Name: tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease at JoVE.com

ونشكر جميع أعضاء مختبر ماتشو على المناقشات المفيدة، وألفارو لوبيز - غارسيا على المشورة الإحصائية، وسينيو جيان على المساعدة التقنية والإدارية خلال هذا العمل. نشكر PSC الخلية البيولوجيا مرفق الأساسية للمساعدة في التصوير الفلوري ة تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (منحة XDB27040204), مركز شنغهاي لبيولوجيا الإجهاد النباتي (الصينية أكاديمية العلوم) وبرنامج المواهب الصينية 1000.

ملاحظة: تتضمن أجزاء هامة من هذه الطريقة مناولة المواد النباتية في المختبر، وبالتالي من المهم الحفاظ على الظروف المعقمة خلال جميع هذه الإجراءات، بما في ذلك تصور الفلورسة DsRed. خلال جميع عملية التحول، تنمو شتلات الطماطم عند 25-28 درجة مئوية و16 ساعة/8 ساعة فاتح/داكن (130 ميكرومول فوتونم م-2</...

<ol>
	<li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Wilt+in+China:+History,+Current+Status,+and+Future+Perspectives.">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).</li><li>Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).</li><li>Ho-Pl&#225;garo, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34 (2018).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+of+homogalacturonan,+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum.">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum.">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li><li>Hern&#225;ndez-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance.">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li><li>Denanc&#233;, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+wat1+(walls+are+thin1)-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen,+Ralstonia+solanacearum,+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism.">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li><li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction:+focus+at+the+plant+cell+wall.">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li><li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses.">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li><li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts.">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum.">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Le&#243;n-Morcillo, R. J., Mart&#237;n-Rodr&#237;guez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling.">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li><li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retire+statistical+significance.">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li></ol>

Ralstonia solanacearum يشكل تهديدا هاما للزراعة; ومع ذلك ، فإن تفاعلها مع المضيفين الطبيعيين ذوي الأهمية الزراعية لا يزال غير مفهوم جيد ًا مقارنة بمسببات الأمراض البكتيرية الأخرى ، خاصة في أنواع النباتات الزراعية. وفي معظم الحالات، يعوق الوقت والنفقات اللازمة لتعديل النباتات المضيفة وراثيا ا?...

