna mus cochleae efter decalcification.

Ytbehandling av cochlea epitel, i kombination med immunolabeling och konfokal avbildning, har använts i stort sett i hörselvetenskap för utredning av Cochlear patologier, såsom kvantifiering av band synapser, sensoriska hårceller, och proteinuttryck i sensoriska hårceller5,6,7,8. Även om dissektion av vuxna mus cochleae för ytbehandling är inte enkelt, nya doktorander kan lära sig den...

Watch this Scientific Journal Video about Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse at JoVE.com

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Denna artikel presenterar en modifierad Cochlear ytbehandling metod som kräver urkalkning och användning av en cell och vävnad lim för att fästa bitar av Cochlear epitel till 10 mm runda täcker glider för immunohistokemi i Adult Mouse cochleae.

Cochlears ytbehandling i den vuxna musen

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Cochlear ytan preparat tillåta visualisering av hela linsen av organet i Corti med hjälp av immunohistokemi och confocal imaging. det har i stort sett använts för undersökning av specifika cochlear patologier av intresse. Vi kommer att modifiera metoden cochlear microdissection.Den största fördelen med denna teknik är följsamheten av en bit cochlear epitel till 10 millimeters runda coverslips för immunolabeling förfarandet samtidigt som man undviker vävnadsförlust under de flera tvättsteg. Dessutom cochlear patologier, cochlear ytan förberedelse kan också utnyttjas för bedömningen uttryck och hår cell förnyelse. Grundläggande mikroskop färdigheter krävs för denna teknik och visuell demonstration av metoden kan bidra till att säkerställa att varje steg utförs korrekt.Demonstrera förfarandet kommer att Qiaojun Fang, en doktorand från mitt laboratorium. För tinningben extraktion, omedelbart post-mortem dra huden anteriorly att exponera skallbenet och använda sax för att skära benet från den bakre aspekten framåt längs mittlinjen av skallen. Använd tedrappar för att ta bort hjärnvävnaden innan du använder tummen och pekfingret för att manuellt ta bort tinningbenen från möss tre månader eller äldre.Placera benen i en 30 millimeter diameter Petriskål som innehåller färsk iskall 4%PFA och PBS under en dissekering mikroskop och ta bort stapes från det ovala fönstret. Punktera det runda fönstermembranet med nummer fem tlympor och använd en 27 gauge nål fäst vid en en milliliter spruta som innehåller färska 4%PFA för att göra ett litet hål i spetsen av snäckan. Försiktigt och långsamt genomfuser snäckan med en fixativ lösning via de runda och ovala fönstren tills lösningen sköljer ur det lilla hålet vid apex.Överför sedan upp till två perfunderade cochleae till enskilda 20 milliliter scintillationsflaska som innehåller 10 milliliter 4%PFA per injektionsflaska och försiktigt agitera proverna i två timmar vid rumstemperatur, följt av övernattning vid fyra grader Celsius på en rotator. Nästa morgon, tvätta snäckan med tre fem minuters tvättar med färska PBS per tvätt. Efter den sista tvätten, tillsätt 20 milliliter på 4%EDTA till varje injektionsflaska och rotera proverna i 48 timmar vid fyra grader Celsius med mild agitation.Vid slutet av inkubationen, rör vid den beniga vestibulära delen av varje cochlean med tänjningar för att bedöma elasticiteten hos proverna. Om benen är elastiska snarare än fasta, har snäckan dekalcifierats. Byt ut EDTA för varje prov med färsk PBS.För mikrodissection av cochlear epitel, ta tag i vestibulära delen av tinningbenet med tlyck och använda en skalpell för att skära den apikala svängen i 45 graders vinkel. Skär vertikalt längs den svaga linjen mellan det runda fönstret och det ovala fönstret för att separera snäckan från vestibulära delen och orientera cochlear delen med basal sväng mot botten och mitt varv mot toppen av Petri skålen. Från denna position, skär beniga kapseln och laterala väggen i mitten vända mot slutet från vilken den apikala delen togs bort och fortsätta skära för att helt separera den mellersta delen från basala och krok regioner.Placera basal och krok del med basilar membran plats orienterad mot botten av skålen, vertikalt skära medialis bort av kroken regionen för att ta bort medialis och skär basala och krok regioner för att separera kroken delen. För att undvika förvrängning av vävnaden, skär medialis av krokregionen före separation av basalsväng och krokregionen. Skär bort de relativt stora portioner av beniga kapseln och laterala väggvävnad i mitten sväng och hålla laterala väggen med pinj för att anpassa beniga kapseln och laterala väggen med botten av Petri-skålen, skär dessa vävnader från basilar membran sidan.Därefter platta exemplaret att orientera sensoriska hårcell yta sida upp och trimma bort resten av beniga kapseln och laterala väggen. Använd sedan forceps för att ta bort tectorial