Ralstonia solanacearum، العامل السببي لمرض الذبول البكتيري ، هو ممرض الأوعية الدموية المدمرة التي تنتقل عن طريق التربة مع توزيع عالمي يمكن أن تصيب مجموعة كبيرة من أنواع النباتات ، بما في ذلك البطاطا والطماطم والتبغ والموز والفلفل والباذنجان ، من بين أمور أخرى1،2. خسائر الغلة الناجمة عن Ralstonia يمكن أن تصل إلى 80-90٪ من الإنتاج في الطماطم والبطاطا أو الموز، اعتمادا على الأصناف والمناخ والتربة وغيرها من العوامل3. ومع ذلك ، فإن نموذج Ralstonia غير مستكشف إلى حد كبير بالمقارنة مع النماذج الأخرى التي تنطوي على مسببات الأمراض النباتية البكتيرية ، مثل Pseudomonas syringae أو Xanthomonas spp. بالإضافة إلى ذلك ، تركز معظم الدراسات في التفاعلات النباتية والميكروبات على نموذج النبات Arabidopsis thaliana. على الرغم من أن الأبحاث التي تستخدم هذه النماذج قد ساهمت إلى حد كبير في فهمنا للتفاعلات النباتية والبكتيريا ، إلا أنها لا تعالج الضرورة الحالية لفهم هذه التفاعلات في نباتات المحاصيل. البحوث التي تستهدف فهم التفاعل بين Ralstonia ونباتات المحاصيل أمر ضروري لتطوير حلول مستدامة لمكافحة مرض الذبول البكتيري ولكن يعوقها حاليا عدم وجود اختبارات تجريبية مباشرة لتوصيف المكونات المختلفة للتفاعل. على وجه الخصوص ، الطماطم ، مضيف طبيعي لRalstonia، هو ثاني أهم محصول نباتي في جميع أنحاء العالم ويتأثر بعدد كبير من الأمراض4، بما في ذلك مرض الذبول البكتيري. في هذا العمل، قمنا بتطوير طريقة سهلة لإجراء التحليل الجيني لعدوى رالستونيا من الطماطم. ويستند هذا الأسلوب على Agrobacterium rhizogenesبوساطة التحول من جذور الطماطم، وذلك باستخدام DsRed fluorescence كعلامة الاختيار5، تليها تطعيم Ralstonia التربة منقوع من النباتات الناتجة، التي تحتوي على جذور متحولة التعبير عن بناء الفائدة. براعة من تحليل تحويل الجذر يسمح أداء إما الإفراط في التعبير الجيني أو الجين إسكات بوساطة RNAi.
ويتمثل أحد القيود المحتملة لهذه الطريقة في النمو المتبقي للجذور غير المتحولة. هذا مهم بشكل خاص في الحالات التي يفتقر فيها البلازميد المستخدم إلى جين مراسل يسمح باختيار الجذور المتحولة. ولحل هذه المشكلة، قمنا بتطوير طريقة بديلة تعتمد على اختيار المضادات الحيوية، والتي تمنع نمو الجذور غير المتحولة مع السماح بنمو الجذور المتحولة المقاومة للمضادات الحيوية. نظرًا لأن A. rhizogenes لا تحفز على تحويل البراعم ، فهي عرضة للمضادات الحيوية ، وبالتالي ، يجب أن تبقى منفصلة عن الوسط المحتوي على المضادات الحيوية.
على الرغم من أن مقاومة النبات ضد Ralstonia ليست مفهومة جيدا، وقد ارتبطت العديد من التقارير تعديلات جدار الخلية لتعزيز المقاومة للذبول البكتيري6،,7،,8،,9. وقد اقترح أن هذه التعديلات جدار الخلية تؤثر على تطور الأوعية الدموية، وهو جانب أساسي لنمط حياة Ralstonia داخل النبات10. وقد ثبت الطفرات في الجينات ترميز synthases السليلوز CESA4، CESA7 وCESA8 في Arabidopsis thaliana لإضعاف سلامة جدار الخلية الثانوية ، مما تسبب في تعزيز المقاومة لRalstonia، والتي يبدو أن ترتبط ABA الإشارات8. لذلك ، كدليل على مفهوم طريقتنا ، قمنا بإجراء إسكات الجينات بوساطة RNAi من SlCESA6 (Solyc02g072240)، وهو خلية جدار ثانوي cellulosease ، وتقويم العظام من AtCESA8 (At4g18780). أظهرت التطعيمات اللاحقة التي تغمر التربة مع Ralstonia أن إسكات SlCESA6 عزز المقاومة لأعراض الذبول البكتيري ، مما يشير إلى أن المقاومة بوساطة جدار الخلية لRalstonia من المرجح أن يتم الحفاظ عليها في الطماطم ، والتحقق من صحة طريقتنا لإجراء التحليل الوراثي لمقاومة الذبول البكتيري في جذور الطماطم. هنا ، نصف هذه الطريقة بالتفصيل ، مما يتيح النهج الوراثية لفهم مرض الذبول البكتيري في وقت قصير نسبيًا ومع متطلبات صغيرة من المعدات ومساحة نمو النباتات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 mm square Petri-dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD (Becton and Dickinson)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985</td>
			<td>Berthold Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jiffy pots</td>
			<td>Jiffy Products International A.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (M519)</td>
			<td>Phytotechlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pindstrup substrate</td>
			<td>Pindstrup Mosebrug A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel and blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile clean bench</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahtman paper</td>
			<td>Wahtman International Ltd. Maldstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease

Ralstonia solanacearum هو التربة المدمرة التي تحملها مسببات الأمراض الوعائية التي يمكن أن تصيب مجموعة كبيرة من الأنواع النباتية، مما تسبب تهديدا هاما للزراعة. ومع ذلك ، فإن نموذج Ralstonia غير مستكشف إلى حد كبير بالمقارنة مع النماذج الأخرى التي تنطوي على مسببات الأمراض النباتية البكتيرية ، مثل Pseudomonas syringae في أرابيدوبسيس. البحوث التي تستهدف فهم التفاعل بين Ralstonia ونباتات المحاصيل أمر ضروري لتطوير حلول مستدامة لمكافحة مرض الذبول البكتيري ولكن يعوقها حاليا عدم وجود اختبارات تجريبية مباشرة لتوصيف المكونات المختلفة للتفاعل في النباتات المضيفة الأصلية. في هذا السيناريو، قمنا بتطوير طريقة لإجراء التحليل الجيني للعدوى Ralstonia من الطماطم، مضيف طبيعي من Ralstonia. وتستند هذه الطريقة على Agrobacterium rhizogenesبوساطة التحول من جذور الطماطم، تليها تطعيم Ralstonia التربة منقوع من النباتات الناتجة، التي تحتوي على جذور متحولة التعبير عن بناء الفائدة. براعة من تحليل تحويل الجذر يسمح أداء إما الإفراط في التعبير الجيني أو الجين إسكات بوساطة RNAi. كدليل على المفهوم، استخدمنا هذه الطريقة لإظهار أن إسكات RNAi بوساطة SlCESA6 في جذور الطماطم منح المقاومة لRalstonia. هنا ، نصف هذه الطريقة بالتفصيل ، مما يتيح النهج الوراثية لفهم مرض الذبول البكتيري في وقت قصير نسبيًا ومع متطلبات صغيرة من المعدات ومساحة نمو النباتات.

يوضح الشكل 5 تطور أعراض مرض نباتات الطماطم ذات الجذور التي تم تحويلها مع ناقل فارغ (EV) ، والنباتات ذات الجذور المحولة مع بناء RNAi يستهدف SlCESA6 (Solyc02g072240). يتم جمع بيانات مؤشر المرض(الشكل 5A)من نفس الوحدة التجريبية (كل نبات) مع م?...

Watch this Scientific Journal Video about Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease at JoVE.com

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

هنا ، نقدم طريقة متعددة الاستخدامات لتحويل جذر الطماطم تليها التطعيم مع Ralstonia solanacearum لإجراء تحليل وراثي مباشر لدراسة مرض الذبول البكتيري.

تحويل جذر الطماطم متبوعاً بالتلقيح مع Ralstonia Solanacearum للتحليل الوراثي المباشر لمرض الذبول البكتيري