membranet att helt separera mellersta regionen och ta bort beniga kapseln, laterala vägg vävnad och tectorial regioner av de återstående varv som just visat. När alla cochlear varv har dissekeras, sprida 0,5 mikroliter cell och vävnad lim på mitten av en rund 10 millimeter coverslip och låta limmet torka i tre till fem minuter vid rumstemperatur.Placera de torkade täcken i petriskålen och stick alla fyra bitar av varje sensoriskt epitelprov på ett täckskydd. Använd sedan tuppar för att förstå en kant av varje täckplatta för att överföra exemplaren till enskilda brunnar av en fyra-brunn cell kultur skålen för immunolabeling. För immunolabeling av synapspreparat för ytsläcksleparat, tvätta varje sensoriskt epitel tre gånger i fem minuter i färskt PBS per tvätt, följt av behandling av varje prov med två milliliter av 2%non-joniskt ytaktiva medel i 30 minuter vid rumstemperatur på en rotator.I slutet av inkubationen aspirera den ytaktiva lösningen från varje brunn och blockera eventuell ospecifik bindning med 100 mikroliter av blockerande lösning per brunn under en timme på rotatorn med mild agitation vid rumstemperatur. Vid slutet av den blockerande inkubationen, tvätta proverna tre gånger med PBS som visats under skonsam agitation innan du märker varje epitel med 100 mikroliter av de primära antikropparna av intresse under 24 timmar vid 37 grader Celsius skyddat mot ljus. Nästa dag, tvätta proverna tre gånger med färska PBS och mild agitation per tvätt och märka exemplaren med 100 mikroliter av lämpliga sekundära antikroppar av intresse för två timmar vid 37 grader Celsius skyddas från ljus.Vid slutet av inkubationen tvättar du proverna med tre femminuterstvättar i färsk PBS per tvätt innan du placerar varje täckplatta på enskilda glasmikroskopsglas med proverna vända uppåt. Därefter lägger du försiktigt till åtta mikroliter av ett lämpligt monteringsmedium i mitten av varje täckplatta och använd forceps för att montera ytterligare 10 millimeters täckplatta på varje prov. Sedan försegla sidorna av varje coverslip smörgås med tydliga nagellack, placera proverna i en kartong bildmapp, och förvara diabilder på fyra grader Celsius.Även om dissektion av vuxna mussäcken för ytpreparat inte är enkel, bör forskare som är nya till tekniken kunna lära sig metoden efter att ha övat med 10 till 15 öron. Immunolabeling av ytpreparat av obehandlade 10 till 12 veckor gamla CBAJ-möss med CTBP2 och GluA2 visar att både presynaptiska band respektive postsynaptiska terminaler ligger under de inre hårcellskärnorna och är juxtaposerade som indikerar funktionella synapser. Immunolabeling för myosin 7A och counterstaining med phalloidin och DAPI avslöjar förekomsten av sensoriska hårceller inklusive de yttre hårcellerna och inre hårceller och deras kärnor.Immunolabeling för myosin 7A och counterstaining med phalloidin visar inga skillnader i immunoreactivity eller enhetlighet med eller utan användning av cell- och vävnadslim. Dessutom visar scanningelektronmikroskopi av ytpreparat från obehandlade sex till åtta veckor gamla C57 svarta 6 möss en välorganiserad V-formad stereocilia av yttre hårceller i tre rader av provet. Kom ihåg att fylla cochlear med fixativ lösning försiktigt och långsamt genom de runda och ovala fönstren tills lösningen tvättar ur det lilla hålet vid apex.Innan du separerar krokregionen från basalsvängen, var noga med att skära medialis bort från krokregionen för att underlätta avlägsnandet av medialis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Upprättande och immunfärgning av Mouse känselnervtrådar Innervating Hud och Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse avbildning av Neuroblast Migration i akuta skivor av vuxen mus framhjärnan

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Ett<em&gt; In-vitro</em&gt; Beredning av isolerade Enteriska neuroner och glia från plexus myentericus av vuxen mus

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Adult Mouse Muskel-nerv Förberedelse för Studera Förbränningsegenskaper för Muscle afferenter

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Långsiktig Time Lapse avbildning av Mouse Cochlear Explantat

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hela Mount Dissekering och Immunofluorescence i vuxen mus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Framställning av primära blandade Glial kulturer från vuxen mus ryggmärg

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel steg Dissection protokoll för hel-mount Framställning av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Framställning av horisontella skivor Adult mus Retina för elektrofysiologiska studier

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Utredande däggdjur Axon regenerering: In Vivo elektroporation av vuxen mus dorsalrotsganglier Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...