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح للعلماء بإجراء تحليل وراثي مباشر لمرض الذبول البكتيري في الطماطم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التلاعب في التعبير الجيني والتشسابات اللاحقة يمكن أن يتم في وقت قصير ومع المتطلبات الصغيرة من المعدات ومساحة نمو النباتات. هذا هو الأسلوب هو تنوعا للغاية، ويمكن تطبيقه على النباتات المحاصيل الأخرى لإجراء كل من التطعيم الممرض وغيرها من المقايسات الفسيولوجية.للحفاظ على العقم أثناء التلاعب الشتلات في المختبر ، من المهم إبقاء لوحات مغلقة عندما تكون خارج غطاء محرك التدفق. هذه تقنية سهلة، ولكنها تتطلب خطوة متعددة للتلاعب. إن تصور هذه الطريقة سيساعد على رؤية الحيل الصغيرة التي يصعب شرحها في المخطوطة، مما يساعد الباحثين الآخرين على تنفيذ الطريقة في مختبراتهم.وسوف يساعد في إثبات هذا الإجراء آخن تشاو، وهو طالب دراسات عليا. بعد تعقيم وغسل بذور الطماطم، ونقلها إلى نصف قوة Murashige و Skoog المتوسطة دون السكروز. الحفاظ على البذور في الظلام في درجة حرارة تتراوح بين 25 و 28 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.ضع مرشحات ذات 8.5 سنتيمتر مربع داخل أطباق بيتري ذات تسعة سنتيمترات مربعة تحتوي على نصف قوة Murashige وSkoog المتوسط ، ووضع ست بذور طماطم مبتورة على كل لوحة. ختم لوحة مع الشريط Micropore، واحتضان البذور التي تمبت في 25 إلى 28 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. تنمو rh الروماتيزم MSU440 في صلبة LB المتوسطة مع المضادات الحيوية المناسبة لمدة يومين في 28 درجة مئوية قبل التحول النباتي.باستخدام مشرط معقمة، وقطع الشعاع والجزء السفلي من hypocotyl من شتلات الطماطم. استخدام نصائح من البلاستيك أو شفرة مشرط لحصاد A.rhizogenes الكتلة الحيوية من سطح المتوسط LB، وتراجع بعناية شتلات الطماطم قطع في الكتلة الحيوية البكتيرية. بعد ذلك، قم بتغطية شتلات الطماطم بورق نصف دائري طوله سنتيمترين في أربعة سنتيمترات من أجل الحفاظ على رطوبة عالية وتسهيل البقاء على قيد الحياة وتطوير الجذر الجديد.من المهم الحفاظ على الشتلات في رطوبة عالية في بيئة تسمح بالتحير. للقيام بذلك، تغطية الشتلات مع ورقة التصفية، وإغلاق لوحة مع الشريط Micropore. تخزين شتلات الطماطم المحولة لمدة ستة إلى سبعة أيام في غرفة النمو في درجة حرارة تتراوح بين 25 و 28 درجة مئوية.ثم استخدام مشرط عقيمة لقطع جذور جديدة جديدة شعر، والسماح للشتلات لإنتاج جذور جديدة شعر. مرة واحدة في الجيل الثاني من جذور جديدة شعر يظهر، وإزالة ورقة تصفية على رأس الشتلات، وختم لوحة مع الشريط Micropore مرة أخرى. لتصور DsRed fluorescence أو أي معدات أخرى للمصنع في التصوير في الجسم الحي، علامة على الجذور التحويلية الإيجابية، والتي يمكن تحديدها من قبل الفلوريسنسي الأحمر.استخدام مشرط لإزالة الجذور السلبية غير المحولة، والتي يمكن تحديدها من خلال عدم وجودها من الفلورا الحمراء. نقل الشتلات التي تظهر الفلوريسين الأحمر إلى لوحة جديدة تحتوي على نصف قوة Murashige وSkoog المتوسطة من أجل تسهيل تطوير الجذر المحولة باعتبارها الجذر الرئيسي. الحفاظ على الشتلات التي لا تظهر الفلوريسين الأحمر في نفس لوحة للتحقق من ظهور جذور الفلورسنت في نقاط زمنية لاحقة.غطي الشتلات بورق نصف دائرة طوله سنتيمترين في أربعة سنتيمترات، وختم الطبق، واحتضان الشتلات للسماح لها بتطوير جذور جديدة مشعرة. إعداد الأواني تلقيح حيث سيتم تعرض سطح الجذور إلى تلقيح بكتيرية عن طريق أولا نقع الأواني التطعيم بالماء، صب قبالة أي ماء الزائدة، ومن ثم وضعها في علبة زراعة بلاستيكية. باستخدام الملاقط، نقل الشتلات المختارة مع جذور محولة إلى الأواني التطعيم.غطي الصينية بلفاف بلاستيكي أو غطاء شفاف، واحفظها عند درجة حرارة 25 إلى 28 درجة مئوية مع رطوبة 65٪. إزالة الغطاء بعد خمسة أو ستة أيام. تنمو Ralstonia في خمسة LB المتوسطة السائلة في شاكر المدارية في 28 درجة مئوية، مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة، حتى المرحلة الثابتة.قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر لتحديد أعداد البكتيريا. تمييع الثقافة البكتيرية بالماء إلى OD600 من 1. مكان 16 إلى 20 وعاء التطعيم التي تحتوي على نباتات الطماطم المحولة إلى علبة تطعيم.ثم صب 300 ملليلتر من inoculum البكتيريا المخففة في علبة، والسماح للنباتات لنقع في inoculum لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، إعداد صينية جديدة مع طبقة من التربة بوتينغ. نقل الأواني المحقوطة في علبة جديدة، ووضع الصواني في غرفة النمو مع الرطوبة 75٪، ودرجة حرارة بين 26 و 28 درجة مئوية، وphotoperiod من 12 ساعة من الضوء و 12 ساعة من الظلام.هنا، يتم تحويل جذور الطماطم وتلقح مع Ralstonia لإجراء تحليل وراثي مباشر لدراسة مرض الذبول البكتيري. يتم تتبع تطور أعراض المرض في نباتات الطماطم مع جذور تحولت مع ناقل فارغ وتلك التي تحولت مع بناء RAI تستهدف الطماطم CESA6. يتم جمع بيانات مؤشر المرض من نفس الوحدة التجريبية مع مرور الوقت وفقًا لمقياس تعسفي من صفر إلى أربعة ولا تتبع توزيعًا غوسيًا ، مستبعدًا استخدام الاختبارات القياسية للبيانات البارامترية.والنهج القياسي، يتم استخدام U Mann-Whitney، اختبار غير قياسي ذو ذيلين لمقارنة منحنيات التحكم والعدوى. ووفقا لهذا التحليل، يبدو أن الفرق بين متوسطات المنحنيتين غير ذي شأن. ومن الممكن أيضاً تحديد المنطقة الواقعة تحت منحنى تقدم المرض، الذي يسمح بالجمع بين الملاحظات المتعددة لتقدم المرض في قيمة واحدة.المنطقة تحت منحنى تقدم المرض يظهر قيمة أعلى للنباتات التحكم بالمقارنة مع النباتات CESA6 الطماطم RNAi في نهاية عملية العدوى، مما يدل على أن النباتات CESA6 الطماطم صامتة هي أكثر مقاومة للعدوى رالستونيا من النباتات السيطرة. توفر فواصل الثقة طريقة لتقدير نطاق من القيم، مع احتمال كبير، حيث توجد قيمة المحتوى لمتغير معين. كما رأينا هنا، فإن منطقة الفاصل الزمني للثقة بنسبة 95٪ للتحكم ومنحنيات العدوى تقدر وجود فرصة أعلى للمقاومة عندما يتم إسكات CESA6.يمكن تحويل قيم مؤشر الأمراض إلى بيانات ثنائية، مع الأخذ في الاعتبار مؤشر المرض أقل من اثنين يقابل صفر ومؤشر المرض يساوي أو أعلى من اثنين يقابلان واحد. هذا يسمح بتمثيل منحنى البقاء على قيد الحياة بعد تلقيح Ralstonia. الاختلافات في معدل البقاء على قيد الحياة بين السيطرة والنباتات المصابة ليست ذات دلالة إحصائية وفقا للاختبار الإحصائي جيهان- بريسلو ويلكوكسيون.ثم يتم تحليل التعبير عن CESA6 في اثنين من الجذور المحولة المختارة عشوائيا قبل خطوة التطعيم، مما يدل على أن المقاومة المعززة لRalstonia يرتبط مع التعبير المخفض من CESA6. بعد جولتين من الاختيار، يمكن الحصول على معدل تحويل من 35 إلى 40٪، ويمكن زيادة هذه القيمة عن طريق إجراء جولات اختيار إضافية. أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على الشتلات مغطاة بقطعة من ورق التصفية للحفاظ على الرطوبة العالية وختم لوحات مع Micropore لضمان تبادل الغاز.بعد التحول الجذري ، يمكن تطبيق العديد من العلاجات لدراسة استجابة النبات عن طريق مراقبة فسيولوجيا الجذر أو استخدام البيولوجيا الجزيئية ، وبيولوجيا الخلايا ، أو الكيمياء الحيوية. بشكل رئيسي، سوف تسمح هذه التقنية للباحثين ذوي الموارد المحدودة بإجراء التحليل الجيني للعدوى البكتيرية في جذور الطماطم.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

الأمثل والتحليل المقارن لطرق التخصيب الحمض النووي النباتي أورغانيلار مناسبة للجيل القادم التسلسل

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

تحديد المواقع صبغية أمثل لعنصر الحمض النووي في الإشريكيّة القولونية باستخدام نهج ينقول بوساطة جديدة

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

استهدفت تسلسل الجيل القادم وأنابيب المعلوماتية الحيوية لتقييم المحددات الوراثية للمرض الدستورية

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

الجينات المرشح الاختبار في الدراسات الفوجية السريرية مع التنميط متعدد والطيف الكتلي

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

تسلسل أشباه الموصلات للاختبار الوراثي قبل الزرع للأنوبلويدي

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

رسم الخرائط الوراثية للاختلافات التسامح الحراري بين أنواع الخميرة Saccharomyces عن طريق تحليل الهيميزيغوستي على نطاق الجينوم المتبادل

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...